Hvad er SMRT-sekventering (Single-Molecule Real-Time)?

Af Dr. Maho Yokoyama, Ph.D.Anmeldt af Christian Zerfaß, Ph.D.

Skip til:

• Hvordan fungerer SMRT-sekventering?
• Studier af DNA-methylering i bakterier; en anvendelse af SMRT-sekventering

DNA-sekventering fungerer ved at bruge DNA-polymerase til at tilføje nukleotider til en skabelon. Der er flere teknologier til rådighed til DNA-sekventering. Et eksempel herpå er Single-Molecule Real-Time-sekventering eller SMRT-sekventering.

Forsker undersøger DNA-sekvens på et transparent objektglas. Credit: Shawn Hempel /

Hvordan fungerer SMRT-sekventering?

Som med andre DNA-sekventeringsteknologier er det første skridt efter DNA-udtræk at forberede et “bibliotek”. Denne proces forbereder DNA’et til sekventering; i dette tilfælde tilføjes adaptorer til begge ender af et dobbeltstrenget DNA-molekyle, hvilket effektivt gør det muligt for DNA’et at blive til en enkeltstrenget cirkulær skabelon. Dette betyder så, at DNA’et kan sekventeres kontinuerligt.

Dette DNA-bibliotek, eller skabelon-DNA’et, anbringes derefter i en DNA-sequencer, som indeholder “nulmodusbølgeledere”, der har DNA-polymerase immobiliseret i den ene ende. Et enkelt DNA-molekyle immobiliseres derefter i disse nulmodusbølgeledere, og DNA-polymerasen begynder at tilføje nye nukleotider til en de novo-syntetiseret DNA-streng, der er komplementær til skabelon-DNA’et. Baserne i disse nukleotider er mærket, og inkorporeringen af disse baser i den voksende DNA-streng forårsager lysemission. Denne lysemission aflæses derefter i realtid, og da emissionen fra hver base er forskellig, kan den specifikke base identificeres.

Den største fordel ved SMRT-sekventering er genereringen af lange sekventeringslæsninger med høj nøjagtighed, hvilket forbedrer samlingen af hele genomer. Dette skyldes, at længere sekventeringsreads betyder, at der kræves mindre “opbygning” for at samle genomet.

Studier af DNA-methylering i bakterier; en anvendelse af SMRT-sekventering

Hvad er DNA-methylering?

Tilsætning af en methylgruppe til DNA, også kendt som methylering, forekommer i alle livets riger. Der findes tre methylerede nukleotider i bakterier; m5C (C5-methyl-cytosin, som også findes i eukaryoter), m6A (N6-methyl-adenin) og m4C (N4-methyl-cytosin, som kun findes i bakterier). Methylering sker efter syntesen af nye DNA-strenge og sker ved specifikke nukleotider.

Methylgrupperne stikker ud af DNA-dobbeltspiralen og kan derfor påvirke bindingen mellem DNA og DNA-bindingsproteiner. Dette påvirker igen processer, herunder kromosomreplikation, reparation af DNA-mismatch, samt timing af gentranskription og dannelse af epigenetiske slægtslinjer.

Epigenetiske mekanismer: methylering eller acetylering af dna’et kan aktivere eller ikke aktivere gentranskriptionen. Image Credit: ellepigrafica /

Hvorfor er dna-methylering vigtig i bakterier?

Bakterier er inficeret af vira og har derfor brug for en beskyttelsesmekanisme for at overvinde virusinfektioner. Det er her, restriktionsmodifikationssystemer kommer ind i billedet; dette system består af et restriktionsenzym, som nedbryder DNA på bestemte steder, og en DNA-methyltransferase, som tilføjer en methylgruppe til adenin (A) eller cytosin (C).

I de fleste restriktionsmodifikationssystemer fungerer DNA-methyltransferasen til at beskytte bakterie-DNA’et mod restriktionsenzymet. Tilstedeværelsen af DNA-methyltransferase betyder, at bakterie-DNA’et bliver methyleret, mens det inficerende virale DNA ikke bliver det. Dette betyder igen, at det virale DNA nedbrydes af restriktionsenzymet, mens det bakterielle DNA er beskyttet, fordi restriktionsenzymet ikke virker på det methylerede DNA. Det skal dog bemærkes, at der findes restriktionsenzymer, som virker på modificeret DNA.

Nyere undersøgelser har antydet, at der kan være yderligere roller for restriktionsmodificeringssystemer. For eksempel resulterede knockout af visse restriktionsmodifikationssystemer i en ændring i genekspressionen, som er knyttet til forskellen i DNA-methylering. Restriktionsmodifikationssystemer kan også forårsage dobbeltstrengede brud og C-T-mutationer og dermed påvirke bakteriers evolution. For nylig er der udviklet teknologier, der kan bestemme methyleringen af et helt bakteriegenom, kendt som “methylomet”.

Hvordan bestemmer man methylomet ved hjælp af SMRT-sekventering?

Da SMRT-sekventering giver resultater i realtid, kan den bruges til at påvise DNA-modifikationer, herunder methyleringer. DNA-polymerasen inkorporerer nukleotider med en konstant hastighed, men denne hastighed kan ændres, hvis nukleotidet i skabelonen var blevet modificeret. Dette kan noteres under sekventeringsprocessen.

Blow at al. brugte SMRT-sekventering til at kortlægge DNA-modifikationer i 230 mikroorganismer. De modifikationer, de ledte efter, var bl.a. m5C, m6A og m4C. Forfatterne fandt, at 93 % af disse mikroorganismer viste DNA-methylering, og de fandt også 834 motiver, som var methylerede. Dette gjorde det muligt for forfatterne at identificere, hvilke motiver der er mål for 620 DNA-methyltransferaser.

Interessant nok bemærkede forfatterne, at selv om 48 % af de undersøgte organismer havde en DNA-methyltransferase, var der ingen tegn på, at der også var et restriktionsenzym til stede. Derfor er det muligt, at DNA-methylering spiller en vigtig rolle i regulering af genomet eller en anden vigtig rolle i mikroorganismer, som endnu ikke er identificeret.

Videre læsning

• Alt indhold om DNA-sekventering
• DNA-sekventering
• DNA-sekvenssamling
• DNA-mikroarray
• High-throughput DNA-sekventeringsteknikker

Skrevet af

Dr. Maho Yokoyama

Dr. Maho Yokoyama er forsker og videnskabsskribent. Hun fik sin ph.d. fra University of Bath, UK, efter en afhandling inden for mikrobiologi, hvor hun anvendte funktionel genomik på Staphylococcus aureus . I løbet af sine ph.d.-studier samarbejdede Maho med andre akademikere om flere artikler og offentliggjorde endda nogle af sine egne arbejder i videnskabelige tidsskrifter med peer-review. Hun præsenterede også sit arbejde på akademiske konferencer rundt om i verden.

Citationer