Three-dimensional reconstruction of the feeding apparatus of the kullancs Ixodes ricinus (Acari: Ixodidae): a new insight into the mechanism of blood-feeding

X-ray imaging of the female I. ricinus

Itt megmutatjuk, hogy a röntgen CRYTUR elrendezés (amely az X-RayWorx mikrofókuszon, a röntgenforráson és a CRYCAM röntgensugaras detektoron alapul) kiválóan alkalmas a nőstény kullancsok ozmiummal impregnált belső struktúráinak gyors és roncsolásmentes megfigyelésére. Az 1A. ábra a második lábpárok területéig érő cheliceralis retractor izmokat, a kutikula vastagságát, a lábakon belüli izmokat és a szájpadokat mutatja (1A. ábra, 1. film). A 2D röntgenképekből nyert 3D modell további térbeli információt szolgáltatott a nőstény kapitulum felszíni struktúráiról (1B. ábra), amely összehasonlítható a SEM-mel készített előnézeti képalkotással (1D. ábra), és így lehetőség nyílt egyes belső struktúrák (pl. izmok, a chelicerae és a garat alapjainak) különböző virtuális szeleteken történő megjelenítésére is (1B. ábra). A röntgentomográfia felbontása 8,060 µm volt, és a Fourier-analízis alapján számították ki egy rekonstruált virtuális szeletből a rekonstruált objektum közepén lévő laterális síkon. A sugárirányban átlagolt teljesítményspektrum grafikonját készítettük el, és a Rayleigh-kritérium alapján a zajszint és a csúcsérték közötti távolság 8,94%-ánál értékeltük a határjel és a zaj elválasztását. Mivel a röntgenmodellt a vetületi képekből rekonstruáltuk a 0° és 180° közötti tartományban, 10°-os lépéssel, a felbontás technikailag közel izotróp. Ez a felbontás azonban nem volt elegendő a nimfa szájszerveinek megfigyeléséhez (1C,D ábra, lásd a nőstény és a nimfa szájszerveinek méretének összehasonlítását azonos nagyítás mellett).

Soros metszet SEM

Az I. ricinus nimfa táplálkozó apparátusának sorozatos ultravékony gyanta metszetekből rekonstruált 3D modellje feltárta a nyálcsatorna és a táplálékcsatorna kapcsolatát a kapitulusok (chelicerae, hypostome) és más kapcsolódó struktúrák, főként izmok (ábra. 2, 2. és 3. film)14.

A capitulumból kifelé a nyál és a vérliszt egy keskeny résbe, a preorális csatornába, a ventrális oldalon a hypostoma barázdája és a dorzális oldalon a chelicerae között kialakított csatornába ürül/szívódik (2A ábra). A Rhipicephalus (korábban Boophilus) microplusban a hypostomális barázdát egy vékony hártya, más néven ereszcsatorna fedi12. Érdekes módon ez a struktúra hiányzott az Ixodes hexagonus9, a Haemaphysalis longicornus15 és az I. ricinus esetében. A capitulum belsejében a nyál/vér a nyálcsatorna üregébe folytatódik, és ez a közös út egy, a nyálcsatornától elválasztott táplálékcsatornával végződik (2A,B ábra). A kullancs dorzális oldaláról nézve a táplálékcsatorna a nyálcsatorna alatt helyezkedik el. A nyálcsatorna nem egy állandóan rögzített szerkezet; inkább a chelicerae-nek a hypostoma dorzális oldala fölé történő elhelyezésével jön létre. A táplálékcsatorna a garatba nyíló nyílással válik el a közös járattól. A tetejét kezdetben egy apró lamella alkotja (2B ábra, zöld nyíl), amely a capitulum mélyén rövid rúddá bővül (2C,I zöld ábra), majd nagyobb, szklerotizált szárnyszerű lemezként (más néven alae) folytatódik (2E,I zöld ábra). Mindezek a struktúrák együttesen alkotják a labrumot. A labrum alsó részén, a garatnyílás mellett egy fogszerű nyúlvány található (2C,E ábra, fekete nyilak). Ezt a fogszerű struktúrát az I. hexagonus, az I. holocyclus és a Rhipicephalus microplus9,12,16 esetében írták le. Úgy tűnik, hogy a fogszerű nyúlvány a garatnyílás egyik barázdájába illeszkedik, ezért feltételezhetően a garatszelep fontos része. E fogszerű nyúlvány labrumként való azonosítását indokolja, hogy hasonlít az argasida kullancsok labrumához, amely szintén a garat tetejéről nyúlik a táplálékcsatornába13,16 . A táplálékcsatorna, az apró labrum és a billentyű anatómiai felépítése az I. ricinusban összhangban van e kullancsok lassú táplálkozási folyamatával, amelyben hosszú szívási impulzusok váltakoznak a nyálelválasztás impulzusával a vérrel való táplálkozás hosszú ideje alatt. A lágy kullancsoknál azonban a labrum a táplálékcsatorna teljes hosszában disztálisan húzódik. Ez összhangban van a gyors táplálkozási folyamattal azokban a kullancsokban, amelyekben a labrum gyors rebegtetése szinkronban van a gyors szívással és nyálelválasztással, hogy mindössze 1-2 órán belül táplálkozzanak13. EM-megfigyeléseink alapján a garatfedőnek ez az elülső része nem kapcsolódott izmokhoz, és valószínűleg a billentyű egy helyhez kötött (támasztó) részét képezi (2B ábra). A garattető a subhypostomális lemezekhez kapcsolódik, amelyek a garat oldalait és egy padlót alkotnak (2C. ábra fehér nyilak). Ezek a lemezek a nagy tágítóizom-sávokhoz kapcsolódnak, amelyek ellentétes oldalukon a ventrális kutikulához kapcsolódnak. A garat elülső tágítóizmai (ADM, a 2C,E,I. ábrán világos rózsaszínű struktúrákként látható) csak a garat elülső részén helyezkednek el, és összehúzódásuk/lazulásuk lehetővé teszi a garatnyílásban lévő billentyű nyitását/zárását9,12 . Az ADM a garat elülső részének felső sarkához és mélyen oldalsó oldalához kapcsolódik. A garatfalak középső részéhez a tágítóizmok egy másik csoportja kapcsolódik, amelyek összehúzódása oldalra tágítja a garatlument. Ezek a garat oldalsó tágítóizmai (LDM) a 2G ábrán, illetve mélyrózsaszín színű struktúrákként a 2I,J ábrán láthatók. Az LDM lehetővé teszi a garat lumenének masszív tágulását, valószínűleg az Arthur és munkatársai9 , valamint Sonenshine és Anderson13 által leírt kettős Y alakú falnak köszönhetően az elülső részen (2G. ábra) és a garat hátsó részén lévő hármas Y alakú falnak köszönhetően, keresztmetszetben (2H. ábra). A két tágító izomcsoport összehúzódásának és ellazulásának váltakozása kitágítja a garatot, szinkronizálva az elülső billentyű megnyitásával, erőteljes szívóimpulzust létrehozva. Az LDM relaxációja a garatszelep záródása után összenyomja a garatot, és a lenyelt vért hátrafelé a nyelőcsőbe és a középbélbe hajtja. A garatnyílás nyílása/zárása közötti időbeli szinkronizáció, amely a garatszelep nyitásával és zárásával, valamint a garat középső részében lévő lumen összenyomásával/tágításával van összehangolva, lehetővé teszi a szívást, valamint a tápláléknak a nyelőcsőbe történő mozgását, és megakadályozza a vér visszaáramlását a gazdaszervezetbe9,12 . A garat belső bélése szklerotizált, míg a nyelőcső falát hámsejtek bélelik (2A ábra). A nyelőcső áthalad a synganglionon és összeolvad a középbéllel (adat nem látható).

A nyálmirigy egy nagy üreg, amely a garat és a chelicerae között helyezkedik el (2A-E ábra). A nyálmirigy elülső része közös a vér és a nyál átvezetésére, majd a garatot a nyálmirigy padlójától az apró lamella választja el (lásd fentebb). A nyálmirigy tetejét és oldalsó oldalait a szklerotizált cheliceralis lemez (ChP a 2C,E,F ábrán és a 2M ábrán látható piros struktúra) erősíti meg, amely a kullancs testének üregébe is beljebb nyúlik. A nyálmirigy hátsó részén ennek a lemeznek az oldalsó oldalai a kullancs testüregének oldalsó oldalaihoz ellentétes végekkel rögzített izmokhoz kapcsolódnak. Ezek a nyálmirigy oldalsó izmai (LMS) a 2E,F,K,L ábrán világos lilával jelölve láthatók. Az izmok összehúzódása ellapítja a nyálmirigy falához szorosan kapcsolódó lemezt, ami a nyálmirigy belső terének szűküléséhez/záródásához vezet, azonban csak annak hátsó részén, a garat elválasztása mögött.

A nyálmirigy hátsó végének padlója továbbá egy kis ferde izomcsoporthoz kapcsolódik (a nyálmirigy padlójához kapcsolódó izmok, MS a 2E,F,J,N ábrán, világoskékkel jelölve), amely az ellentétes részeken a garat elülső részének felső részéhez csatlakozik. Ezek az izmok teszik lehetővé a nyálpadlás hátsó részének felfelé és lefelé irányuló mozgását. Ezeket az izmokat már leírták a nőstény I. holocyclus16 esetében. Annak lehetőségét, hogy a nyálcsatorna padlója le- vagy felemelhető, már korábban is felvetették a nyál gyors kiáramlásával kapcsolatban, a R. microplus és a Dermacentor andersoni nyálcsorgás közbeni elektromos jelek rögzítése alapján12,17,18,19,20 . Az R. microplus nyálzásakor a vezetőképességben gyors (akár másodpercenként 30) lefelé irányuló eltéréseket figyeltek meg, amelyeket a nyálzás végén nagyobb tüskék követtek. E mérések egyik magyarázata a garat elülső részében lévő izmok összehúzódása, amelyet a táplálékcsatorna feletti membrán (hypostomalis gutter) hasonló pulzálása kísér, amely csatornát nyit a nyál kilökődéséhez20. Feltételezzük, hogy a nyálpadláshoz tapadó kis ferde izmok a nyál mozgását elősegítő rezgést generálhatnak. Ugyanakkor a nyálmirigy belső terének átmérőjét befolyásoló oldalsó izmok is részt vehetnek a nyál kiürítésében a szájszervekből (az animációban nem szerepelnek). Feltételezzük, hogy a chelicerae-ok mozgása a gazdabőrön belül szintén segíthet a nyálnak a nyálmirigyből a gazdabőrbe való kiűzésében. A cheliceralis bázisok (ChB a 2A,B ábrán) közvetlenül a nyálmirigy felett helyezkednek el (dorzális nézetből), és feltételezzük, hogy ezek a struktúrák lokálisan összenyomhatják a nyálmirigyet, hogy segítsék a nyál kilökődését. A chelicerae-k enyhén aszinkron meghosszabbodását kétfotonos intravitalis mikroszkópiával közvetlenül a táplálkozóhelyen belül figyeltük meg az I. scapularis bekebelezésének teljes időtartama alatt21. Megfigyeltük, hogy a chelicerae kissé aszinkron módon kezd mozogni a pilokarpin alkalmazása után a nem táplált és a részben táplált I. ricinus nőstények háti kutikuláján (5. és 6. film). A cheliceralis bázisok (ChB a 2A,B ábrán) közvetlenül a nyálmirigy felett helyezkednek el (dorzális nézetből), és feltételezhetjük, hogy ezek a struktúrák képesek kitágítani vagy összenyomni a nyálmirigyet, és segítenek a nyál kilökésében. A pilokarpin, egy nem endogén kolinerg hatóanyag alkalmazása közismerten közvetve, a kullancs központi idegrendszerén keresztül indukálja a nyálelválasztást22 , míg a kullancs egyéb szöveteire gyakorolt hatása homályban marad. Ezért nem zárhatjuk ki, hogy kísérleteinkben a pilokarpin által közvetített chelicerae-mozgás a gyógyszer kullancsoknál kifejtett további hatása. Bockenstedt és munkatársai felvetették, hogy a chelicerae visszaszorítja a kollagénrostokat, amelyek összenyomhatják a táplálkozási helyet, ami nagyban megerősíti a chelicerae által közvetített nyálkilökődéssel kapcsolatos hipotézisünket a gazdaszervezet felé21.

Közvetlenül a nyálüreg vége előtt páros nyálcsatornák lépnek be annak oldalsó sarkaiba12. Mindkét nyálcsatornát egy szövetlap (TSD a 2C,E,F,M,N ábrán, sötétlila) zárja körül, amely valószínűleg rugalmasan rögzíti a nyálcsatornákat a nyálmirigy oldalsó sarkaihoz.

A nyálzás és a vérszívás szimulációja a 3D modell alapján

A táplálkozási folyamat során az ixodid kullancsoknál a nyálzás lassú vagy gyors vérszívással váltakozik, és tartalmazhat egy nyugalmi időszakot is. A nőstény vérszívás során az egyes tevékenységekkel töltött idő százalékos aránya változó, és a napszakon, a kullancsok méretén stb. múlik18. A 4. filmben animáltuk mind a táplálékcsatornát, mind a nyál átvezetésére szolgáló csatornát a hozzá kapcsolódó struktúrákkal, és bemutatjuk, hogyan működnek ezek a struktúrák. A legtöbb ixodid kullancs táplálkozási folyamata cementszerű anyagok kiválasztásával kezdődik, ami lehetővé teszi a kullancs rögzülését a gazdabőrben, és lezárja a táplálkozási sérülés és a behelyezett szájszervek közötti rést23,24,25. A nyálelválasztási időszakot egy rövid nyálkitörés zárhatja le16,17,18,19 . A nyál kilökődését valószínűleg a nyálpadló hátsó részének rezgése segíti elő; a cheliceralis bázisok mozgása is szerepet játszhat (6. film). A vérszívás megkezdése előtt a nyálmirigy hátsó részének nyílását a nyálmirigy teteje és a kullancstest oldalsó fala között feszülő oldalsó izmok szűkítik. Ezt a műveletet a garatszelep megnyitása és az elülső garatszelvénynek az elülső tágítóizmok összehúzódása által okozott tágulása követi. Ezt követően a garat középső része a hossztengelye mentén megnyúlik, és a vér a garatba szívódik. Az elülső garatszelep záródik, mielőtt a garatfal ismét összehúzódik, és a vér hátrafelé a nyelőcsőbe tolódik. Ez a perisztaltikus hullám addig ismétlődik, amíg a nyálelválasztás be nem indul. A nyálfolyás kezdetén a nyálmirigy oldalsó szűkítőizmai ellazulnak, ezáltal a nyálmirigy ürege megnagyobbodik. A nyálcsatorna tetejének ismételt leengedése és felemelése a hátsó részében valószínűleg megkönnyíti a nyál eljuttatását a száj előtti csatornába.