Ribonukleáz A

I.U.B.: 3.1.27.5

C.A.S.: 9001-99-4

Enzimatikus reakció (a kép új ablakban nyílik meg)

A pankreász ribonukleáz (RNáz) egy endoribonukleáz. Egy nukleotid 5′-ribóza és egy szomszédos pirimidin-nukleotid 3′-ribózához kötött foszfátcsoportja közötti foszfodiészterkötés felhasítását katalizálja. Ez a hasadás 2′,3′-ciklikus foszfátot képez, amely aztán a megfelelő 3′-nukleozid-foszfáttá hidrolizálódik.

Az RNáz legnagyobb mennyiségben a kérődzők hasnyálmirigyében található (Barnard 1969). A kristályos enzim fő komponense az RNáz A; egy kisebb komponens az RNáz B. Az RNáz B az RNáz A glikozilált formája (Beintema és mtsai. 1976).

Történet:

Jones 1920-ban végzett munkáját szokták a hasnyálmirigy ribonukleáz “kezdeteként” említeni (Richards és Wycoff 1971). Az RNázt 1938-ban Dubos és Thompson izolálta, majd 1940-ben Kunitz kristályosította.

1947-ben a Worthington volt az első cég, amely nagy tisztaságú kristályos RNázt állított elő. Az 1950-es évek elején az Armour cég nyers kristályos enzimet állított elő, és nagyon kedvező áron kínálta. Az 1960-as és 1970-es években az RNáz A volt a kedvenc vizsgált enzim, elsősorban azért, mert figyelemre méltóan termostabil és nagy koncentrációban van jelen egy hozzáférhető forrásban, a szarvasmarha hasnyálmirigyben. Ezek a vizsgálatok vezettek a kristályszerkezet felderítéséhez (Anfinsen 1959, Groves 1966 és Scheraga 1967), az aminosav-szekvencia meghatározásához (Smyth et al. 1963), a katalitikus mechanizmus azonosításához (Beers 1960) és a hajtogatási útvonal tisztázásához (Hantgan et al. 1974). Az RNáz A volt az első enzim és a harmadik olyan fehérje, amelynek helyes aminosav-szekvenciáját meghatározták (Raines 1998).

Az RNázzal kapcsolatos vizsgálatokhoz kapcsolódó munkákért négy Nobel-díjat adományoztak (Anfinsen, Moore, Stein és Merrifield). A hatalmas irodalom és a számos tanulmány az RNázt a 20. század legjobban tanulmányozott enzimévé tette (Raines 1998).

A legújabb munkák továbbra is az RNáz szintézisét és érését vizsgálják az élő sejtek endoplazmatikus retikulumában (Geiger és mtsai. 2010). Ugyancsak sok munka foglalkozik még az RNáz hajtogatásának és aggregációjának tanulmányozásával (Benito et al. 2008, Iwaoka et al. 2008 és Arai et al. 2010). Vizsgálják az enzim szerepét a rák kialakulásában és a génszabályozásban (Shlyakhovenko 2009), és rák kemoterápiás szereket fejlesztenek belőle (Chao és mtsai. 2010).

Specifikusság:

A RNáz A specifikus a pirimidin nukleozid kötésekhez (Volkin és Cohn 1953). A reakció feltehetően két lépésben megy végbe. Az első lépésben a 3′,5′-foszfodiészter kötés hasad, miközben egy 2′,3′-ciklikus foszfodiészter intermedier keletkezik. A második lépésben a ciklikus foszfodiészter hidrolizálódik 3′-monofoszfátcsoporttá. Az első lépés nem specifikus a szubsztrát nitrogénbázisa tekintetében; a második lépés azonban teljesen specifikus a terminális 2′,3′-ciklikus foszfátokkal rendelkező pirimidin-nukleotidokra. Az RNáz B ugyanolyan specifikus, mint az RNáz A mind a ciklikus citidilát, mind az élesztő RNS iránt (Plummer és Hirs 1963). Az RNáz A a nagyobb szubsztrátokat részesíti előnyben (Nogués és mtsai. 1995).

Az enzim kétszer olyan gyorsan hasít citidinmaradványokon, mint uridilmaradványokon (Richards és Wyckoff 1971). Úgy találták, hogy a Thr45 a legfontosabb a pirimidin specifitás közvetítésében, mind a pirimidin bázisokkal hidrogénkötéseket képezve, mind a purin bázisok sterikus kizárásával (del Cardayré és Raines 1994). Az Asp83 oldallánca fontos az átmeneti állapot stabilizálásában az uridintartalmú szubsztrátok hasítása során; ez a maradék nincs hatással a citidinhasítás kinetikájára (del Cardayré és Raines 1995).

Összetétel:

A fehérje alakja vesére hasonlít, az aktív centrum maradékai a hasadékban helyezkednek el (Richardson 1981, és Raines 1998). A másodlagos szerkezet hosszú négyszálú antiparallel béta-lemezeket és három rövid alfa-hélixet tartalmaz (Raines 1998). Az RNáz A négy diszulfidkötést tartalmaz, amelyek kritikusak a natív enzim stabilitása szempontjából. E diszulfidkötések közül kettő egy alfa-hélix és egy béta-lemez között helyezkedik el, és jobban hozzájárul a termikus stabilitáshoz, mint a másik kettő (Klink és mtsai. 2000). Az RNáz B egy glikoprotein, amely az Asn34-nél egyetlen oligoszacharidot tartalmaz, amely hat mannóz- és két N-acetilglükózamin-maradékból áll (Tarentino és mtsai. 1970).

Molekuláris jellemzők:

A RNáz A egy kis fehérje, az érett enzimnek csak 124 aminosavmaradványa van, és nem kapcsolódik hozzá szénhidrát. Az RNáz A a 20 aminosavból 19-et tartalmaz, csak a triptofán hiányzik belőle (Nogués et al. 1995, és Raines 1998). Az RNáz A háromdimenziós szerkezetét teljes mértékben kódolja az aminosav szekvenciája (White és Anfinsen 1959, valamint Raines 1998). Mind a nyolc humán RNáz-A-szerű gén a 14. kromoszómán található. Mindegyik egy szekréciós szignálszekvenciát kódol, és egy két hisztidinből és egy lizinből álló változatlan katalitikus triádot tartalmaz egy konzervált motívummal (CKXXNTF) (Marshall és mtsai. 2008).

Számos RNáz A homológ aminosav szekvenciáját azonosították, ami az RNáz A-t a gerincesek molekuláris evolúciójának modellrendszerévé teszi (Dyer és Rosenberg 2006). A szekvenciákból és azok fajok közötti eloszlásából megállapították, hogy az RNáz A egy modern fehérje, amely gyorsan fejlődik (Doolittle 1992 és Raines 1998).

A fehérje hozzáférési száma: P61823

CATH osztályozás (v. 3.2.0):

• osztály: Roll
• Topológia: P-30 fehérje

Molekulatömeg:

• RNáz A: 13,7 kDa (Hirs et al. 1956b)
• RNáz B: 14,700 ± 0,3 (Plummer és Hirs 1963)

Optimal pH: RNáz A: 7,0-7,5 (Brown és Todd 1955)

Isoelektromos pont:

• RNáz A: 9,3 (Ui 1971)

Extinkciós koefficiens:

• RNáz A és B: 8,640 cm-1M-1 (Elméleti)
• RNáz A: E 1%, 280 = 7,3 (Worthington RNáz A)
• RNáz B: E 1%, 280 = 5.77 (Elméleti, RNáz B)

Aktív hely maradványai:

• Hisztidin (H12, H119)
• Lizin (K41)

Aktivátorok:

• Nátrium-klorid (Weickmann et al. 1981)
• Szulfát (Moosavi-Movahedi et al. 2006)

Inhibitorok:

• Nehézfémionok
• Ribonukleáz inhibitor (RI), egy 50 kDa fehérje, amely ≤ 0 0.01%-át teszi ki az emlőssejtek citoszoljában lévő fehérjének (Takahashi 1967)
• Uridin-vanadát komplexek (Lindquist et al. 1973)

Alkalmazások:

• RNS eltávolítása DNS izolálás során
• RNS szekvencia analízis
• RNáz védelmi próbák
• RNS mennyiségi meghatározása vagy feltérképezése
• Plazmid DNS tisztítása
• Genomikus DNS izolálása
• Molekulasúly marker