Mikrobiológia és Kísérletek

Ebben a tanulmányban a Barrackpore önkormányzat és a Dhapa hulladéklerakóból származó baktériumtörzsek izolálására és jellemzésére került sor. A baktériumok növekedése különböző fizikai-kémiai körülményektől függ, mint például a táptalaj, pH, hőmérséklet, inkubációs idő, szénforrás stb. Ezért a baktériumok természetes élőhelyen történő növekedésének különböző feltételeit meg kell vizsgálni, mielőtt tömeges szaporításba kezdenénk a bomlasztóként való felhasználás érdekében. Így a következő paramétereket vették figyelembe:

A települési szilárd hulladék fizikai és kémiai jellemzői

A baktériumok széles nedvességtartományban képesek növekedni. Ebben a vizsgálatban megállapították, hogy a Barrackpore önkormányzatból és a Dhapa hulladéklerakóból begyűjtött minta nedvességtartalma körülbelül 65,32% és 66,45% volt. A különböző talajok baktériumpopulációja szorosan összefügg a nedvességtartalmukkal. A maximális baktériumsűrűség a viszonylag magas nedvességtartalmú területeken található, és az aerob baktériumok aktivitásának optimális szintje gyakran a talaj nedvességtartó képességének 50-75%-a.1 A Pseudomonas, Achromobacter és Bacillus nemzetségek száma a legtöbb aerob talajban megtalálható; ahol a körülmények anaerobok és nedvesek, ott Clostridium fordul elő. Az aktinomiciták hasonló mennyiségi növekedést mutattak ilyen körülmények között.15

Ebben a vizsgálatban a két kiválasztott táptalaj (BCDA és NA) pH-ját optimalizálták a baktériumtörzsek tenyésztésére. A begyűjtött minta ph-ja mindkét mintában 7,79 volt. A pH kulcsfontosságú tényező a baktériumok mesterséges közegben történő tenyésztése szempontjából. A pH optimalizálását két kiválasztott táptalajon végeztük el, nevezetesen a Nutrient Agar (NA) és a Basic czapek dox agar (BCDA) táptalajon. Az NA és a BCDA 7,2 és 7,6 pH-n megfelelőnek bizonyult a baktériumtörzsek maximális növekedéséhez. Az eredményekből kiderült, hogy a minta pH-ja körülbelül 7,79 volt, és lehetséges, hogy emiatt ezek a törzsek is jól növekedtek in vitro körülmények között, 7-8-as pH-n a BCDA-ban és az NA-ban. A baktériumok elviselik a talaj reakcióját a 4 és 10 közötti pH szintek között, de a legkedvezőbb pH a többség számára csak a semlegesség lúgos oldala. Az olyan baktériumok, mint a Thiobacillus thiooxidans és az Acetobacter sp. a 0 és 2 pH-szint közötti nagyon alacsony pH-értékeken is képesek növekedni, néhány Bacillus sp. pedig pH 11-nél is képes növekedni.15 A Thermoactinomycetes optimális növekedése 8 vagy 9-es pH-nál következik be, és a pH 516 körüli reakciók nagymértékben visszavetik őket.16

A minta NPK-tartalmát kezdetben a minta NPK-tartalmát vizsgálták. A szervesanyag-tartalom 27,84% (Barrackpore település) és 29,32% (Dhapa), a nitrogéntartalom %-ban 0,165 (Barrackpore település) és 0,179 (Dhapa), a foszfortartalom %-ban 0,502 (Barrackpore település) és 0,545 (Dhapa), a káliumtartalom %-ban 18,29 (Barrackpore település) és 19,21 (Dhapa) volt. Mindezek az elemzések világos képet adtak a baktériumok natív környezetéről, és így meghatározó tényezők voltak a törzsek izolálásában és tenyésztésében.

A baktériumizolátumok tenyésztési jellemzői

Vizsgálatunkban a BM1, BM2, BM3, D1, D2, D3, D4, C2 és C3 – ez 9 baktériumtörzset izoláltunk táptalajon. Czapek dox agar és Nutrient agar táptalajok közül választottuk ki a legmegfelelőbbet az izolált törzsek masszív növekedésének biztosítására. czapek dox agar (BCDA) alkalmas volt a BM3, D1,C2 masszív növekedésére és Nutrient agar (NA) táptalaj alkalmas volt a BM1, BM2, D2, D3, D4, C3 masszív növekedésére. Úgy láttuk, hogy az élesztőkivonatos xilánt tartalmazó táptalaj alkalmas volt a baktériumok maximális növekedésére, de a Pseudomonas sp., Bacillus spp. és Aeromonas sp. jól növekedett a tápanyag-agar táptalajon. A kiválasztott törzsek jellemzésére vizuális és mikroszkópos megfigyelést alkalmaztunk. A baktériumok telepjellemzőinek részleteit feljegyeztük (1. táblázat). A Gram-festés régi és megbízható módszer a baktériumok megfigyelésére. A Gram-negatív baktériumokat alkohollal színtelenítették, elveszítve a kristályviola lila színét. A Gram-pozitív baktériumok nem színeződtek el, és lila színűek maradtak.

A jelen vizsgálatban, BM1, BM2, BM3, D1, D2, D3, D4, C2 és C3 -a 9 baktériumtörzs izolálása és mikrobiológiai jellemzése történt. Az eredmények azt mutatták, hogy a BM1, BM3, D1 gram pozitív bacillusok, a BM2 gram pozitív rövid bacillusok, a D2 gram pozitív diplobacillusok, a D3, C2 gram negatív bacillusok, a D4 gram negatív rövid bacillusok és a C3 gram pozitív kokkuszok. A 9 izolátumon különböző biokémiai vizsgálatokat is végeztünk, hogy megismerjük biokémiai jellemzőiket. A baktériumok biokémiai jellemzőinek részleteit a (2. táblázat) tartalmazza.

A fenti eredmények képet adtak az izolált törzsek morfológiájáról, kolóniajellemzőiről és biokémiai jellegéről, ami a jövőben segítheti az izolált baktériumtörzsek azonosítását és jellemzését.

A növekedési feltételek optimalizálása

A jelen vizsgálatban az izolált törzsek növekedését különböző táptalajokon, mint például NA, ACDA és BCDA, figyeltük meg. Azt láttuk, hogy a bázikus czapek dox agar (BCDA) alkalmas volt a BM3, D1, C2 és a tápanyag agar (NA) táptalaj a BM1, BM2, D2, D3, D4, C3 masszív növekedésére.

A kísérletben 9 törzs baktériumtenyészetét inkubáltuk különböző hőmérsékleteken, mint 25, 29, 34, 37 és 40 °C-on. Az összes törzs optimális növekedését 37 °C-on találtuk. A baktériumok számára az optimális hőmérsékleti tartomány körülbelül 25-36 °C között van. Számos baktérium 10-4°C-on is jól növekedhet.6 Sultana17 megfigyelte, hogy a 33± 4°C hőmérséklet ideális a baktériumok növekedéséhez.17 Bizonyos baktériumok 20°C alatti hőmérsékleten fejlődnek a legerőteljesebben. A termofilok 45-65 °C-os hőmérsékleten jól szaporodnak, egyes termofilok pedig 40 °C alatt képtelenek szaporodni.1

A jelen vizsgálatban kapott törzseket különböző inkubációs időszakokon (6, 12, 24, 36, 48 és 72 óra) inkubáltuk. A 24 órás inkubációs időszak megfelelő volt a BM1, BM2, D2, D3, D4, C3 esetében, míg a BM3, D1 és C2 36 órás inkubációs időszakkal bizonyult megfelelőnek. A kólibaktériumok 24± 2 órás inkubációs időszakban és 32°C-on növekednek, és jó növekedést mutatnak 37°C-on 48 órás inkubáció során. A vizuális megfigyelés során megállapították, hogy 24 órás inkubáció után a BM2 színe világos narancssárga, a BM1 színe fehér, a BM3 színe pedig krémfehér volt az általuk preferált közegben (BCDA és NA). 48-72 óra inkubáció után a BM2 színe narancssárga, a BM1, D1 sárga, a C2 piros, a BM3, D2, D3, D4, C3 pedig krémfehér maradt. A BM1, BM2, D2 és D4 törzsek kolóniái nedvesek voltak, a többi pedig krémszínű. A Staphylococcusok és a Micrococusok aranybarna, sárga vagy fehér kolóniát hoznak létre közönséges táptalajon. Egyes Enterococcusok, Coryneformok és Enterobaktériumok fekete kolóniákat hozhatnak létre közönséges táptalajon.8

Antagonizmus vizsgálat

A baktériumtörzsek közötti antagonizmus meghatározására keresztcsíkozási módszert alkalmaztunk a baktériumtörzsek jövőbeli, különböző szempontú alkalmazása érdekében. A baktériumizolátumokon belüli antagonizmus részleteit ismertetjük (3. táblázat).

BM2 minden más törzzsel antagonizmust mutat, így nem lehetséges konzorciumot kialakítani, ha ezt a törzset használjuk az egyik izolátumként. A D1, D3 a legtöbb más törzzsel is antagonista. A BM1 a legerősebb törzs, mivel a többi izolátum egyikével sem mutat antagonizmust. A BM3, D2, D4, D5 és D6 antagonizmusban áll néhány izolátummal, és ezek a törzsek a BM1-gyel együtt különböző kombinációkban vizsgálhatók konzorcium készítéséhez.

Nehézfémtolerancia vizsgálat

Öt nehézfém (As, Zn, Pb, Hg, Cd) került kiválasztásra az izolált baktériumtörzsek (BM1, BM2, BM3, DF1, D2, D3, D4, C2, C3) fémtűrő képességének meghatározásához. A toleranciavizsgálat azt mutatta, hogy az öt kikísérletezett nehézfém közül a legnagyobb tolerancia a Pb-vel szemben mutatkozott, amely a mikroorganizmusok növekedését 4000 ppm-ig mutatta, míg a legkisebb tolerancia a Cd-vel szemben mutatkozott, amely 30 ppm felett nem mutatott növekedést. A MIC értéket akkor állapították meg, amikor az izolátumok még 10 napos inkubáció után sem növekedtek a lemezeken. Az eredmény azt mutatja, hogy mindhárom baktérium esetében a MIC 250 ppm és 350 ppm között mozgott az As, Cd (10-30 ppm), Zn (200-300 ppm), Hg (200-300 ppm) és Pb (3000-4000 ppm) esetében (4. táblázat). A jelen vizsgálatban az As és a Cd legnagyobb toleranciáját a BM1-ben találták, míg a legnagyobb Zn-toleranciát a BM2-ben figyelték meg, a BM3 pedig a Hg és a Pb felhalmozódásának maximumát mutatta. Vizsgálatunkban a legmérgezőbb fém (a legalacsonyabb MIC értékkel) a cd, míg a legkevésbé mérgező fém a Pb volt (4. táblázat).

MIC akkor volt megfigyelhető, amikor az izolátumok még 10 napos inkubáció után sem növekedtek a lemezeken.18 Mergeay és munkatársai19 több különböző fém minimális gátló koncentrációját (MIC) vizsgálták, és megállapították, hogy a legmérgezőbb fém (a legalacsonyabb MIC értékkel) a higany, míg a legkevésbé mérgező fém a mangán volt.19 A mikrobák toleranciáját az egyes nehézfém koncentrációknál a pohárvizsgálattal ábrázolták. A gátlási zóna átmérője minden egyes pohár körül nőtt a nehézfémek koncentrációjának növekedésével, ami a nehézfémeknek a mikroorganizmusok növekedésére gyakorolt toxikus hatását jelzi. A Barrackpore-i önkormányzat és a Dhapa hulladéklerakóhely összegyűjti Barrackpore város, illetve Kolkata város és a környező területek összes háztartási és ipari szilárd hulladékát. A háztartási és ipari forrásokból származó hulladék megfelelő környezet, ahol a mikroorganizmusok rezisztenciát fejleszthetnek ki a nehézfémekkel szemben. A szilárd hulladékban lévő kis mennyiségű nehézfémek jelenléte előidézheti a nehézfémeknek ellenálló mikroorganizmusok kialakulását. A nehézfémekkel szembeni mikrobiális rezisztencia a rezisztens mikroorganizmusok által kifejlesztett különféle méregtelenítő mechanizmusoknak tulajdonítható, mint például az exopoliszacharidok általi komplexképzés, a bakteriális sejtburkokhoz való kötődés, fémredukció, fémkiáramlás stb. Ezek a mechanizmusok néha plazmidgénekben vannak kódolva, ami megkönnyíti a toxikus fémekkel szembeni rezisztencia átadását egyik sejtről a másikra.20 A nehézfémekkel szemben rezisztens organizmusok potenciális ágensek lehetnek a nehézfémszennyezés biológiai helyreállításában. Mivel a nehézfémek mind hasonló toxikus mechanizmusúak, a többszörös fémtolerancia gyakori jelenség a nehézfém-rezisztens baktériumok körében.21

Antibiotikum-érzékenységi vizsgálat

Az antibiotikum-érzékenységi vizsgálat segít meghatározni, hogy egy antibiotikum mennyire hatékony a tesztorganizmus ellen. A 9 izolátumot négy antibiotikummal szembeni érzékenységét vizsgáltuk, és az eredményt feljegyeztük (5. táblázat). A legtöbb izolátum antimikrobiális vegyületeket termel, amelyek az orvostudományt szolgálhatják. A D1, D3 és D5 nem mutatott antimikrobiális aktivitást.

Antimikrobiális aktivitás vizsgálata

A legtöbb baktérium esetében általános jelenségnek tűnik az antimikrobiális vegyületek termelése. Jelen vizsgálatban 3 izolátum mutatott antibakteriális és 5 izolátum mutatott gombaellenes aktivitást, de 3 izolátum nem mutatott sem antibakteriális, sem gombaellenes aktivitást a kórokozókkal szemben. Az eredményt ábrázoltuk (6. táblázat). Hasonló vizsgálatról számoltak be Subramaniam és munkatársai.22 A Bacillus nemzetség tagjai számos antimikrobiális vegyületet termelnek, ezek közül sok peptidként, lipopeptidként és fenolszármazékként azonosított. Az utóbbi években egyre nagyobb figyelmet fordítanak a különböző biológiai aktivitással rendelkező új másodlagos anyagcseretermékek keresésére.

Extracelluláris enzimtermelés

A környezetvédelemmel kapcsolatos tudatosság növekedésével az enzimek, különösen az extremofilokból származó enzimek felhasználása jelentős figyelmet kapott számos ipari folyamatban. Az elmúlt években a mikrobiális enzimek felváltották a kémiai katalizátorokat a vegyi anyagok, textíliák, gyógyszerek, papír és élelmiszeripari mezőgazdasági vegyi anyagok gyártásában. Az enzimalapú ipari biofolyamatok ma már közvetlenül versenyeznek a bevett kémiai alapú eljárásokkal. Ebben a vizsgálatban azonban a 9 izolátumot minőségi vizsgálatnak vetették alá nyolc különböző enzim – proteáz, lecitináz, DNáz, lipáz, celluláz, amiláz, kataláz és oxidáz – termelésére. Hasonló vizsgálatról számolt be Subramani és Narayanasamy.23 Érdekes módon a mi vizsgálatunkban 6 közülük proteáz enzim termelését mutatta ki, amely magas piaci értékkel bír. Mind a 9 törzs termelt kataláz és oxidáz enzimet. Az eredményt feljegyeztük (7. táblázat).

Proteázok vizsgálata

6 törzs (BM1, BM3, D1, D3, C2 és C3) a 9 izolátum közül proteáztermelődést mutatott. A proteázt széles körben alkalmazzák az élelmiszeriparban, a mosószeriparban, a gyógyszeriparban, valamint a szilárd hulladék lebontásában, ezért a termelt proteáz mennyiségi vizsgálatát végeztük el. Meghatároztuk az így előállított proteáz enzim aktivitását, és az eredményt IU/ml-ben fejeztük ki. Az eredményt a 8. táblázat mutatja (8. táblázat). A proteáz mennyiségi vizsgálata változatlanul azt bizonyította, hogy a 6 törzs közül a BM1 magas titerértékkel termel proteázt, és a Gupta et al.,24 hasonlóan számolt be baktériumfajok alkáli proteáz termeléséről és annak ipari alkalmazásáról.

Az izolált baktériumok hulladéklebontási potenciálja

A proteáz enzim széleskörűen alkalmazható a hulladékok lebontásában. Ezért a 6 proteáz enzim termelésére képes törzset hulladéklebontási hatékonysági vizsgálatnak vetettük alá. Vizsgálatunkban megfigyelhető, hogy a BM1 rendelkezik a legnagyobb lebontási potenciállal, amelyet a BM3 követ. A BM1 szintén erős proteáz enzimtermelő, így jobb lebontási képességgel is rendelkezik (1. ábra). Ahogy a hulladékot a mikroorganizmusok (baktériumok) lebontják, az alom súlya csökken. A bomlás jelen vizsgálatában megfigyeltük, hogy a kezelt alom súlya csökkent, mert a baktériumok lebontották és egyszerű molekulákká alakították át. A hulladékminták súlyveszteségének százalékos aránya a bomlási folyamat előrehaladtával nőtt, amint az az 1. ábrán látható. Hasonló megfigyelésről számoltak be Zaved és társai,25 a szemét bizonyos baktériumok által Bangladesben okozott súlyvesztés vizsgálatáról. Vizsgálatunkban megfigyelhető, hogy a BM1 rendelkezik a legnagyobb bomlási potenciállal, amelyet a BM1 követ. Így a BM1 hatékonyan használható a szilárd hulladékok bioremediációjára.