Base clinica, genetica e strutturale dell’apparente eccesso di mineralocorticoidi dovuto al deficit di 11β-idrossisteroide deidrogenasi di tipo 2

Risultati

Segnaliamo i dati demografici e il fenotipo clinico di 36 pazienti AME geneticamente confermati dal Consorzio Internazionale dei Disturbi Rari degli Steroidi. La maggior parte dei pazienti erano di origine omanita (22 su 36) e persiana (6 su 36), con il 75% derivante da matrimoni consanguinei, principalmente in Oman (Fig. 1B e Tabella S1). L’età mediana della diagnosi di AME era di 4,6 anni (range: 0,1-15) e la coorte era distribuita equamente per entrambi i sessi. La maggior parte dei pazienti (86%) è nata a termine e il 76% è nato piccolo per l’età gestazionale. La Fig. 1A mostra che, nella nostra coorte, c’erano sei mutazioni missenso, una inserzione, due delezioni e tre frameshift, e due indel. Atteso dalla fisiopatologia di AME, la pressione arteriosa media presente era elevata sopra il 90 ° percentile per tutti i soggetti (Fig. 1C). Il livello medio di potassio sierico alla diagnosi era basso a 2,72 mmol/L (range: 1,5-4,1 mmol/L), mentre il bicarbonato sierico era alto a 29,5 mmol/L (range: 20-38 mmol/L) (Fig. 1 D e E). I livelli sierici di aldosterone erano prevedibilmente bassi (Fig. 1F), con due pazienti con livelli elevati per motivi non chiari. Inoltre, i livelli di renina erano bassi, ad eccezione di due pazienti (10,4 e 14 ng/mL/h) che erano in terapia (Tabella S1). In un sottogruppo di 29 pazienti, il rapporto medio (THF + alloTHF)/THE, che rappresenta i principali metaboliti urinari di cortisolo e cortisone, era significativamente elevato a 19 (range: 3-55, normale: 1,0) (Fig. 1G). Da notare che 27 dei 36 (75%) pazienti presentavano anche una nefrocalcinosi. La nefrocalcinosi può derivare da ipokaliemia cronica di lunga durata come notato, per esempio, nella sindrome di Bartter tipo III (14).

Per capire se il fenotipo clinico di carenza HSD11B2 potrebbe essere previsto esaminando i cambiamenti nella struttura dell’enzima indotta da una data mutazione HSD11B2, abbiamo eseguito in silico analisi utilizzando tre estrogenici HSD17B1 che ha esposto una somiglianza di sequenza 27% con HSD11B2 oltre 284 aminoacidi (Fig. S1A). Il modello umano HSD11B2 ha esibito un caratteristico motivo conservato NAD-binding Rossmann fold (Fig. S1B) con un sito adiacente di legame al substrato (Fig. S1 C e D). Le simulazioni MD 500-ns delle forme monomeriche e dimeriche di HSD11B2 hanno indicato un modello stabile con una proteina piegata in modo stabile (Fig. S1 E-H). Abbiamo usato il software Internal Coordinate Modeling (ICM) (www.molsoft.com) (18) per determinare ΔΔG di mutazioni missenso trovato in pazienti AME o mutazioni sperimentalmente ingegnerizzato. Tutte le mutazioni (Fig. 2A) hanno mostrato un aumento dei valori ΔΔG, suggerendo la perdita di stabilità e funzione della proteina (Fig. 2B).

HSD11B2 esiste come omodimero nel suo stato inattivo (13). Quattro residui, ovvero R186, E190, A237 e R336, si trovano all’interfaccia del dimero e potrebbero quindi interferire con la formazione del dimero (Fig. 2C). I residui R186 e E190 sono posizionati all’interfaccia del dimero sull’elica α4. Un’interazione ionica intersubunitaria (R186-E190) si forma come risultato della doppia simmetria invertita della subunità adiacente (Fig. 2D), simile alla coppia ionica R112-E120 in HSD17B1 (15⇓-17). Soprattutto, questa interazione è risultato essere stabile, ed è stato mantenuto nel corso di 500-ns simulazioni MD (Fig. 2 E-G). Inoltre, l’interazione è stata trovata per stabilizzare l’elica α4 e mantiene la flessibilità intorno al sito di legame del coenzima. Così, la mutazione R186C provoca la perdita della coppia di ioni intersubunità e spinge l’equilibrio verso la formazione di un enzima attivo monomerico (Fig. 2H). Impedisce anche la formazione dell’interazione ione-coppia intraelica e quindi permette la destabilizzazione degli elementi strutturali intorno al sito di legame del coenzima.

Ci sono diverse altre mutazioni dirompenti a questa interfaccia dimerica che coinvolgono i residui A237, D244, L251, e D176. Il residuo A237 è circondato da L241 e V239 da entrambe le subunità HSD11B2. La sua mutazione in Val aumenta l’idrofobicità di questo gruppo e rafforza lo stato dimerico inattivo dell’enzima (Fig. 2I). Il residuo D244 non solo crea un ponte salino intrasubunitario con R336 che tiene insieme l’elica α5 e i fogli β7, ma anche interazioni di legame a idrogeno con R360 della subunità adiacente (Fig. 2J). La sua mutazione in Asn diminuisce la forza dell’interazione R360, portando alla perdita del ponte salino con R366; questo, a sua volta, compromette la stabilità della proteina. Allo stesso modo, la mutazione di una catena laterale idrofoba L251 al gruppo idrossile di Ser aumenta la polarità e forma un legame a idrogeno con i gruppi della catena laterale caricati positivamente di R361; questo migliora il legame del dimero (Fig. 2K). Infine, la mutazione di D176 in Asn crea un legame a idrogeno tra l’asparagina e T200, migliorando così lo stato inattivo del dimero (Fig. 2L).

Mutazioni dei residui di HSD11B2 che formano la tasca di legame del substrato o del coenzima (NAD+) hanno dimostrato in studi in vitro di eliminare l’attività dell’enzima (19) e causare gravi AME. Per esempio, Y226 si trova nella tasca di legame del substrato (Fig. 3A). La catena laterale fenolica aromatica forma interazioni idrofobiche con l’anello aromatico del substrato. La mutazione Y226N sostituisce questo residuo con un residuo non aromatico, con la conseguente perdita di stacking idrofobico, che interferisce con il legame del substrato (Fig. 3A). Inoltre, questa mutazione cambia la catena laterale da idrofoba a idrofila, che è sfavorevole per il legame di un substrato idrofobico. La mutazione A221V sostituisce la catena laterale corta con una catena laterale leggermente più voluminosa di Val, interferendo così con il legame del substrato riducendo il volume della tasca, mentre la mutazione A221G diminuisce l’idrofobicità e introduce la flessibilità intorno alla tasca rigida di legame (Fig. 3B).

Il nostro modello mostra che il gruppo polare 17-OH nel cortisolo è nascosto in una regione idrofoba circondata da Y226, P227 e L229. Questo gruppo idrossile è assente nel corticosterone, il che si traduce in interazioni idrofobiche potenziate e in un’affinità di legame all’HSD11B2 10 volte superiore rispetto al cortisolo (Fig. S2A). Oltre che nel rene, HSD11B2 è espresso anche nella placenta. Anche se il recettore dei mineralocorticoidi non è espresso in questo tessuto, HSD11B2 inattiva il cortisolo per eliminare i suoi effetti inibitori della crescita e proapoptotici durante lo sviluppo embrionale. Durante la gravidanza, l’alto livello di progesterone nella circolazione materna può legarsi e modulare l’attività di HSD11B2. Questo può tradursi in effetti di qualsiasi mutazione loss-of-function che interrompe il legame con il progesterone sul peso alla nascita. Per esempio, la mutazione A221V colpisce gravemente il legame del progesterone più di cortisolo a causa degli scontri sterici tra Val e i gruppi metilici sporgenti in progesterone (Fig. S2B). Molto interessante, troviamo che i due pazienti con le mutazioni A221V erano piccoli per l’età gestazionale (Tabella S1). Allo stesso modo, la mutazione A221G influenza il legame del progesterone indirettamente alterando la struttura del sito di legame. Allo stesso modo, la mutazione Y226N è più dannosa per il legame del progesterone in quanto riduce le interazioni idrofobiche tra lo scheletro del progesterone e l’anello idrossifenile della tirosina (Fig. S2B). Al contrario, P227 fornisce un supporto strutturale indiretto al sito di legame, e la mutazione a Leu ha effetti simili sia per il cortisolo che per il progesterone (Fig. S2B).

Ci sono quattro mutazioni che risiedono nel sito di legame del coenzima e lo interrompono, compromettendo così gravemente l’attività di HSD11B2. La catena laterale del residuo L179 è normalmente posizionata spazialmente in un breve giro tra il foglio β4 e l’elica α4 (Fig. 3C). Permettendo interazioni con le catene laterali idrofobiche di V174 e L282, queste interazioni rendono il sito di legame del coenzima più flessibile. La mutazione ad Arg introduce una catena laterale di guanidinio, che permette le interazioni con la catena laterale del gruppo carbossilico di E172 e la catena laterale del gruppo idrossilico di T184 (Fig. 3C), introducendo così rigidità al giro e diminuendo la flessibilità richiesta per la funzione ottimale dell’enzima (7). Situato nella tasca di legame del coenzima, Y232 è un residuo altamente conservato nel motivo del Rossmann fold (20), suggerendo che la sua mutazione sarà dannosa per l’attività dell’enzima (21). La catena laterale idrossil-fenilica di Y232 forma importanti legami idrogeno con N171 e NAD+, tenendo il coenzima in posizione corretta per la sua funzione catalitica (Fig. 3D). Questa interazione è interrotta nella mutazione Y232C che causa una grave AME. L’importanza di questo residuo nell’attività dell’enzima è stata confermata indipendentemente da diverse mutazioni ingegnerizzate (21) (Fig. 3D). Nella mutazione G89D, la catena laterale carbossilica di Asp mostra gravi scontri sterici con la frazione di zucchero ribosio dell’adenosina, che influenza il legame del NAD+ (Fig. 3E). Un’altra mutazione ingegnerizzata K236R porta all’interruzione del legame del NAD (Fig. 3F). Pur mantenendo la capacità di interagire con il NAD+ attraverso il legame a idrogeno, la mutazione abolisce l’attività dell’enzima (21).

Impedimenti nella stabilità strutturale di HSD11B2 interrompono la sua struttura terziaria, causando una marcata attenuazione dell’attività enzimatica e una grave AME. Il residuo L250 è posizionato nell’elica α5, e le sue catene laterali si trovano in una stretta tasca idrofobica circondata dalle catene laterali di L204, F246, W253, V255 e V257 (Fig. 4A). I residui della tasca idrofobica sono bloccati da un’interazione ione-coppia tra R208 e E249. L’introduzione di una catena laterale Pro rompe l’elica α5 introducendo rigidità. Questa tasca è anche troppo stretta per ospitare la grande e ingombrante catena laterale di guanidinio di Arg (Fig. 4A). Una conseguente perdita di idrofobicità in questa regione influenza la stabilità strutturale. Un’altra stabile interazione intraelica ione-coppia si forma tra D144 e R147 (Fig. 4B). Questa interazione permette all’elica α3 di impacchettare strettamente con i fogli β adiacenti vicino al sito di legame del NAD+. La mutazione D144V provoca la perdita di questa interazione e destabilizza la disposizione di imballaggio (Fig. 4B). L’impacchettamento idrofobico è anche interrotto nella mutazione F185S, quando la catena laterale aromatica della fenilalanina, circondata dai residui idrofobici di V182, C188, e M189, è sostituita da una catena laterale polare di serina (Fig. 4C). Allo stesso modo, la catena laterale idrofoba di L363, circondata da M347, I350, e F362, è posizionata in un’elica-turn-helix (Fig. 4D). La mutazione L363P interrompe l’elica e l’ambiente strutturale locale.

Inoltre, diverse mutazioni possono interrompere l’impacchettamento della proteina HSD11B2 per compromettere la stabilità attraverso l’introduzione di un residuo più ingombrante. Il residuo A328 forma un’interazione idrofobica con V215, I260, I325 e Y338 (Fig. 4E). Sostituendo l’alanina con un residuo Val più ingombrante, la mutazione A328V causa scontri sterici con la catena laterale di I260 e Y338 dai fogli β circostanti (Fig. 4E). Il residuo S180 è posizionato su un loop e la sua catena laterale del gruppo idrossile interagisce con la catena laterale e l’azoto della spina dorsale di T184 (Fig. 4F). Questa catena laterale si trova all’interno di uno spazio molto ristretto e limita l’alloggio di qualsiasi residuo più voluminoso, che causa scontri sterici, infatti, senza alterare la struttura della proteina. Così, una catena laterale Phe con un anello aromatico voluminoso, come nella mutazione S180F, non è tollerata in questa posizione (Fig. 4F).

I legami idrogeno multipli e i ponti di sale tra i residui polari stabilizzano la struttura terziaria dell’enzima HSD11B2. Alcune mutazioni causano una perdita di queste interazioni, con conseguente enzima inattivo e grave AME. Per esempio, il ponte salino tra R208 e E249 è critico (Fig. 4G). La sua perdita, come nel caso delle mutazioni R208C e R208H, destabilizza la proteina e provoca una grave malattia (Fig. 4G). Allo stesso modo, D223 forma un ponte salino con R337 (Fig. 4H). Sostituendo questo ponte salino con un legame meno forte, un legame a idrogeno, la mutazione D223N cambia il residuo caricato negativamente in un residuo polare non caricato con conseguente marcata attenuazione dell’attività in vitro (22). Questo suggerisce anche che il ponte salino gioca un ruolo cruciale nel mantenimento della stabilità e dell’attività di HSD11B2. Le catene laterali di R213 formano legami a idrogeno con gli atomi della spina dorsale dei residui A331 e L329 (Fig. 4I). Diminuendo questi legami a idrogeno, che aiutano a mantenere la struttura terziaria della proteina, la mutazione R213C compromette la stabilità dell’enzima (Fig. 4I).

Il cluster Arg/Tyr dai residui 335-339 è stato precedentemente implicato nel mantenimento della stabilità della proteina, sebbene il meccanismo preciso sia rimasto poco chiaro (23). Mutazioni che coinvolgono questi residui sono state riportate in pazienti AME, tra cui R337C e Y338H. Le simulazioni dei modelli monomerici e dimerici di HSD11B2 suggeriscono che il residuo R337 forma un’interazione a ponte salino con D223 e legami a idrogeno con il gruppo OH di Y339 (Fig. 4J). Le loro interazioni sembrano essere importanti per mantenere il corretto ripiegamento e la stabilità della proteina. Così, la sua mutazione in Cys abolisce sia il ponte salino che il legame a idrogeno per destabilizzare l’enzima e causare gravi AME. Le mutazioni genetiche di questo residuo mostrano inoltre che R337K, che mantiene la polarità e la carica positiva, riduce l’attività dell’enzima del 70%, mentre R337A, che è simile a R337C nell’avere catene laterali non cariche e corte, inattiva HSD11B2 completamente (23) (Fig. 4J). Nello stesso cluster Arg/Tyr, la mutazione di Y338 a His inattiva l’enzima e causa una grave AME. Il nostro modello suggerisce che questo residuo Tyr forma interazioni idrofobiche con A328 e legami idrogeno con D327 (Fig. 4K). Entrambe le interazioni aiutano a sostenere la stabilità della proteina, così che la sostituzione di Tyr con His, per esempio, inattiva HSD11B2. Questo perché, anche se Y338H mantiene la capacità di legame a idrogeno, ha catene laterali più corte che destabilizzano l’enzima. Allo stesso modo, la sostituzione di Tyr con Phe in un costrutto ingegnerizzato Y338F non è tollerata. Qui, le interazioni idrofobiche sono mantenute ma il legame a idrogeno è abolito (23). Infine, R337 e Y338 nel cluster Arg/Tyr sono anche altamente conservati in molte specie; quindi, è improbabile che qualsiasi modifica a questi residui sia tollerata (23).

Sono state riportate diverse mutazioni che causano una forma più lieve di AME con manifestazioni cliniche e biochimiche meno gravi. I relativi costrutti mutati hanno dimostrato di aver mantenuto l’attività di HSD11B2 in vitro (4, 19, 24), coerentemente con il fenotipo clinico meno grave. Strutturalmente, queste mutazioni possono sia interrompere indirettamente il legame del substrato (come la mutazione P227L in uno dei nostri pazienti) o alterare la struttura della proteina (come le mutazioni R279C e R359W) per attenuare, ma non abolire l’attività enzimatica (Fig. 5). In particolare, mentre il residuo P227 non si trova in una posizione che interagisce direttamente con il substrato, il suo posizionamento adiacente al residuo Y226 suggerisce che può avere un ruolo nel legame del substrato (Fig. 5A). Infatti, questo residuo forma il “kink” nella regione del loop, mantenendo la conformazione del sito attivo e tiene anche Y226 nella posizione corretta per interagire in modo ottimale con il substrato. La mutazione di questo residuo in Leu (P227L) interrompe il kink e altera il posizionamento di Y226 (Fig. 5A).

Due mutazioni non conservative che si pensa interrompano la struttura terziaria di HSD11B2 sono state identificate in pazienti con AME tipo 2. R279 forma un legame a idrogeno con la spina dorsale di N171, che aiuta a mantenere e stabilizzare l’ambiente locale della proteina (Fig. 5B). La sostituzione di R279 con un residuo che non forma un legame a idrogeno, come nella mutazione R279C, porta a una lieve attenuazione, ma non alla totale eliminazione dell’attività di HSD11B2 (24), coerente con un fenotipo clinico lieve (Fig. 5B). Un’altra mutazione non conservativa, R359W, cambia le proprietà della catena laterale da carica a idrofoba. Questo altera l’interazione locale all’interno della struttura della proteina, in cui la catena laterale caricata positivamente di R359 forma un legame a idrogeno con l’ossigeno carbonilico del backbone di I350 (Fig. 5C). Una perdita di questa interazione contribuisce alla maggiore flessibilità strutturale, causando un’attenuazione dell’attività enzimatica. Da notare che sia R279C che R359W causano un’interruzione minima delle interazioni intramolecolari e si verificano vicino alla superficie della proteina.