Antimicrobico cationico alimentare ε-polisina altera transitoriamente la comunità microbica intestinale e funzione metagenoma previsto in CD-1 topi

Un biopolimero antimicrobico cationico influenza la diversità della comunità intestinale murina

40 topi femmina e 40 maschi di 6 settimane CD-1 sono stati divisi a caso in quattro gruppi e segregati per sesso (cioè 10 femmine e 10 maschi).e. 10 topi femmina e 10 maschi per gruppo) e alimentati con una dieta ad alto contenuto di grassi al 20% integrata con (i) maltodestrina da sola (MD) che serviva come controllo, (ii) maltodestrina + ε-polisina (PL), (iii) maltodestrina + pectina (P), e (iv) maltodestrina + ε-polisina + pectina (PL-P). Studi precedenti hanno dimostrato che i topi coabitati insieme esibiscono comunità microbiche intestinali simili.38, 39 Così, i pellet fecali raccolti da ogni gabbia sono stati raccolti in gabbie metaboliche 24 ore e analizzati in tre punti: settimana 1 (linea di base), settimana 5 (fase intermedia) e settimana 9 (fase finale) (Fig. 1). Il peso corporeo e il consumo di cibo non sono variati indipendentemente dal gruppo di trattamento e per tutto il periodo sperimentale.

Per caratterizzare la diversità filogenetica, il frammento del gene 16S rRNA V3/V4 è stato sequenziato per produrre 15.739.734 letture di qualità dopo il filtraggio.40 Questo ha fornito una profondità media del campione di 327.911 letture di sequenziamento per comunità batterica. Per valutare l’α-diversità all’interno di una data comunità, il numero di unità tassonomiche operative (OTU) osservate è stato calcolato utilizzando UniFrac pesato.41 Le curve di rarefazione per le OTU osservate (Fig. S1) si sono avvicinate a un asintoto indipendente dalla dieta, dal punto di campionamento e dal sesso per indicare la profondità di sequenziamento sufficientemente coperta dalla diversità OTU presente nelle comunità estratte dai campioni fecali.

A livello di phylum, la somma di Actinobacteria, Bacteroidetes, Deferribacteres, Firmicutes, Proteobacteria, Verrucomicrobia ha costituito oltre il 99% delle OTU identificate in tutti i campioni analizzati. Come precedentemente riportato,42, 43 il microbioma intestinale murino consiste in contributi relativamente grandi forniti dai phyla Bacteroidetes e Firmicutes (Fig. 2). Questo è coerente con le comunità intestinali di altri mammiferi, compresi gli esseri umani e i primati non umani.44, 45 Tuttavia, le abbondanze relative di Bacteriodetes (p < 0,05) e Firmicutes (p < 0,05) sono state alterate in risposta al particolare biopolimero alimentare (multi-way ANOVA) (Fig. 2). È interessante notare che i topi alimentati con il complesso ε-polisina-pectina hanno mostrato un aumento di Bacteriodetes a 8.82% (p < 0.05, multiway ANOVA Tukey HSD post-hoc) con una corrispondente diminuzione di OTUs assegnato a Firmicutes da 11.13% (p < 0.05, multiway ANOVA Tukey HSD post-hoc). Questo è relativo alla struttura della comunità determinata nel gruppo di controllo alimentato con maltodestrine (Tabella S1). Inoltre, i topi alimentati con ε-polisina (cioè nessun complesso di pectina) hanno esibito una comunità relativamente carente di Firmicutes nella fase intermedia (cioè 5 settimane) dello studio. Notevolmente, Firmicute OTUs rimbalzato alla sua concentrazione iniziale al punto di campionamento 9 settimane (linea di base: 55.24%, intermedio: 34.71%, finale: 59.01%, linea di base vs. intermedio: p < 0.05, intermedio vs. finale: p < 0.05, multi-way ANOVA Tukey HSD post-hoc) (Fig. 2 e Tabella S3). Mostrando la stessa risposta adattativa, la frazione relativa di Bacteriodetes OTUs transitoriamente aumentato a 5 settimane di alimentazione e convergente alle concentrazioni iniziali al punto di tempo finale (linea di base: 35.40%, intermedio: 51.18%, finale: 28.82%, linea di base vs. intermedio: p < 0.05, intermedio vs. finale: p < 0.05, multi-way ANOVA Tukey HSD post-hoc) (Fig. 2 e Tabella S3). Un simile aumento transitorio in Verrucomicrobia si è verificato in topi alimentati pectina da solo, a cadere a livelli originali al punto di campionamento finale (linea di base: 0.59%, intermedio: 5.46%, finale: 1.01%, linea di base vs. intermedio: p < 0.05, intermedio vs. finale: p < 0.05 multi-way ANOVA Tukey HSD post-hoc) (Fig. 2 e Tabella S4). In aggregato, questi risultati indicano che specifici biopolimeri alimentari dirigere transitoriamente rappresentazione phyla all’interno dell’intestino murino. Questo è stato osservato quando sia la ε-polisina che la pectina sono state incorporate individualmente. Tuttavia, quando la ε-polisina è stata complessata con la pectina anionica, questo fenomeno non è stato osservato. È degno di nota che flussi significativi di popolazione all’interno di Actinobacteria, Deferribacteres, e Proteobacteria non sono stati osservati indipendentemente dalla dieta (Tabella S5).

Oltre alla distruzione della comunità a livello di phylum, diversi generi batterici si sono spostati in risposta ai biopolimeri alimentari. Questo include i membri del genere Bacteroides che erano i taxa più frequentemente incontrati nell’intestino del topo (14,32 ± 9,58% in tutti i campioni). In totale (attraverso entrambi i sessi e i punti di campionamento), la rappresentazione dei Bacteroides varia rispetto al gruppo di alimentazione dei biopolimeri. Rispecchiando la risposta del phylum Bacteroidetes, ε-polisina (p < 0,05, multiway ANOVA Tukey HSD post-hoc) e ε-polisina-pectina complessato trattamento (p < 0,05, multiway ANOVA Tukey HSD post-hoc) aumentato le popolazioni Bacteroides spp. da 7.95 e 7.46%, rispettivamente, rispetto al gruppo di controllo maltodestrina (Fig. 3 e Tabella S6). Altre popolazioni batteriche che sono state modulate dai regimi di alimentazione includono, Adlercreutzia, Lactobacillus, Turicibacter, e Ruminococcus (ANOVA a più vie, p < 0,05). In particolare, l’abbondanza di Adlercreutzia è diminuita indipendentemente dal biopolimero rispetto al gruppo alimentato con maltodestrine. Le loro popolazioni relative sono diminuite dello 0,18%, 0,22%, 0,24% nei topi alimentati con ε-polisina, pectina e complessi ε-polisina-pectina, rispettivamente. Inoltre, il genere Ruminococcus è diminuito significativamente dell’1,39% in risposta alla ε-polisina e diminuito dell’1,44% nel gruppo pectina. Inoltre, la dieta con complesso ε-polisina-pectina ha diminuito significativamente il contenuto di Lactobacillus del 4,95%, riflettendo una diminuzione generale dei Firmicutes in questo gruppo. Questo è in contrasto con la dieta a base di pectina che ha arricchito Turicibacter rispetto alle altre tre diete. Un catalogo completo dei generi che differiscono in risposta alle condizioni dei biopolimeri è fornito nella tabella S6.

La maltodestrina è comunemente utilizzata come agente addensante o riempitivo in varie applicazioni nutrizionali. Questo polisaccaride è stato utilizzato nella formulazione di tutte le diete di trattamento, e quindi è servito come controllo per determinare se la maltodestrina da sola avrebbe arricchito i batteri capaci di idrolizzare i legami glicosidici α-1-4 tra i residui di d-glucosio. Come tale, l’abbondanza relativa di Coprococcus nell’intestino del topo è stata arricchita durante il consumo di maltodestrina incorporata nel loro cibo. La traiettoria di risposta ha incluso un aumento significativo tra la linea di base e i punti di campionamento intermedi e tra la linea di base e il punto temporale finale (linea di base: 0,56%, intermedio: 0,98%, finale: 0.91%, linea di base vs. intermedio: p < 0.05, linea di base vs. finale: p < 0.05) (Fig. 3 e Tabella S7).

Nel gruppo di trattamento ε-polisina, l’abbondanza relativa di Bacteroides transitoriamente aumentato, coerente con l’oscillazione a livello di phylum (linea di base: 8.85%, intermedio: 34,40%, finale: 8,74%, linea di base vs. intermedio: p < 0,05, intermedio vs. finale: p < 0,05). Una risposta simile è stata osservata per Oscillospira (basale: 4,96%, intermedio: 2,51%, finale: 6,13%, linea di base vs. intermedio: p < 0,05, intermedio vs. finale: p < 0,05). Questo è in contrasto con una diminuzione transitoria di OTUs assegnato a Ruminococcus (linea di base: 2.17%, intermedio: 0.97%, finale: 2.10%, basale vs. intermedio: p < 0.05, intermedio vs. finale: p < 0.05), e Adlercreutzia (basale: 0.49%, intermedio: 0,24%, finale: 0.34%, linea di base vs. intermedio: p < 0.05) (Fig. 3 e Tabella S8). Inoltre, Coprococcus spp. ha mostrato un arricchimento sostenuto durante l’alimentazione, con aumenti significativi tra la linea di base e il punto temporale finale (linea di base: 0,47%, intermedio: 0.71%, finale: 0.91%, linea di base vs finale: p < 0.05) (Fig. 3 e Tabella S8). Questo è coerente con la stessa tendenza osservata nel gruppo di controllo della maltodestrina. Tuttavia, Coprococcus popolazioni rimangono relativamente statico in topi alimentati pectina e ε-polisina-pectina complessi.

Pectina transitoriamente arricchito per il genere Akkermansia (basale: 0.59%, intermedio: 5,46%, finale: 1,01%, linea di base vs. intermedio: p < 0,05, intermedio vs. finale: p < 0,05) contribuendo all’aumento intermedio osservato di Verrucomicrobia. Al contrario, le popolazioni di Adlercreutzia sono diminuite nel punto di campionamento intermedio e sono rimaste depresse nell’osservazione finale (Adlercreutzia basale: 0,48%, intermedio: 0,23%, finale: 0,26%, linea di base vs. intermedio: p < 0,05). Candidato genere rc4-4 OTU rappresentazione diminuita proporzionalmente, anche se esibito rimbalzo incompleto agli stati iniziali (rc4-4 linea di base: 1.94%, intermedio: 1.04%, finale: 1.62%, linea di base vs intermedio: p < 0.05) (Fig. 3 e Tabella S9). È interessante notare che Ruminococcus spp. ha mantenuto una traiettoria decrescente attraverso lo studio di alimentazione con differenze significative tra i punti di tempo basale e finale (basale: 2.32%, intermedio: 1.63%, finale: 1,14%: linea di base vs finale: p < 0,05) (Fig. 3 e Tabella S9).

Anche se la maggior parte dei generi non si è spostata in risposta ai complessi ε-polisina-pectina, Ocscillospira è aumentato transitoriamente prima di scendere sotto i livelli iniziali (linea di base: 3,56%, intermedio: 4,70%, finale: 2,44%, intermedio vs. finale: p < 0,05). Al contrario, le popolazioni di Parabacteroides sono state generalmente inibite da uno qualsiasi dei trattamenti dietetici (basale: 3.44%, intermedio: 0.79%, finale: 0.55%, basale vs. intermedio: p < 0.05, basale vs. finale: p < 0.05). Questo è simile a rc4-4 (linea di base: 2,82%, intermedio: 0,77%, finale: 0,48%, basale vs. intermedio: p < 0,05, basale vs. finale: p < 0,05). In totale, i generi del microbiota intestinale rispondono agli additivi alimentari a livello di genere, in particolare ε-polisina (Fig. 3 e Tabella S10).

Oltre ai biopolimeri alimentari che influenzano taxa specifici, la composizione strutturale della comunità aveva cambiamenti discernibili e non casuali in aggregato. ANOSIM46 con 999 permutazioni è stato utilizzato per testare le differenze significative tra i gruppi di campioni basati su UniFrac ponderato.41 Come previsto, maltodestrina non ha significativamente spostare la comunità microbica intestinale murina alimentato questo controllo in entrambi i topi femmina o maschio (Fig. 4a, ANOSIM con 999 permutazioni, p > 0,05). Di conseguenza, pectina (Fig. 4c, ANOSIM con 999 permutazioni, p > 0.05) e ε-polisina-pectina complessi (Fig. 4d, ANOSIM con 999 permutazioni, p > 0.05) non ha promosso spostamenti significativi all’interno della comunità. Questo è in notevole contrasto con i microbiomi intestinali che sono stati transitoriamente alterati da ε-polisina da solo. Come osservato con specifici gruppi tassonomici a livello di phylum e genus, la struttura della comunità è stata perturbata al punto di 5 settimane per essere successivamente risolta al momento del campionamento finale. Questo suggerisce che la composizione della popolazione è stata corretta al suo stato iniziale attraverso l’adattamento al biopolimero continuamente alimentato (Fig. 4b, ANOSIM con 999 permutazioni, p < 0,05). Questo non è stato osservato nei topi trattati con il complesso ε-polisina-pectina, indicativo di un’interazione schermante con la comunità microbica.

Laε-polilsina sposta transitoriamente la funzione metagenomica prevista

Il potenziale metagenomico inerente ai microbiomi intestinali è stato dedotto da Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt) basato su dati filogenetici 16S rRNA. Un totale di 6.854.103.780 osservazioni sono state predette attraverso 6909 gruppi di ortologia (KO) della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) all’interno delle 48 comunità intestinali che sono state profilate da PICRUSt. I dati risultanti sono stati classificati in 254 percorsi funzionali che comprendono tutte le 48 comunità.

In totale, c’erano 44 percorsi che sono stati previsti per spostare in modo significativo transitorio mentre i topi stavano consumando ε-polisina (ANOVA con correzione Bonferroni, p < 0.05) (Fig. 5). Come per le alterazioni della struttura tassonomica, i campioni intermedi presi a 5 settimane hanno mostrato un profilo significativamente diverso rispetto alla linea di base e punti di campionamento finale. Tra questi 44 percorsi o reti, 42 percorsi sono coinvolti nel metabolismo batterico o sono altrimenti previsti per mediare le interazioni ospite-microbico, con 18 percorsi presenti allo 0,5% di abbondanza relativa sulla base della media dei tre punti di campionamento (Fig. 5). Di questi, otto percorsi sono stati previsti per diminuire a 5 settimane e tornare a livelli basali al campionamento finale. Al contrario, 10 percorsi previsti hanno mostrato la tendenza opposta e sono temporaneamente aumentati in abbondanza. Di conseguenza, i geni e i loro percorsi relativi al trasporto generale dei soluti (basale: 7,53%, intermedio: 5,88%, finale: 7,68%, p < 0,05) e i trasportatori ABC (basale: 3,35%, intermedio: 2,76%, finale: 3,44%, p < 0,05) sono stati soppressi allo stato intermedio della comunità e alla fine sono tornati ai livelli basali. Questo suggerisce che le esigenze metaboliche, e/o le concentrazioni ambientali di soluti desiderabili, possono essere brevemente diminuite prima del ripristino della struttura del microbioma. Inoltre, i processi metabolici centrali previsti coinvolti nel metabolismo dei carboidrati e delle proteine passano a uno stato reversibile, mentre l’ospite consuma la dieta arricchita di ε-polisina. Questo si riflette nei percorsi glicolitici/fermentativi (linea di base: 1.05%, intermedio: 1.13%, finale: 1.08%, p < 0.05), il metabolismo del piruvato (linea di base: 1.01%, intermedio: 1.07%, finale: 1.02%, p < 0.05), fruttosio e mannosio metabolismi (linea di base: 0.085%, intermedio: 0.099%, finale: 0.089%, p < 0.05), e geni associati con fosforilazione ossidativa (linea di base: 1.12%, intermedio: 1.23%, finale: 1.08%, p < 0.05). Quest’ultimo KO probabilmente coinvolto nella respirazione anaerobica e transitoriamente arricchito nel punto temporale intermedio. Oltre al catabolismo dei carboidrati, percorsi associati al flusso di azoto sono stati spostati a 5 settimane tra cui zucchero amminico e metabolismi dello zucchero nucleotide (basale: 1.47%, intermedio: 1.60%, finale: 1.50%, p < 0.05), e metabolismo dell’istidina (basale: 0.062%, intermedio: 0.067%, finale: 0.061%, p < 0.05). Avevamo inizialmente ipotizzato che i segni distintivi del catabolismo della lisina sarebbero stati arricchiti nei metagenomi previsti dei topi alimentati con ε-polisina, sia nella dieta PL che PL-P. Tuttavia, questo segnale non è stato osservato nell’analisi PICRUSt, suggerendo che l’ε-polisina non ha selezionato popolazioni batteriche che hanno aumentato il potenziale catabolico della lisina.

Come i metagenomi previsti hanno risposto alla ε-polilsina alimentare, non sono state rilevate differenze significative negli altri tre gruppi di alimentazione. Questo include i topi alimentati con ε-polisina complessata con pectina, fornendo ulteriore supporto per la schermatura elettrostatica per mitigare l’influenza antimicrobica della ε-polisina. La pectina da sola non altera la struttura della comunità o la funzione prevista.

Il sesso dell’ospite influenza il microboma basale ma non la traiettoria di risposta

Sono stati osservati sia topi maschi che femmine per determinare se l’attività dei biopolimeri all’interno del microbioma dipende dal sesso. Di conseguenza, diversi taxa batterici hanno colonizzato animali maschi e femmine in modo asimmetrico e non casuale. Questo include il phylum Verrucomicrobia trovato a concentrazioni più elevate nei topi femmina rispetto ai maschi in aggregato (femmina: 4.96% di 24 campioni, maschio: 2.63% di 24 campioni, p < 0.05, multi-way ANOVA) (Tabella S11). Gran parte di questo può essere rappresentato da differenze nelle popolazioni Akkermansia (femmina: 4.50%, maschio: 2.63% p < 0.05). Inoltre, i topi femmina harbored popolazioni significativamente maggiore di Parabacteroides generi batterici (femmina: 2.47%, maschio: 0.5%, p < 0.05) e Bilophila (femmina: 2.13%, maschio: 0.01%, p < 0.05). Al contrario, i topi maschi sono stati colonizzati da maggiori concentrazioni di Odoribacter (femmina: 0%, maschio: 0.92%, p < 0.05), Turicibacter (femmina: 0.02%, maschio: 0.21%, p < 0.05), Clostridium (femmina: 0.01%, maschio: 0.10%, p < 0.05), e candidato genere rc4-4 (femmina: 0.16%, maschio: 2.46%, p < 0.05) (Tabella S12).

Oltre alle differenze tassonomiche, ci sono differenze strutturali alla comunità attribuibile al sesso animale evidente in UniFrac distanza visualizzata da analisi delle coordinate principali (PCoA) in Fig. 6a. Di conseguenza, microbiota intestinale osservato in topi femmina e maschio cluster insieme per sesso, e in modo più simile all’interno del loro rispettivo sesso che sono tra loro (Fig. 6a, ANOSIM con 999 permutazioni, p < 0.05). Inoltre, clustering gerarchico di microbiomi e generi batterici basato sulla loro abbondanza relativa esposto un modello simile in quanto le comunità batteriche all’interno dello stesso sesso tendono a cluster (Figg. S2 e S3). La media all’interno del gruppo diversità filogenetica del maschio femmina è più piccolo di topi maschi (Fig. 6b, t-test, p < 0.05), mentre le differenze non sono state osservate tra topi femmine e maschi nel numero totale di OTUs osservati e Chao 1 indice (Fig. S4).

In contrasto con le differenze strutturali tra i microbiomi ospitati da femmine e quelli ospitati da maschi, solo tre percorsi metagenomici previsti sono variati significativamente. Questo include operazioni legate alla trascrizione (femmina: 0.0092%, maschio: 0.0051%, p < 0.05), biosintesi antibiotica aminoglicoside (femmina: 0.087%, maschio: 0.080%, p < 0.05) e metabolismo dei glicerofosfolipidi (femmina: 0.55%, maschio: 0.52%, p < 0.05). Non è chiaro se queste sono alla base delle differenze metaboliche espresse tra i due sessi ospiti. La conservazione della funzione nonostante la variazione tassonomica è coerente con la ridondanza del potenziale genetico precedentemente osservato all’interno di altre comunità microbiche.46, 47

Nonostante le caratteristiche dipendenti dal sesso, l’effetto specifico dei trattamenti biopolimerici rimane indipendente dal sesso come indicato dall’analisi PCoA (Fig. 3). In particolare, la ε-polisina altera transitoriamente il microbioma murino al punto di campionamento intermedio, indipendentemente dal sesso. Mentre la pectina o la pectina complessata con ε-polisina non altera il microbiota dei topi femmina e maschio. Un percorso di risposta simile è evidente nei flussi a livello di phylum, come Bacteriodes e Firmictues rappresentazione è temporaneamente spostato in risposta a ε-polisina in entrambi i sessi (Fig. S5). Inoltre, i microbiomi intestinali derivati da entrambi i sessi hanno mostrato lo stesso cambiamento in Verrucomicrobia quando alimentato pectina (Fig. S5). Inoltre, rispetto al gruppo alimentato con maltodestrine, la dieta con complesso ε-polisina-pectina ha aumentato i Batteriodeti e diminuito i Firmicutes indipendentemente dal sesso. Questi risultati indicano che i tratti dipendenti dal sesso (ad esempio gli ormoni) non hanno agito sinergicamente o antagonisticamente con i biopolimeri alimentari per alterare la struttura della comunità in generale e all’interno dei principali phyla. L’abbondanza relativa di Parabacteroides (sesso * trattamento p < 0,05, multiway ANOVA), Clostridium (sesso * trattamento p < 0,05, multiway ANOVA), Coprococcus (sesso * trattamento, p < 0,05, multiway ANOVA), e Bilophila (sesso * trattamento p < 0,05, multiway ANOVA) esposto modesta dipendenza dal sesso ospite (Fig. S6). Nei topi femmina, il contenuto Coprococcus era più alto nel gruppo pectina rispetto agli altri tre gruppi nei topi femmina (MD: 0.69%, PL: 0.63%, P: 0.98%, PL + P: 0.65%, MD vs P: p < 0.05, PL vs P: p < 0.05, P vs PL + P: p < 0.05). Tuttavia, nei topi maschi, Coprococcus OTUs del gruppo pectina erano diminuiti nei microbiomi rispetto agli altri tre gruppi (MD: 0.94%, PL: 0.77%, P: 0.45%, PL+P: 0.78%, MD vs. P: p < 0.05, PL vs. P: p < 0.05, P vs. PL+P: p < 0.05). Inoltre, Bilophila era ridotto in topi femmina alimentati con ε-polisina rispetto a ε-polisina-pectina dieta complessa (MD: 0.51%, PL + P: 1.63%, p < 0.05), mentre il microbioma dei topi maschi non ha mostrato questo flusso di popolazione legato al sesso. Inoltre, le interazioni di sesso, punti di campionamento e biopolimero hanno influenzato l’abbondanza relativa osservata del genere Turicibacter (p < 0,05), Clostridium (p < 0,05), Coprococcus (p < 0,05) e il candidato genere rc4-4 (p < 0,05).