Mi az egymolekulás valós idejű (SMRT) szekvenálás?

By Dr. Maho Yokoyama, Ph.D.Reviewed by Christian Zerfaß, Ph.D.

Skip to:

• How does SMRT Sequencing Work?
• Studying DNA Methylation in Bacteria; an Application of SMRT Sequencing

A DNS-szekvenálás úgy működik, hogy a DNS-polimeráz segítségével nukleotidokat adunk a sablonhoz. A DNS-szekvenáláshoz többféle technológia áll rendelkezésre. Ilyen például a Single-Molecule Real-Time sequencing vagy SMRT szekvenálás.

Kutató vizsgálja a DNS-szekvencia átlátszó diáját. Credit: Shawn Hempel /

Hogyan működik az SMRT szekvenálás?

A többi DNS-szekvenálási technológiához hasonlóan a DNS kivonása után az első lépés a “könyvtár” elkészítése. Ez a folyamat előkészíti a DNS-t a szekvenálásra; ebben az esetben adaptorokat adnak a kétszálú DNS-molekula mindkét végéhez, ami gyakorlatilag lehetővé teszi, hogy a DNS egyszálú, körkörös templát legyen. Ez aztán azt jelenti, hogy a DNS folyamatosan szekvenálható.

Ezt a DNS-könyvtárat, vagyis a sablon DNS-t ezután egy olyan DNS-szekvenálóba helyezik, amely “null-módú hullámvezetőket” tartalmaz, amelyek egyik végére DNS-polimeráz van immobilizálva. Ezután egyetlen DNS-molekulát immobilizálnak ezekbe a null-módú hullámvezetőkbe, és a DNS-polimeráz elkezd új nukleotidokat hozzáadni egy de novo szintetizált DNS-szálhoz, amely komplementer a sablon DNS-hez. Az ezekben a nukleotidokban lévő bázisokat megjelölik, és ezeknek a bázisoknak a beépülése a növekvő DNS-szálba fénykibocsátást okoz. Ez a fénykibocsátás ezután valós időben leolvasható, és mivel az egyes bázisok kibocsátása eltérő, ez lehetővé teszi az adott bázis azonosítását.

Az SMRT-szekvenálás fő előnye a hosszú, nagy pontosságú szekvenálási olvasatok előállítása, ami javítja a teljes genomok összeállítását. Ennek oka, hogy a hosszabb szekvenálási olvasatok miatt kevesebb “építésre” van szükség a genom összerakásához.

A DNS-metiláció vizsgálata baktériumokban; az SMRT szekvenálás alkalmazása

Mi a DNS-metiláció?

A metilcsoport hozzáadása a DNS-hez, más néven metiláció, az élet minden királyságában előfordul. A baktériumokban három metilált nukleotid van jelen: m5C (C5-metil-citozin, amely az eukariótákban is jelen van), m6A (N6-metil-adenin) és m4C (N4-metil-citozin, amely csak a baktériumokban fordul elő). A metilálás az új DNS-szálak szintézise után következik be, és meghatározott nukleotidoknál történik.

A metilcsoportok kilógnak a DNS kettős spiráljából, és ezért befolyásolhatják a DNS és a DNS-kötő fehérjék közötti kötődést. Ez pedig olyan folyamatokat befolyásol, mint a kromoszóma-replikáció, a DNS-hibajavítás, valamint a génátírás időzítése és az epigenetikai vonalak kialakulása.

Epigenetikai mechanizmusok: a dna metilációja vagy acetilációja aktiválhatja vagy sem a génátírást. Image Credit: ellepigrafica /

Miért fontos a DNS-metiláció a baktériumokban?

A baktériumokat vírusok fertőzik, ezért a vírusfertőzések legyőzéséhez védőmechanizmusra van szükségük. Itt jönnek a képbe a restrikciós-módosító rendszerek; ez a rendszer egy restrikciós enzimből, amely a DNS-t meghatározott helyeken lebontja, és egy DNS-metiltranszferázból áll, amely metilcsoportot ad az adeninhez (A) vagy a citozinhoz (C).

A legtöbb restrikciós-módosító rendszerben a DNS-metiltranszferáz úgy működik, hogy megvédi a bakteriális DNS-t a restrikciós enzimtől. A DNS-metiltranszferáz jelenléte azt jelenti, hogy a bakteriális DNS metilálódik, míg a fertőző vírus-DNS nem. Ez viszont azt jelenti, hogy a vírus-DNS-t a restrikciós enzim lebontja, míg a bakteriális DNS védett, mivel a restrikciós enzim nem hat a metilált DNS-re. Meg kell azonban jegyezni, hogy léteznek olyan restrikciós enzimek, amelyek módosított DNS-re hatnak.

A legújabb vizsgálatok arra utalnak, hogy a restrikciós-módosító rendszereknek további szerepe is lehet. Például bizonyos restrikciós-modifikációs rendszerek kiiktatása a génexpresszió megváltozását eredményezte, ami a DNS-metiláció különbségéhez kapcsolódik. A restrikciós-módosító rendszerek kettősszálú töréseket és C-T mutációkat is okozhatnak, ezáltal befolyásolhatják a baktériumok evolúcióját. Újabban olyan technológiákat fejlesztettek ki, amelyek képesek meghatározni a teljes bakteriális genom metilációját, amelyet “metilomnak” nevezünk.

Hogyan lehet meghatározni a metilomot SMRT-szekvenálással?

Mivel az SMRT-szekvenálás valós idejű eredményeket ad, a DNS-módosítások, köztük a metilációk kimutatására is használható. A DNS-polimeráz állandó sebességgel építi be a nukleotidokat, de ez a sebesség megváltozhat, ha a templátban lévő nukleotidot módosították. Ez a szekvenálás során észlelhető.

Blow at al. az SMRT-szekvenálást 230 mikroorganizmus DNS-módosításainak feltérképezésére használta. Az általuk keresett módosítások közé tartozott az m5C, az m6A és az m4C. A szerzők azt találták, hogy e mikroorganizmusok 93%-a mutatott DNS-metilációt, és 834 olyan motívumot is találtak, amelyek metiláltak voltak. Ez lehetővé tette a szerzők számára, hogy azonosítsák, mely motívumok a 620 DNS-metiltranszferáz célpontjai.

A szerzők érdekes módon megjegyezték, hogy míg a vizsgált organizmusok 48%-a rendelkezett DNS-metiltranszferázzal, nem volt bizonyíték arra, hogy restrikciós enzim is jelen van. Ezért lehetséges, hogy a DNS-metiláció fontos szerepet játszik a genom szabályozásában, vagy más fontos szerepet játszik a mikroorganizmusokban, amelyet még nem azonosítottak.

Further Reading

• All DNA Sequencing Content
• DNS szekvenálás
• DNS szekvencia összeállítás
• DNS microarray
• High-throughput DNA Sequencing Techniques

Az író

Dr. Maho Yokoyama

Dr. Maho Yokoyama kutató és tudományos író. Doktori fokozatát az Egyesült Királyságban, a Bath-i Egyetemen szerezte mikrobiológiai szakdolgozatát követően, ahol a funkcionális genomikát alkalmazta a Staphylococcus aureusra . Doktori tanulmányai során Maho számos tanulmányon dolgozott együtt más tudósokkal, sőt néhány saját munkáját is publikálta lektorált tudományos folyóiratokban. Munkáját világszerte tudományos konferenciákon is bemutatta.

Hivatkozások