La centrifugazione differenziale è un metodo usato per separare i diversi componenti di una cellula in base alla massa. La membrana cellulare viene prima rotta per liberare i componenti della cellula utilizzando un omogeneizzatore. La miscela risultante viene chiamata omogeneizzato. L’omogeneizzato viene centrifugato per ottenere un pellet contenente gli organelli più densi. I composti più densi formeranno un pellet a basse velocità di centrifuga, mentre i composti meno densi rimarranno probabilmente nel surnatante liquido sopra il pellet. Ogni volta, il surnatante può essere centrifugato a velocità più elevate per ottenere gli organelli meno densi. Eseguire la centrifugazione in modo graduale, in cui la velocità di centrifugazione viene aumentata ogni volta, permette ai componenti di essere separati per massa. Il nucleo piuttosto denso è il più probabile dopo la prima centrifugazione, seguito dai mitocondri, poi dagli organelli più piccoli e infine dal citoplasma, che può contenere proteine solubili.
La sedimentazione equilibrata usa un gradiente di una soluzione per separare le particelle in base alla loro densità individuale (massa/volume). Un aspetto fondamentale di questo tipo di sedimentazione è che è completamente indipendente dalla forma della molecola. Viene usata per purificare la centrifugazione differenziale. Si prepara una soluzione con la porzione più densa del gradiente sul fondo. Le particelle da separare vengono poi aggiunte al gradiente e centrifugate. Ogni particella procede fino a raggiungere un ambiente di densità comparabile. Un tale gradiente di densità può essere continuo o preparato in modo incrementale. Per esempio, quando si usa il saccarosio per preparare gradienti di densità, si può far galleggiare con cura una soluzione di saccarosio al 40% su uno strato di saccarosio al 45% e aggiungere ulteriori strati meno densi al di sopra. L’omogeneizzato, preparato in un tampone diluito e centrifugato brevemente per rimuovere il tessuto e le cellule non rotte, viene poi stratificato sopra. Dopo la centrifugazione in genere per un’ora a circa 100.000 x g, si possono osservare dischi di componenti cellulari che risiedono a causa del cambiamento di densità da uno strato al successivo. Regolando accuratamente le densità degli strati in base al tipo di cellula, è possibile arricchire componenti cellulari specifici.
L’equilibrio di sedimentazione è abbastanza utile perché non si forma un pellet. La velocità di rotazione crea abbastanza forza per far uscire la proteina dal rotore, ma non la condensa in un pellet. Questo perché si produce un gradiente nella concentrazione della proteina. La diffusione reagisce per contrastare la creazione del gradiente e, dopo un certo tempo, si raggiunge un perfetto equilibrio tra sedimentazione e diffusione.
L’equilibrio di sedimentazione è anche pratico per studiare le interazioni tra le proteine. In particolare è utilizzato per accertare lo stato nativo o conformazione nativa della proteina. Lo stato nativo ci dice la struttura esatta in tre dimensioni. Questa informazione include se si tratta di un monomero, dimero, trimero, tetramero, ecc. Un monomero è una proteina composta da una sola subunità. Un dimero è costituito da due subunità proteiche ruotate di 180 gradi. Un trimero è costituito da tre subunità, ecc. Questo tipo di sperimentazione ci permette anche di determinare se le proteine possono formare oligomeri (catene polipeptidiche identiche che formano due o più unità di una proteina). Inoltre, l’uso dell’equilibrio di sedimentazione è che determina le costanti di equilibrio per le interazioni proteina-proteina e proteina-ligando. Il valore di questo Kd è spesso compreso tra 1nM-1mM. Questo viene calcolato misurando la costante di equilibrio (Kd). Un ultimo utilizzo è quello di determinare i rapporti stechiometrici tra i complessi proteici. Un esempio di questo è un ligando e il suo recettore o una coppia antigene-anticorpo
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