Biochemical and Pathogenic Properties ofShewanella alga and Shewanella putrefaciens

RESULTS

La biotipizzazione degli isolati di Shewanella secondo due schemi separati ha fornito risultati simili (Tabella1). La maggior parte degli isolati clinici (74%) apparteneva alla biovariante 2 di Gilardi (biotipo 2 di CDC), essendo negativi al saccarosio e al maltosio mentre crescevano su agar SS e su terreni contenenti alte concentrazioni di NaCl. L’unica differenza importante notata tra lo schema di classificazione di Gilardi (6) e quello di Weyant et al. (22) era che gli isolati della biovariante 3 (saccarosio, maltosio, SS e NaCl negativi) non erano raggruppati dal sistema di biotipizzazione CDC. In contrasto con gli isolati umani, la biovariante 1 (biotipo CDC 1) ha predominato (67%) tra i ceppi non umani. Questi ceppi producevano tipicamente acido da maltosio e/o saccarosio e non riuscivano a crescere su agar ad alto contenuto di sale o SS. In base alle recenti proposte tassonomiche di Nozue e altri (15), i ceppi della biovariante 2 (CDC biotipo 2) sarebbero stati identificati come S. alga mentre tutti i ceppi della biovariante 1 (CDC biotipo 1) e 6 dei 7 ceppi della biovariante 3 sarebbero stati designati come S. putrefaciens; il restante ceppo della biovariante 3 fu successivamente identificato come S. alga. Clinicamente, S. alga è risultato predominante (77%), mentre la maggior parte degli isolati non umani (89%) è stata confermata essere S. putrefaciens (Tabella 1).

Tutti i 10 isolati di Shewanella, quando testati sui sistemi API 20E, API NFT, RapID NF Plus e Vitek, sono stati identificati come S. putrefaciens, con un’eccezione. Quattro dei cinque isolati di S. putrefaciens hanno prodotto numeri di profilo inaccettabili sul sistema API 20E (n. 0602026 e 0602006); il quinto ceppo ha generato un numero di biotipo raro per S. putrefaciens. Tutti i ceppi di S. alga hanno dato un’eccellente identificazione come S. putrefaciens sull’API 20E. Il sistema API NFT ha identificato tutti i 10 isolati di Shewanella come S. putrefaciens con identificazioni da buone a eccellenti, con una sola eccezione, anch’essa un ceppo di S. putrefaciens (valore discriminatorio basso, 48 h). RapID NF Plus ha identificato tutti i 10 isolati di Shewanella come S. putrefaciens, con una precisione del 99,9%. Allo stesso modo, tutti i ceppi sono stati identificati da Vitek (dal 97 al 99% di precisione) come S. putrefaciens, anche se tre ceppi S. putrefaciens hanno richiesto da 5 a 9 ore di incubazione prima dell’identificazione finale, in contrasto con i risultati di 4 ore per gli altri 7 ceppi. Le reazioni dei carboidrati (arabinosio e maltosio) sui sistemi API 20E, API NFT e Vitek, tuttavia, consentono alla maggior parte dei ceppi di essere correttamente assegnati ai taxa pertinenti (S. putrefaciens e S. alga) se letti manualmente dopo le identificazioni finali come S. putrefaciens.

Il confronto delle proprietà biochimiche ed enzimatiche delle specie di Shewanella ha rivelato una serie di differenze (Tabella 2). L’emolisi su agar sangue di pecora, come riportato da Nozue et al. (15), è stata rilevata in tutti i ceppi di S. alga ma solo in un paio di isolati di S. putrefaciens. La maggior parte dei ceppi di S. alga ha mostrato questo fenotipo solo dopo un’incubazione prolungata (da 48 a 72 ore), e l’area di emolisi era spesso irregolare e difficile da individuare. Altre attività precedentemente trovate per aiutare la separazione di S. alga e S. putrefaciens, come la crescita a 42°C, la crescita su terreni contenenti alte concentrazioni di sale (6,5%) e la produzione di acido da l-arabinosio, saccarosio e maltosio, sono state confermate. Abbiamo trovato un numero sostanzialmente maggiore di ceppi di S. putrefaciens che crescevano su agar SS rispetto a quanto riportato in precedenza; la maggior parte di questi proveniva da fonti non umane. Con l’eccezione del ribosio, la produzione di acido dall’ossidazione dei carboidrati era unicamente associata a S. putrefaciens. I modelli dello zucchero, tuttavia, variavano considerevolmente fra questi isolati, con alcuni che erano arabinosio, maltosio e saccarosio positivi mentre altri erano positivi solo per il maltosio o erano asaccarolitici (ceppi biovar 3). Diverse nuove attività enzimatiche sono state rilevate tra isolati selezionati di Shewanella che, a nostra conoscenza, non sono state segnalate in precedenza. Queste includevano attività di tirosinasi, alchilsolfatasi, chitinasi ed elastasi (Tabella 2); la maggior parte di questi enzimi sono stati trovati in isolati non umani di S. putrefaciens. La maggior parte dei ceppi di S. alga e S. putrefaciens ha prodotto un sideroforo, come determinato dai saggi Chrome Azurol S. Questa attività era debole, e cinque isolati (tre di S. alga e due di S. putrefaciens) non sono riusciti a crescere su questo mezzo.

Selezionati isolati di Shewanella che crescevano bene a 35°C sono stati ulteriormente caratterizzati per l’attività enzimatica utilizzando API-ZYM (Tabella 3) e per i profili degli acidi grassi cellulari con il sistema MIDI. Dei nove substrati attaccati da una o entrambe le specie di Shewanella con API-ZYM, attività complessive più elevate per sette di questi enzimi sono state associate all’alga S. La singola attività trovata più forte in S. putrefaciens era la valina arilamidasi, sebbene questa attività fosse estremamente debole anche in questi ceppi. Entrambe le specie producevano uniformemente una forte attività di fosfatasi alcalina. Un’ulteriore osservazione è che tutti i ceppi di S. alga producevano costantemente otto di questi nove enzimi, l’unica eccezione era la valina arilamidasi. Al contrario, S. putrefaciens era più eterogeneo, con quattro dei nove enzimi rilevati che non erano universalmente presenti in tutti gli isolati. L’analisi di 14 ceppi di Shewanella ha indicato che gli acidi grassi predominanti erano i-15:0, 17:1ω8c, e 16:0; alcuni ceppi hanno prodotto grandi quantità di 16:1ω7c (dal 9 al 18%), mentre altri hanno prodotto quantità trascurabili. Mentre la maggior parte dei picchi di acidi grassi erano abbastanza coerente tra S. alga e S. putrefaciens ceppi testati, diverse differenze sono state notate (Table4). Più alti valori medi di acido pentadecanoico e cis-9-heptadecenoic acido (17: 1ω8c) sono stati notati per S. alga, mentre l’inverso tenuto vero per S. putrefaciens per quanto riguarda esadecanoico e dodecanoico acidi. Per l’acido esadecanoico, non è stata osservata alcuna sovrapposizione nella gamma di acidi grassi totali tra S. alga e S. putrefaciens; per l’acido pentadecanoico e 17:1ω8c, solo un isolato S. putrefaciens o S. alga ha prodotto un valore che rientrava nella gamma dell’altro. Mentre nessun singolo picco era diagnostico, l’uso di tutti e quattro i picchi insieme separava chiaramente i 14 ceppi di Shewanella in due gruppi lungo le linee di specie.

Si è scoperto che i 23 ceppi di S. putrefaciens potevano essere suddivisi in tre gruppi separati sulla base di diverse caratteristiche fenotipiche (Tabella 5). Il gruppo 1, composto da otto ceppi, tra cui ATCC 8073, produceva acido da maltosio, saccarosio e arabinosio e utilizzava acido urocanico. I ceppi del gruppo 1 erano equamente divisi tra isolati clinici e non umani. I ceppi del gruppo 2 (n = 6), che includevano ATCC 8071, si distinguevano principalmente dai ceppi del gruppo 1 per l’incapacità di ossidare saccarosio e maltosio. Anche in questo caso, la metà di questi ceppi proveniva da materiale clinico. I ceppi del gruppo 3 (n = 9), tutti di origine ambientale (zona del lago Michigan), differivano drammaticamente dai gruppi 1 e 2. Crescevano male o non crescevano a 35°C, producevano chitinasi ed erano non pigmentati su agar di triptofano. Tutti i nove ceppi del gruppo 3 inizialmente producevano α-glucosidasi, ma dopo un nuovo test solo tre ceppi erano costantemente positivi. Il maltosio è stato ossidato, ma non il saccarosio o l’arabinosio. A differenza dei gruppi 1 e 2, l’acido urocanico non è stato utilizzato come fonte di energia.

Di recente, Vogel e colleghi (21) hanno notato differenze tra S. alga e S. putrefaciens nella loro suscettibilità ad alcuni agenti antimicrobici, tra cui penicillina, ampicillina e tetraciclina. Questo, insieme al rapporto che collega l’attività emolitica con S. alga e la sua apparente associazione con la malattia umana, suggerisce possibili differenze nella patogenicità tra queste due specie (Tabella6). Abbiamo quindi selezionato 10 ceppi (5 per ogni specie) per ulteriori analisi. Anche se non abbiamo notato grandi differenze nella suscettibilità a penicillina, ampicillina e tetraciclina tra questi due gruppi in base alla categoria di suscettibilità (suscettibile, intermedio o resistente), abbiamo notato che le MIC medie per S. alga di penicillina, ampicillina e tetraciclina (∼200, 56 e 5.2 μg/ml, rispettivamente) erano maggiori delle MIC corrispondenti per S. putrefaciens (3, 1.3, e 1.1 μg/ml, rispettivamente).

Quattro dei cinque ceppi di S. putrefaciens si sono attaccati da debolmente (+) a fortemente (+++) (Tabella 6) alle cellule HEp-2 nei saggi di aderenza; al contrario, nessun ceppo di S. alga ha mostrato caratteristiche adesive simili, anche se quattro ceppi si sono legati fortemente al fondo del vetrino. Le attività invasive non sono state rilevate in nessun ceppo di Shewanella. Sebbene sia stata osservata una reazione emolitica ritardata su agar sangue di pecora per tutti e cinque i ceppi di S. alga (Tabella 2), la beta-emolisi non è stata rilevata con la tecnica di sovrapposizione dell’agar o con i saggi in brodo (Tabella 6); i ceppi di controllo E. tarda erano positivi in 1 ora in entrambi i test. Per tutti e cinque i ceppi di S. alga (e un isolato di S. putrefaciens), una debole reazione citotossica è stata talvolta osservata durante gli studi di adesione e invasione. Questa reazione citotossica si è manifestata con la comparsa di cellule HEp-2 con morfologia cellulare anormale, compresi i detriti cellulari (fantasmi). Le differenze nella patogenicità del topo tra queste due specie sono state trovate, tuttavia, come la media LD50 in topi Webster svizzeri per S. algawas 1,9 × 108 CFU, mentre quella per S. putrefaciens era 8,4 × 108 CFU (P < 0,02).