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Fattori correttivi e segnali di riconoscimento

Un sistema modello per la terapia enzimatica sostitutiva è nato da studi su fibroblasti cutanei in coltura derivati da pazienti con malattie da accumulo di mucopolisaccaridi (MPS). Tali fibroblasti mostravano un eccessivo accumulo di glicosaminoglicani, che veniva interpretato come dovuto a una degradazione inadeguata di queste macromolecole. Si scoprì serendipitosamente che una miscela di fibroblasti derivati da pazienti con MPS I (sindrome di Hurler) e MPS II (sindrome di Hunter) aveva un modello normale di metabolismo dei glicosaminoglicani (Figura 1). Le due malattie erano note per essere geneticamente distinte, MPS I essendo ereditato in modo autosomico recessivo e MPS II essendo un disturbo X-linked, portando Fratantoni et al. a ipotizzare che i fibroblasti di genotipi diversi sono stati fornendo l’altro con il prodotto del gene mancante. Ulteriori studi hanno dimostrato che non era necessario che le cellule geneticamente distinte fossero in contatto l’una con l’altra per tale correzione incrociata, poiché il mezzo condizionato da una poteva essere correttivo per l’altra. La strategia della correzione incrociata potrebbe essere estesa a malattie correlate – le cellule che si correggono a vicenda avrebbero un genotipo diverso, mentre le cellule che non si correggono incrociate avrebbero lo stesso genotipo (ma vedi l’importante eccezione qui sotto).

Poiché la sindrome di Hurler era stata postulata come una malattia da accumulo lisosomiale basata sull’osservazione dei lisosomi epatici drammaticamente gonfiati nei pazienti affetti, Fratantoni et al. ipotizzarono che i ‘fattori correttivi’ nel mezzo condizionato potessero essere enzimi lisosomiali secreti da una linea cellulare ed endocitati dall’altra. Tuttavia, i fattori correttivi non corrispondevano a nessun enzima lisosomiale conosciuto all’epoca (questa situazione cambiò un paio di anni dopo, quando fu scoperta una β-glucuronidasi carente MPS). La purificazione dei fattori correttivi Hurler e Hunter fu intrapresa, non dal mezzo condizionato ma dall’urina, un fluido corporeo relativamente ricco di enzimi lisosomiali. La funzione è stata assegnata ai fattori purificati utilizzando una varietà di metodi biochimici, con il risultato che i fattori correttivi Hurler e Hunter sono stati denominati rispettivamente α-l-iduronidasi e iduronato solfatasi.

Le cellule che hanno richiesto il fattore correttivo Hurler per normalizzare il loro metabolismo dei glicosaminoglicani (da pazienti con sindrome di Hurler e con sindrome di Scheie) erano anche carenti di attività α-l-iduronidasi.) La correzione dei fibroblasti Hurler è stata accompagnata dall’assorbimento di α-l-iduronidasi. Come buon auspicio per la terapia enzimatica sostitutiva, l’assorbimento era notevolmente efficiente e solo una quantità molto piccola di α-l-iduronidasi doveva essere internalizzata per fornire una correzione completa.

Questa potrebbe essere la fine della storia, se non fosse per una piccola discrepanza nel modello di eluizione dell’attività enzimatica e l’attività correttiva da una colonna di idrossiapatite, suggerendo che le due attività del fattore correttivo Hurler non erano esattamente identiche. In seguito a questa discrepanza, Shapiro et al. separarono l’α-l-iduronidasi in frazioni correttive e non correttive su una colonna di eparina-Sepharose, indicando che il fattore correttivo aveva qualche caratteristica che non era necessaria per l’attività catalitica ma era necessaria per l’assorbimento. Allo stesso modo, sono state trovate forme multiple di β-glucuronidasi, che differiscono nell’assorbimento e nell’attività correttiva.

L’esistenza di un segnale specifico per l’assorbimento di un enzima lisosomiale era stata suggerita dai risultati di uno studio su una malattia appena scoperta che assomigliava alla MPS – chiamata malattia delle cellule di inclusione (I-cell disease) a causa delle prominenti inclusioni dense di fase nei fibroblasti coltivati. Mentre questi fibroblasti avevano carenze multiple di enzimi lisosomiali, il mezzo che li circondava conteneva un grande eccesso di enzimi lisosomiali. Tuttavia, gli enzimi secreti dai fibroblasti della malattia I-cellulare non erano endocitati da altre cellule e non erano correttivi; presumibilmente, mancavano del segnale per l’assorbimento nei lisosomi. Poiché un certo numero di enzimi lisosomiali erano interessati da questo difetto di un singolo gene (la malattia a cellule I è ereditata in modo autosomico recessivo), il segnale è stato postulato per essere una modifica post-traslazionale delle proteine dell’enzima. È stato inoltre postulato essere un carboidrato in natura, in quanto potrebbe essere distrutto da un leggero trattamento con periodato. Il concetto di un sistema di riconoscimento basato sui carboidrati fu fortemente influenzato dalle scoperte di Ashwell e colleghi riguardo al ruolo dei carboidrati nell’assorbimento delle glicoproteine circolanti da parte del fegato.

La presenza di un segnale specifico riconoscibile implicava un processo saturabile, mediato dal recettore, e suggeriva che l’assorbimento degli enzimi lisosomiali avrebbe seguito la cinetica di Michaelis-Menten. Ci si aspettava che gli analoghi dei segnali di riconoscimento si comportassero come inibitori competitivi dell’assorbimento. Questa aspettativa è stata studiata attraverso l’assorbimento di α-l-iduronidasi e di β-glucuronidasi da parte dei corrispondenti fibroblasti carenti. La scoperta di Kaplan et al. che il miglior inibitore dell’assorbimento della β-glucuronidasi era il mannosio-6-fosfato (M6P), e il loro suggerimento che M6P era (o era parte di) il segnale di riconoscimento a lungo ricercato, è stato sorprendente, poiché nessun carboidrato fosforilato era stato precedentemente riportato per esistere sulle glicoproteine dei mammiferi. È stato immediatamente confermato per l’assorbimento di α-l-iduronidasi e altri enzimi lisosomiali, utilizzando una varietà di metodi biochimici; la prova definitiva è venuta dall’analisi strutturale dei gruppi di carboidrati fosforilati. Il segnale scoperto attraverso l’endocitosi ha dimostrato di essere anche il segnale per indirizzare le idrolasi nascenti ai lisosomi.

Il difetto della malattia delle cellule I, che impedisce alle cellule di sintetizzare il segnale di riconoscimento M6P, è stato dimostrato essere una carenza del primo dei due enzimi coinvolti nella sintesi del segnale M6P. Sono stati scoperti due recettori per M6P; la chimica e la biologia dei recettori M6P e il loro ruolo nel traffico cellulare sono diventati un campo ampio e molto attivo della biologia cellulare. Questi argomenti sono i soggetti di molte recensioni, compresi i capitoli 3 e 5 di questo volume. L’importanza del sistema M6P per la terapia enzimatica sostitutiva sarà discussa più avanti.

Concorrente con questi studi nei fibroblasti in coltura, un sistema in-vivo ha portato alla scoperta di un altro segnale per l’assorbimento degli enzimi lisosomiali. Diversi enzimi lisosomiali, iniettati per via endovenosa nei ratti, sono risultati essere rapidamente eliminati dalla circolazione; tuttavia, persistevano molto più a lungo se pretrattati con periodato o se coiniettati con una agalattoglicoproteina. Ancora una volta, i carboidrati sono stati postulati per fornire segnali per il riconoscimento specifico. In questo caso, lo zucchero chiave per il riconoscimento era il mannosio, e l’assorbimento era nelle cellule reticoloendoteliali del fegato. Il recettore del mannosio, che riconosce la N-acetilglucosamina e l-fucosio così come il mannosio, ha dimostrato di verificarsi sulla superficie dei macrofagi. È di un certo interesse storico che gli esperimenti di assorbimento dell’invertasi, che figuravano in primo piano nella proposta originale della terapia enzimatica sostitutiva (vedi sopra), ebbero successo perché l’invertasi è una glicoproteina con catene di mannano che sono riconosciute dal recettore del mannosio.