7 RAG-kötődés genomszerte
A RAG1 közvetlen DNS-kötő tulajdonságai és az antigénreceptor-génekben jelen lévő RSS-ek egyedülálló gyakorisága miatt ésszerű volt feltételezni, hogy a V(D)J-rekombináció helyspecificitását egyszerűen a RAG1 preferenciális toborzása kényszeríti ki a preferált DNS-szubsztrátokra. A RAG2-nek, PHD-je és saját katalitikus aktivitásának hiánya miatt, nem szabadna funkcionális korlátozásokat mutatnia lokalizációs mintázatát illetően. Ennek megfelelően a RAG2 széles körben kötődik a limfocita genomban, elfoglalva az aktív TSS-ek jelentős részét (~ 60%), amelyek H3K4me3-ban gazdagodnak (Ji és mtsai., 2010; Teng és mtsai., 2015). Azonban a RAG1 is több ezer olyan helyre lokalizálódik (~ 3500 az egér thymocytákban és pre-B sejtekben), amelyeket a RAG2 és a H3K4me3 együttesen foglal el, felölelve az igen aktív, vonal-specifikus promóterek és enhancerek jelentős részét (Teng et al., 2015). Ez a széleskörű lokalizáció a RAG1 katalitikus mutánsa (D708A) esetében is megfigyelhető, ami arra utal, hogy a RAG1 széleskörű kötődése nem a posztcleavage felhalmozódást tükrözi (Teng és mtsai., 2015). Az antigénreceptor géneken kívüli RAG1-kötőhelyek nem mutattak egyértelmű korrelációt az RSS-szerű motívumok (kriptikus RSS-ek vagy cRSS-ek) jelenlétével, ami tovább jelzi, hogy a szekvenciaspecifikus kapcsolatok és a RAG által közvetített hasítási aktivitás nem magyarázhatja a RAG1 kötődési mintázatát az egész genomban. Ehelyett a kromatin hozzáférhetőségének markerei a legjobb előrejelzői a RAG1 rekrutációjának: H3K4me3, H3K27Ac, emelkedett GC-tartalom és emelkedett CpG-tartalom (Teng és mtsai., 2015).
Tény, hogy csak néhány példa bizonyítja a RAG1 specifikus rekrutációját az antigénreceptor génekhez olyan transz-faktorokon keresztül, amelyek mind a RAG1-gyel, mind a specifikus DNS-motívumokkal kölcsönhatásba lépnek. A rekrutációs esemény lokuszspecifikussága minden esetben nem az RSS-től önmagában, hanem egy olyan transzkripciós faktor-kötő motívumtól függ, amely véletlenül átfedésben van egy RSS-sel. Az egér Tcrb lókusz egy olyan esetet illusztrál, ahol a célzott RAG1-rekrimináció hozzájárul a “12/23-on túli” korlátozásokhoz, amelyek segítenek fenntartani a rekombináció helyes sorrendjét (Dβ-Jβ a Vβ-DJβ előtt). A Dβ1 és Dβ2-t flankáló 3′ 23-RSS-ek konzervált kötőhelyeket tartalmaznak a c-fos, az AP-1 transzkripciós faktor egyik alegysége számára (Wang és mtsai., 2008). A c-fos a transzkripciós aktiváló tulajdonságaitól független módon preferenciálisan rekrutálja a RAG1-et a 3′ Dβ RSS-ekhez, így kedvezve a Dβ-Jβ rekombinációnak (Wang és mtsai., 2008). A B-vonalban az analóg antigénreceptor lókusz az Igh gén, ahol a közvetlen Vh-Dh rekombináció kedvezőtlen a Vh-DJh rekombinációhoz képest. Ebben az esetben azonban úgy tűnik, hogy a rekombináció sorrendjét a D-Jh rekombinációt követő epigenetikai jelölések helyi eltolódásai szabályozzák, amelyek a DJ terméket jelölik meg a csíravonalbeli Dh génszakaszokhoz képest preferenciális RAG1-kötésre és rekombinációra (Subrahmanyam és mtsai., 2012). Ezenkívül a közvetlen Vh-Dh rekombinációt elnyomja egy IGCR1 néven ismert szekvenciaelem, amely a D és V géncsoportok között helyezkedik el (Guo és mtsai., 2011). Az IGCR1 két létfontosságú CTCF-helyet tartalmaz, és feltételezhetően az Igh-lokusz DJ-részét a V-résztől szekvenáló kromatinhurok horgonypontjaként funkcionál (Guo és mtsai., 2011; Lin, Guo, Su, Zhang, & Alt, 2015; Medvedovic és mtsai., 2013). A humán Tcrd lókusz egy másik példát szolgáltat a lókusz-specifikus RAG1 lerakódásra, ahol a Runx1-függő RAG1 rekrutáció a Dδ2-re kedvez a Dδ2-Dδ3 átrendeződési eseménynek, amely megelőzi a klasszikus Dδ-Jδ rekombinációt (Cieslak és mtsai., 2014). Ez a két D génszakasz humánspecifikus bevonását eredményezi a Tcrd átrendeződésekbe. Végül a Pax5-ről feltételezték, hogy kölcsönhatásba lép a RAG-gal és elősegíti a RAG rekrutációját a Vh génszakaszokhoz (Zhang és mtsai., 2006), bár még nem bizonyították, hogy ez a mechanizmus fokozza az endogén Igh-lokusz összeszerelődését.
A felsorolt kivételektől eltekintve úgy tűnik, hogy a RAG1 kötődése nem elsősorban szekvencia-specifikus rekrutációs eseményekből indul ki. Még a Tcr és Ig géneken belül is a RAG1 kötődés túlmutat az RSS határain, és olyan intronikus régiókat foglal el, amelyek H3K4me3-ban gazdagok, de nincsenek RSS-ek (Teng és mtsai., 2015). Ez nem jelenti azt, hogy az RSS-ek nem játszanak másodlagos szerepet a RAG1 kötődésének stabilizálásában vagy fokozásában a rekrutáció után. A Tcra és az Igk gének a RAG1 kötődésének első számú rekrutálói a duplán pozitív timocitákban, illetve a pre-B sejtekben, és a rekombinációs központokban az RSS-ek felett egyértelműen megfigyelhetők a RAG1 felhalmozódásának meghatározott csúcsai (Teng és mtsai., 2015). Az RSS-ek kivételes sűrűsége az antigénreceptor génekben valószínűleg az egyik legfontosabb jellemző, amely megkülönbözteti őket a genom többi részétől.
A genomban azonban általában RSS-független RAG1-rekrimináció figyelhető meg, amely valószínűleg a RAG1 és a DNS közötti nem specifikus kölcsönhatások révén történik, amelyeket a RAG1 mag különböző doménjei, köztük az NBD közvetítenek (Teng et al., 2015; Yin et al., 2009). Emellett a RAG1 kromatinhoz való közvetett rekrutációja a RAG2-vel való kölcsönhatásán keresztül is bekövetkezhet, bár ez utóbbi nem magyarázhatja teljes mértékben a RAG1-kötési mintázatokat, amelyek részben fennmaradnak a RAG2 hiányában is, bár csökkent intenzitással (Teng et al., 2015).
A RAG1-kötőhelyek genomiális tartománya, bár szélesebb az előrejelzettnél, még tovább bővül akár a RAG1, akár a RAG2 nem magdoménjeinek hiányában. A RAG2 C-terminális régiójának hiányában (amely magában foglalja a PHD-t) a RAG1 a H3K4me3 alacsonyabb sűrűségű helyek felé diffundál, ahelyett, hogy a legaktívabb TSS-ek felé irányulna (Teng és mtsai., 2015). Az egyik lehetőség, hogy ez a RAG1 további, nem specifikus DNS-kötő aktivitásának leleplezéséből adódik, mivel a RAG2 C-terminális régiójában található autoinhibitoros domén hiányzik (Lu és mtsai., 2015). Egy másik lehetőség, hogy a RAG2 PHD doménjének hiányában a RAG-komplex kevésbé hajlamos a magas H3K4me3-tartalmú régiókba hazatérni. A szélesebb körű RAG1-kötődési mintázat szempontjából az is releváns lehet, hogy a RAG2 C-terminális régiójának deléciója a RAG1 fehérjeszintjének felszabályozásához vezet (Teng és mtsai., 2015). A Core RAG1 szintén sokkal promiszkuzívebben kötődik, mint a teljes hosszúságú RAG1, és érdekes módon a teljes hosszúságú RAG1-hez képest megnövekedett intenzitású kötődést mutat számos nem antigén receptorhelyen, de csökkent intenzitású kötődést mutat a Tcra lokuszon(Teng és mtsai., 2015). Ez tükrözheti a csonka RAG1 fehérje belső DNS-kötő tulajdonságainak megváltozását, vagy a RAG1 nem magterminálisaiban kódolt tevékenységek (mint például a RING-mediált hiszton ubikvitiláció vagy a C-terminális által közvetített autoinhibíció) hiányát. Szintén lényeges lehet az a fent említett tény, hogy a core RAG1 lényegesen magasabb szinten fejeződik ki, mint a teljes hosszúságú RAG1.
A RAG rekombináz nemcsak a szubsztrátjaiban, különösen az RSS-spacerben, hanem a heptamerben és a nem-amerben is tolerálja a szekvencia-variációt (Hesse et al., 1989; Lewis, Agard, Suh, & Czyzyk, 1997; Marculescu, Le, Simon, Jaeger, & Nadel, 2002; Ramsden, Baetz, & Wu, 1994; Zhang & Swanson, 2008). Még az NBD által közvetített RAG1-nonamer kölcsönhatás is viszonylag kevés szekvenciaspecifikus kontaktusra támaszkodik (Yin és mtsai., 2009). Az antigénreceptor-géneket benépesítő RSS-ek szekvenciatartalmukban változatosak (néha jelentősen eltérnek a konszenzusos heptamer és nonamer motívumoktól), és a RAG által végzett szubsztrátfelismerésnek kellően rugalmasnak kell lennie ahhoz, hogy a repertoár maximális változatosságát lehetővé tegye. Az antigénreceptor-géneken kívül a RAG1-kötőhelyek nem mutatnak kumulatív preferenciát semmilyen konkrét szekvenciajelzés iránt (Teng és mtsai., 2015).
A RAG rugalmas szubsztrátfelismerése azonban problémát okoz a genom többi része számára. A funkcionális RSS meglehetősen minimális szekvenciaigénye (legalábbis a jelenleg ismert szabályok szerint) lehetővé teszi, hogy a cRSS-ek meglehetősen gyakran forduljanak elő a gerincesek genomjában (Lewis et al., 1997). A véletlenszerű cRSS-ek veszélyességét nyilvánvalóvá teszi a RAG-függő genetikai átrendeződésekben való részvételük, amelyek hozzájárulnak a lymphomagenezishez (Larmonie és mtsai., 2013). Mivel az egész genomban a RAG1-kötődés nagy részét a DNS-hez vagy hozzáférhető kromatinhoz való nem specifikus rekrutáció szabályozza, biológiailag bölcs dolognak tűnik az erős cRSS-ek elérhetőségének korlátozása a RAG1-kötőhelyek közelében, és így a célponton kívüli RAG-aktivitás lehetőségének minimalizálása. Valóban, a RAG1-kötőhelyek egér és humán limfocitákban előnyösen megfosztottak a cRSS-ektől (Teng és mtsai., 2015), és azt javasoljuk, hogy ez az antigénreceptor-géneken kívül bekövetkező genetikai átrendeződések által kifejtett szelekciós nyomás miatt következett be. Így a RAG1-asszociált TSS-ek repertoárja védve van a RAG-aktivitástól a V(D)J rekombináció során. Feltételezzük, hogy a ritka cRSS-ek, amelyek megtartják aktivitásukat és továbbra is közvetítik a ritkán előforduló ektopikus átrendeződést, a gazdalókuszukban található szabályozó vagy funkcionális szekvenciákkal való átfedésük miatt maradtak fenn a genomban, vagy egyszerűen nem gyakoroltak elég erős negatív következményeket ahhoz, hogy szelektálódjanak ellenük.