Könyvespolc

Korrekciós faktorok és felismerő jelek

Az enzimpótló terápia modellrendszere a mukopoliszacharid tárolási betegségben (MPS) szenvedő betegekből származó, tenyésztett bőrfibroblasztok tanulmányozásával jött létre. Az ilyen fibroblasztok a glikozaminoglikánok túlzott felhalmozódását mutatták, amit úgy értelmeztek, hogy ezeknek a makromolekuláknak a nem megfelelő lebontása miatt van . Véletlenül fedezték fel, hogy az MPS I (Hurler-szindróma) és MPS II (Hunter-szindróma) betegekből származó fibroblasztok keveréke normális glikozaminoglikán anyagcsere-mintázatot mutat (1. ábra) . A két betegségről ismert volt, hogy genetikailag különbözik egymástól , az MPS I autoszomális recesszív módon öröklődik, míg az MPS II X-kapcsolódó rendellenesség, ami Fratantoni és munkatársait arra a feltételezésre vezette, hogy a különböző genotípusú fibroblasztok egymásnak szolgáltatják a hiányzó génterméket. További vizsgálatok kimutatták, hogy az ilyen keresztkorrekcióhoz nem szükséges, hogy a genetikailag különböző sejtek érintkezzenek egymással, mivel az egyik által kondicionált közeg korrigálhatja a másikat. A keresztkorrekció stratégiáját ki lehetett terjeszteni a rokon betegségekre – az egymást korrigáló sejtek eltérő genotípussal rendelkeznének, míg a keresztkorrekciót nem végző sejtek azonos genotípussal (de lásd alább a fontos kivételt).

Mivel a Hurler-szindrómát az érintett betegek drámaian megduzzadt májlizoszómáinak megfigyelése alapján lizoszomális tárolási betegségként aposztrofálták , Fratantoni és munkatársai feltételezték, hogy a kondicionált médiumban lévő “korrekciós faktorok” olyan lizoszomális enzimek lehetnek, amelyeket az egyik sejtvonal szekretált, a másik pedig endocitált. A korrekciós faktorok azonban nem feleltek meg egyetlen akkor ismert lizoszómális enzimnek sem (ez a helyzet néhány évvel később megváltozott, amikor felfedezték a β-glükuronidáz hiányos MPS-t ). A Hurler- és Hunter-korrekciós faktorok tisztítását nem kondicionált táptalajból, hanem vizeletből, a lizoszómális enzimekben viszonylag gazdag testfolyadékból végezték el. A tisztított faktorok funkcióját különböző biokémiai módszerek alkalmazásával rendelték hozzá, aminek eredményeként a Hurler- és Hunter-korrekciós faktorokat α-l-iduronidáznak, illetve iduronát-szulfatáznak nevezték el .

A glikozaminoglikán anyagcseréjük normalizálásához Hurler-korrekciós faktort igénylő sejtek (Hurler-szindrómás és Scheie-szindrómás betegekből ) α-l-iduronidáz aktivitása is hiányos volt ). A Hurler-fibroblasztok korrekcióját az α-l-iduronidáz felvétele kísérte. Az enzimpótló terápia jó előjeleként a felvétel figyelemre méltóan hatékony volt, és csak nagyon kis mennyiségű α-l-iduronidázt kellett internalizálni a teljes korrekcióhoz.

Ez lehetett volna a történet vége, kivéve egy kis eltérést az enzimaktivitás és a korrekciós aktivitás elúciós mintázatában egy hidroxiapatit oszlopból , ami arra utal, hogy a Hurler korrekciós faktor két aktivitása nem pontosan azonos. Ezt az eltérést követve Shapiro és munkatársai egy heparin-szefaróz oszlopon az α-l-iduronidázt korrekciós és nem korrekciós frakciókra választották szét, ami arra utal, hogy a korrekciós faktornak van valamilyen olyan tulajdonsága, amely nem szükséges a katalitikus aktivitáshoz, de szükséges a felvételhez. Hasonlóképpen, a β-glükuronidáz többféle formáját találták, amelyek a felvétel és a korrekciós aktivitás tekintetében különböztek .

A lizoszomális enzim felvételére vonatkozó specifikus jel létezését egy újonnan felfedezett, az MPS-hez hasonló rendellenességgel kapcsolatos vizsgálat eredményei sugallták, amelyet a tenyésztett fibroblasztokban előforduló feltűnő fázissűrű zárványok miatt zárványsejt-kórnak (I-sejt-kór) neveztek el . Míg ezek a fibroblasztok többszörös lizoszómális enzimhiányban szenvedtek, az őket körülvevő közeg nagy feleslegben tartalmazott lizoszómális enzimeket . Az I-sejtes betegségben szenvedő fibroblasztok által szekretált enzimeket azonban más sejtek nem endocitálták, és nem voltak korrekciósak; feltehetően hiányzott a lizoszómákba való felvételhez szükséges jel . Mivel számos lizoszómális enzimet érintett ez az egyetlen génhiba (az I-sejtes betegség autoszomális recesszív módon öröklődik), azt feltételezték, hogy a jel az enzimfehérjék poszttranszlációs módosulása. Továbbá azt is feltételezték, hogy szénhidrát jellegű, mivel enyhe periodátkezeléssel elpusztítható. A szénhidrátokon alapuló felismerési rendszer koncepciójára nagy hatással voltak Ashwell és munkatársainak felfedezései a szénhidrátoknak a keringő glikoproteinek máj általi felvételében játszott szerepéről .

A specifikus felismerhető jel jelenléte telíthető, receptor által közvetített folyamatot feltételezett, és azt sugallta, hogy a lizoszomális enzimek felvétele Michaelis-Menten kinetikát követ. Várható volt, hogy a felismerő jelek analógjai a felvétel kompetitív gátlóiként viselkednek. Ezt a várakozást az α-l-iduronidáz és a β-glükuronidáz megfelelő hiányos fibroblasztok általi felvételén keresztül vizsgáltuk. Kaplan és munkatársai felfedezése, miszerint a β-glükuronidáz felvételének legjobb gátlója a mannóz-6-foszfát (M6P), és az a feltételezésük, hogy az M6P a régóta keresett felismerő jel (vagy annak része), megdöbbentő volt, mivel korábban nem jelentettek foszforilált szénhidrátot emlős glikoproteineken. Ezt azonnal megerősítették az α-l-iduronidáz és más lizoszómális enzimek felvételére vonatkozóan, különböző biokémiai módszerekkel ; a végső bizonyítékot a foszforilált szénhidrátcsoportok szerkezeti elemzése szolgáltatta . Az endocitózison keresztül felfedezett jel bizonyult a naszcens hidrolázok lizoszómákba történő célba juttatásának jelének is .

Az I-sejtes betegségben előforduló hiba, amely megakadályozza, hogy a sejtek szintetizálják az M6P felismerő jelet, az M6P jel szintézisében részt vevő két enzim közül az első hiányosságának bizonyult . Két M6P-receptort fedeztek fel; az M6P-receptorok kémiája és biológiája, valamint a sejtforgalomban betöltött szerepük a sejtbiológia széles és igen aktív területévé vált . Ezek a témák számos áttekintés tárgyát képezik, beleértve e kötet 3. és 5. fejezetét is. Az M6P rendszer jelentőségét az enzimpótló terápia szempontjából az alábbiakban tárgyaljuk.

A tenyésztett fibroblasztokon végzett e vizsgálatokkal egyidejűleg egy in vivo rendszerben a lizoszomális enzimek felvételének egy másik jelét is megtalálták. Számos lizoszomális enzimről megállapították, hogy patkányoknak intravénásan beadva gyorsan kiürülnek a keringésből; azonban sokkal tovább fennmaradtak, ha periodáttal előkezelték őket, vagy ha agalaktoglikoproteinnel együtt adták be őket . Ismét azt feltételezték, hogy a szénhidrátok jeleket szolgáltatnak a specifikus felismeréshez. Ebben az esetben a felismerés kulcscukra a mannóz volt, és a felszívódás a máj retikuloendothelialis sejtjeibe történt. Kimutatták, hogy a mannózreceptor, amely a mannóz mellett az N-acetilglükózamint és az l-fukózt is felismeri, a makrofágok felszínén fordul elő. Történelmi jelentőségű, hogy az invertáz felvételi kísérletek, amelyek az enzimpótló terápia eredeti javaslatában (lásd fentebb ) kiemelkedő szerepet játszottak, azért voltak sikeresek, mert az invertáz egy olyan glikoprotein, amelynek mannánláncai felismerhetők a mannózreceptor által .

.