Eredmények
Rapid ATP Binding to GroEL as Revealed by Fluorescence Intensity Changes of GroEL F44C Labeled with Oregon Green 488.
A GroEL ATP-hez való kötődésének nyomon követéséhez egy korábban előállított GroEL-változatra, az F44C-re támaszkodtunk, amely egyetlen ciszteint tartalmaz a GroEL egyébként “cisztein-nulla” változatában, amelyben a GroEL alegység mindhárom természetes ciszteinjét (138, 458 és 519 aminosav) alaninnal helyettesítettük (21). Amint az 1A. ábrán látható, az F44 egy hurokban helyezkedik el, amely felfelé mutat a GroEL központi üregébe, az ekvatoriális domén szintjén, az ekvatoriális antiparallel β-szálak között helyezkedik el, amelyeknek a végei közelében olyan maradékok vannak, amelyek hidrogénkötéses kapcsolatot képeznek a kötött ATP terminális foszfátjával egy vízmolekulán és egy káliumionon keresztül. A hurok és a 44-es maradék tehát úgy van elrendezve, hogy az ATP hiánya vagy jelenléte befolyásolja. Egy korábbi tanulmány arról számolt be, hogy az F44W szubsztitúció hatással lehet az ATP-kötésre (16). Itt az F44C mutánst használtuk, amelyről korábban azt figyeltük meg, hogy teljesen működőképes, amit az is jelez, hogy a kódoló plazmid képes volt megmenteni egy GroEL-hiányos mutáns növekedését, és a tisztított fehérje képes volt hatékony ATP/GroES-függő fehérje-visszahajtogatást végezni in vitro (21). Az F44C-t Oregon Green 488 (OG488)-maleimiddel jelöltük ≈70%-os foglaltsági szintig. Teljesen működőképes maradt a malát-dehidrogenáz (MDH) in vitro visszaalakításának közvetítésében, kinetikája közel azonos volt a WT GroEL kinetikájával. A módosított, EL44-OG-nak nevezett mutáns ATP-forgalom állandósult sebessége szintén hasonlított a WT GroEL-éhez (S1B ábra).
Az ATP gyorsan kötődik a kötés nélküli GroEL-hez és a GroEL/GroES/ADP komplex transz gyűrűjéhez. (A) A GroEL/GroES/ADP/AlFx komplexben (hivatkozás 24; PDB ID kód: 1PCQ) lévő 1 GroEL alegység ekvatoriális doménjének egy részének szalagdiagramja, amely az F44 helyzetét mutatja. (B) Az EL44-OG önmagában (fekete nyomvonal), 500 μM ADP-vel keverve (zöld) és 500 μM ATP-vel keverve (piros) emissziós spektrumai. A gerjesztés 496 nm-en történt. (C) Az EL44-OG fluoreszcenciájának változása az ATP-vel való keverés leállításakor. A nyomvonal 2 exponenciális összegeként illeszthető (fehér vonal) a feltüntetett sebességállandókkal. Az ábrán az OG (zöld) az egyenlítői tartományokban látható. (D) A gyorsabb fluoreszcencia-változási sebesség függése az ATP-koncentrációtól. A C-ben (fekete) és E-ben (piros) különböző ATP-koncentrációknál végzett kísérletekből származó sebességállandók az ATP-koncentráció függvényében ábrázolva, egyeneseket adnak, amelyek meredeksége megegyezik a megfelelő másodrendű ATP-kötési sebességállandókkal, amint az látható. (E) Az EL44-OG/GroES/ADP komplex fluoreszcenciájának változása ATP-vel történő megállított keveréskor. A D az ADP-t a cisz-gyűrűben ábrázolja, a GroES szürke színű, az ATP (piros) pedig a gyűrű mellett látható, amelyhez kötődik. (F) Mint az E-ben, kivéve a kötés nélküli EL44-OG-t. (G) Mint az E-ben, de a transz gyűrűhöz kötött MDH-val, amelyet az ábrán kék vonalként ábrázolunk. (H) Az E-ben leállított áramlású keverési kísérlethez hasonló, kivéve, hogy a komplexben lévő GroEL-t OG-vel jelöltük a 315-ös pozícióban, az apikális domének külső oldalán. Itt a nyomvonal egyetlen exponenciálisként illeszthető a jelzett sebességgel. (I) Megállított áramlási kísérlet a GroEL egygyűrűs változatával, az SR1-gyel, amelyet OG-val jelöltek a 315-ös pozícióban helyettesített ciszteinnel (a sebességek és amplitúdók összefoglalását lásd az S1 táblázatban.)
Az EL44-OG (496 nm-en gerjesztett) fluoreszcencia emissziós spektrumai azt mutatták, hogy ATP hozzáadása az állandósult állapotú fluoreszcencia intenzitásának nagymértékű csökkenését eredményezte (≈65% 500 μM ATP esetén), amit az emissziós maximum kis mértékű kék eltolódása kísért (1B. ábra). Ezzel szemben az ADP kisebb intenzitáscsökkenést okozott, ami alátámasztja, hogy az ATP γ-foszfátjának specifikus hatása van a 44-et tartalmazó hurok konformációjára.
A 0,5 mM ATP és az EL44-OG megállított áramlású keverésénél az emissziós intenzitás gyors csökkenése volt megfigyelhető, amelynek görbéje 2 exponenciális összegeként illeszthető, az egyik ≈100 s-1, a másik 4 s-1 sebességállandóval (1C ábra). Az előbbi sebesség az ATP gyors kölcsönhatását jelzi a nem ligandummal rendelkező GroEL-lel, és megfelel a korábban jelentett sebességeknek mind az F44W (hivatkozás 16; 80 ± 5 s-1), mind a GroEL 2 másik triptofán-szubsztituált változata esetében: Y485W, ahol egy triptofánt máshol helyettesítettek az ekvatoriális doménben (hivatkozás 16). 18; 123 ± 2 s-1), és R231W (hivatkozás 17; 80 s-1), ahol egy triptofánt helyettesítettek az apikális domén üreg felé néző részében (a GroEL egyébként nem tartalmaz triptofánt). A várakozásoknak megfelelően az ATP és az EL44-OG kölcsönhatásának sebessége az ATP koncentrációjától függött (1D. ábra), és a gyorsabb fázisban 2 × 105 M-1 s-1 bimolekuláris sebességi állandót határoztunk meg. A lassabb kinetikai fázis, amely szintén az ATP-koncentrációtól függ, valószínűleg megfelel a GroEL R231W és Y485W esetében ATP-kötéskor megfigyelt harmadik fluoreszcens fázisnak (17, 18). Azt a lehetőséget, hogy ez a fázis az ATP-hidrolízist tükrözi, egy hidrolízis-defektív D398A/EL44-OG chaperonin alkalmazásával kizártuk.
Egyenletesen gyors fluoreszcencia-változás a GroEL/GroES/ADP aszimmetrikus komplex nyitott transz-gyűrűjéhez történő ATP-kötéskor.
Fiziológiai körülmények között az ATP normál akceptorállapota a GroEL/GroES/ADP aszimmetrikus komplex nyitott transz-gyűrűje. Megállított áramlású keveréssel megfigyeltük, hogy az EL44-OG/GroES/ADP komplexek transz gyűrűjéhez való ATP-kötés sebessége hasonló volt, mint a nem ligált GroEL-gyűrűhöz (1E ábra, vö. 1F ábra). Itt is volt ATP-koncentráció-függés, amely hasonlított a ligandum nélküli EL44-OG-hoz (1D ábra).
A transz gyűrűhöz kötött szubsztrát polipeptid nem befolyásolja az ATP-kötés sebességét.
Számos in vitro vizsgálatban a nem-natív polipeptidet először egy aszimmetrikus ADP GroEL/GroES komplex nyitott transz gyűrűjéhez komplexálták ATP és felesleges GroES hozzáadása előtt (8, 9). Ilyen körülmények között az ATP-kötés és az azt követő GroES-kötés egyértelműen képes a nonnatív polipeptid bekapszulázására és a produktív hajtogatás irányítására. Befolyásolja-e az ATP-kötés sebességét ilyen körülmények között a megkötött szubsztrátfehérje? Ennek vizsgálatához aszimmetrikus EL44-OG/GroES/ADP-komplexekhez kötöttük a nonnatív MDH-t, majd megállított áramlású keverés mellett ATP-t adtunk hozzá. Ilyen körülmények között a fluoreszcencia-intenzitás változásának sebessége gyakorlatilag megegyezett a polipeptid nélküli EL44-OG/GroES/ADP-komplexekével (vö. 1G ábra és 1E ábra). Így a transzgyűrűs apikális doménekhez kötött nem-natív szubsztrát jelenléte nincs kimutatható hatással az ATP gyors belépésére a transzgyűrűs ekvatoriális nukleotidkötő zsebekbe.
A gyors apikális domén mozgás az ATP-kötést kíséri.
Amikor az ATP gyorsan kötődik a GroEL-hez, ez ugyanilyen gyors időskálán jelentős kiigazítást okoz az apikális polipeptidkötő doménekben, vagy az ATP-kötésre válaszul bekövetkező apikális változások viszonylag lassúak, így az ATP-kötés hatásait egy későbbi időpontban bekövetkezőnek kell tekinteni? Az R231W korábbi vizsgálata már jelezte, hogy az apikális hatások gyorsan jelentkeznek ennél a mutánsnál (17). A jelen vizsgálatban is az apikális domének külső oldalán, a henger belsejében lévő ATP-kötőhelytől távol eső fluoreszcens szonda (GroEL E315C cisztein-nulla háttérben, OG-val jelölve) gyors változást mutatott a fluoreszcencia intenzitásában, az ATP-kötéssel azonos időskálán. Például a GroEL315-OG/GroES/GroES/ADP aszimmetrikus komplex esetében 150 μM ATP-koncentráció mellett 20 s-1 sebességállandó volt megfigyelhető (1H ábra, vö. az 1E ábrán látható 25 s-1 értékkel). Az ilyen apikális változások ugyanabban a gyűrűben következtek be, amelyhez az ATP kötődik, mivel az E315C OG-módosított egygyűrűs változatának, az SR315-OG-nak az elemzése hasonló fluoreszcencia-intenzitás-változási sebességet mutatott (1I. ábra). Az apikális mozgás sebessége szintén ATP-koncentráció-függő volt, a sebességek párhuzamosak voltak az ATP-kötés sebességével (S2. ábra, vö. 1D. ábra).
A szubsztrát polipeptid viszonylag lassú kötődése FRET-tel mérve.
Azért, hogy a nem-natív szubsztrát polipeptid megkötésének sebességét össze tudjuk hasonlítani az ATP megkötésének sebességével, ezután FRET segítségével mértük a szubsztrát fehérjék aszimmetrikus GroEL/GroES/ADP komplexekhez való kötődésének sebességét. Három különböző szubsztrátfehérjét vizsgáltunk: MDH (33 kDa), Rubisco (51 kDa) és a maltózkötő fehérje kettős mutáns formája (DM-MBP; 41 kDa). Mindhárom fehérje 25 °C-on szigorú szubsztrátfehérjeként viselkedik, a natív forma eléréséhez GroEL, GroES és ATP jelenlétére van szükség (3). Ezek hiányában mennyiségi aggregáció következik be. A kötődés nyomon követéséhez FRET-et mértünk egy cisztein-maradékon kumarin-propil-maleimiddel (CPM; donor) jelölt szubsztrátfehérje (lásd Anyagok és módszerek) és az EL44-OG (akceptor) között. A CPM gerjesztési maximumán (384 nm) gerjesztve emissziós spektrumokat gyűjtöttünk a CPM-mel (donor) jelölt szubsztrátokra, miközben nem jelölt GroEL-hez kötődtek (2A. ábra, DM-MBP-CPM mint példa, fekete nyomvonal), a nem jelölt szubsztráttal komplexált EL44-OG-ra (2A. ábra, akceptorral jelölt, kék nyomvonal), vagy az EL44-OG-hoz kötött CPM-mel jelölt szubsztrát komplexekre (2A. ábra, piros nyomvonal). Mind a DM-MBP-CPM, mind az MDH-CPM esetében az EL44-OG-gal való társuláskor erős donor-kioltás volt tapasztalható; ugyanakkor jelentős akceptorjel jelent meg.
Viszonylag lassú kötődése egy nem-natív szubsztrátnak, a DM-MBP-nek a nem ligált GroEL-hez és a GroEL/GroES/ADP komplex transz gyűrűjéhez. (A) A CPM-mel jelölt DM-MBP (donor) emissziós spektruma a GroEL-hez kötődve (D, fekete nyomvonal), az EL44-OG (akceptor) emissziós spektruma a nem-natív DM-MBP-vel komplexálva (A, kék nyomvonal), valamint a DM-MBP-CPM és az EL44-OG komplex emissziós spektruma (D-A, piros nyomvonal), mindegyiket 384 nm-en, a CPM gerjesztési maximumán gerjesztve. (B) A donorcsatorna fluoreszcenciájának változása a nem-natív DM-MBP-CPM és EL44-OG megállított áramlású keverésekor. A kék vonal a nem-natív DM-MBP-t, a sárga körben lévő D pedig a CPM jelölést jelöli. (C) A DM-MBP kötődés gyorsabb sebességi állandójának függése a GroEL koncentrációtól. A B-hez hasonló, különböző GroEL-koncentrációkkal végzett kísérletekből (fekete) vagy a GroEL/GroES/ADP-komplexszel végzett hasonló kísérletekből (piros) származó sebességállandókat ábrázoltuk a GroEL-koncentráció függvényében, ami 6,11 × 106 M-1s-1 és 5,36 × 106 M-1s-1 meredekségű egyeneseket (másodrendű sebességállandók) eredményez. (D) A donor fluoreszcencia változása a nem-natív DM-MBP-CPM EL44-OG/GroES/ADP komplex és 500 μM ATP megállított áramlású keverésekor. Több kísérletben (n = 6) a gyorsabb fázis sebessége következetesen kissé gyorsabb volt a transz gyűrű esetében ATP jelenlétében, mint annak hiányában: 2,08 ± 0,11 vs. 1,36 ± 0,22 (S2 táblázat).
125 nM DM-MBP-CPM 125 nM EL44-OG-val történő stop-flow keverésénél a donor emisszió intenzitásának csökkenése volt megfigyelhető, amelynek görbéje 2 exponenciális összegeként illeszthető, az egyik 1,33 s-1 sebességállandóval, a másik 0,65 s-1 sebességállandóval (2B ábra). A gyorsabb sebesség (k1) függött a chaperonin koncentrációjától (2C. ábra), a lassabb viszont nem. 125 nM GroEL-koncentráció mellett (2B. ábra) a szubsztrát polipeptid megkötésének sebessége (k1 = 1,33 s-1) 60-szor lassabb, mint az ATP-kötés sebessége (100 s-1 500 μM ATP mellett; 1C. ábra). Bár a szubsztrátkötés sebessége 1-2 μM fiziológiás GroEL-koncentráció mellett többszöröse lenne az előrejelzések szerint (2C ábra), az ATP-kötés sebessége valószínűleg szintén valamivel nagyobb lenne, figyelembe véve, hogy a fiziológiás ATP-koncentráció több millimoláris (1D ábra). Így az ATP beérkezési sebessége fiziológiás körülmények között valószínűleg legalább 10-szer nagyobb, mint a szubsztrát beérkezési sebessége.
Egy további vizsgálatban az ATP hozzáadása a fluoreszcensen jelölt DM-MBP-vel egyidejűleg reprodukálhatóan növelte a DM-MBP kötési sebességét (2D ábra és S2. táblázat). Összefoglalva, úgy tűnik, hogy a transzgyűrűhöz való adalékolás fiziológiai sorrendje az ATP gyors érkezését, majd a szubsztrátfehérje lassabb érkezését foglalja magában. Ez a sorrend ellentétes a közelmúltbeli vizsgálatokban programozottal, ahol a polipeptidet először a transz gyűrűhöz kötötték, majd ATP-t adtak hozzá (8, 9). Van-e a hozzáadás sorrendjének mérhető hatása a szubsztrátfehérje visszahajlítására? Ennek tesztelésére adalékolási sorrend-kísérleteket végeztünk, és a natív enzim helyreállítását mértük lényegében egyszeri fordulatos körülmények között.
A natív állapot nagyobb mértékű helyreállítása, ha először ATP-t, majd polipeptidet adunk hozzá, az ellentétes sorrenddel összehasonlítva.
A GroEL egygyűrűs változatával, az SR1-gyel végeztünk adalékolási sorrend-kísérletet, amely lehetővé teszi az “egykörös” elemzést. Az SR1 által befogott polipeptid a GroES megkötése után, a stabil SR1/GroES komplex hosszú élettartamú cisz-üregében szinte kvantitatív módon natív formába hajtódik (10, 11). Így az SR1-et ATP-vel és nem-natív polipeptiddel bármelyik sorrendben inkubálhattuk, majd GroES hozzáadásával, és a natív fehérje visszanyerésének mértékét mind a hozzáadás sorrendjével, mind a hozzáadások közötti intervallummal összefüggésben mérhettük (3A. ábra). E vizsgálatokhoz a GroES-t 2 másodperccel az ATP/polipeptid után adtuk hozzá, hogy a kezdeti kölcsönhatások befejeződhessenek. Egy első kísérletben reprodukálhatóan megfigyeltük, hogy amikor először nem-natív Rubisco-t adtunk hozzá, majd 2 másodperccel később ATP-t, a Rubisco natív formában történő helyreállításának mértéke csak ≈30% volt. Ez összehasonlítható a >60%-os helyreállással, amikor először ATP-t adtunk hozzá, és a ≈70%-os helyreállással, amelyet akkor figyeltünk meg, amikor ATP-t és GroES-t adtunk egy előre kialakított Rubisco-SR1 bináris komplexhez (amelyet a nonnatív Rubisco és SR1 10 perces inkubációjával állítottunk elő). Ez arra utal, hogy egy olyan ciklikus reakció kontextusában, amelyben az akceptor GroEL/GroES/ADP komplex transz gyűrűje nyitott és csak ≈1-2 s-ig áll rendelkezésre a polipeptid megkötésére, mielőtt a GroES megkötődik, az apikális doménjeinek gyors ATP-kötés általi mobilizálása kedvez a nonnatív polipeptid megkötésének. Az ellentétes sorrend, a polipeptid hozzáadása 2 s-mal az ATP előtt, kevésbé tűnt kedvezőnek a kötődés szempontjából, még akkor is, ha az ATP-mobilizált apikális domének ezt követően 2 s-mal a GroES hozzáadása előtt rendelkezésre álltak. Figyelemre méltó, hogy amikor a Rubisco és az ATP hozzáadása közötti intervallumot 4 s-ra növeltük (3A. ábra), a hozzáadás sorrendjének hatása megszűnt, a kinetika és a helyreállás mértéke megegyezett az ATP első hozzáadásának kinetikájával, ami feltehetően az ATP hozzáadása előtti intervallumban történő kiterjedtebb polipeptid-kötés függvénye. Bár a Rubisco regenerálódásának mértéke a 2 s-os intervallumú adalékolási sorrenddel végzett vizsgálatokban jelentősen megváltozott, a stabil SR1/GroES-komplexek belsejében a natív állapot helyreállításának kinetikája hasonló volt, ami a szubsztrátfehérje kötődésére és nem a kapszulázott kamrában történő hajtogatás sebességére gyakorolt hatásnak felel meg.
A nonnatív Rubisco előtti ATP-kötés a kötés mértékének és sebességének növelésével javítja a hajtogatási hozamot. (A) A Rubisco aktivitásának helyreállítása különböző adalékolási sorrendekkel. Az SR1-et ATP-vel inkubáltuk 2 vagy 4 s-ig, mielőtt nonnatív Rubisco-t (dRUB) adtunk volna hozzá; alternatívaként először nonnatív Rubisco-t adtunk az SR1-hez, majd 2 vagy 4 s múlva ATP-t. Mindkét sorrendben 2 másodperccel később GroES-t adtunk hozzá, és a Rubisco-aktivitás vizsgálatához a megadott időpontokban aliquotokat távolítottunk el. Az összehasonlítás érdekében egy “standard” Rubisco újraképződési vizsgálatot végeztünk úgy, hogy az SR1-et 10 percig inkubáltuk nem-natív Rubisco-val, mielőtt ATP-t és GroES-t adtunk volna hozzá az újraképződés elindításához (fekete szimbólumok). (B) A 35S-Rubisco SR1-hez való kötődésének mértéke különböző adalékolási sorrendek esetén. A kísérleteket az A-ban leírt különböző adalékolási sorrendekkel végeztük, azzal a különbséggel, hogy a GroES, majd az ADP-AlFx hozzáadása után (a terner komplex stabilizálása érdekében) az elegyeket Superose 6 oszlopon kromatografáltuk, és meghatároztuk a frakciók radioaktivitását. Az SR1/GroES/ADP-AlFx/Rubisco komplex elúciós pozíciójában visszanyert teljes radioaktivitás az oszlopra töltött radioaktivitás százalékában van megadva. Azonos, 4 s-os időközökkel végzett elemzések során mindkét adalékolási sorrend ≈70%-os visszanyerést eredményezett, ami megfelel az A aktivitás visszanyerésének (nem látható). (C) A Rubisco kötődési sebessége egy SR1 gyűrűhöz ATP hiányában, FRET segítségével mérve. A Rubisco-CPM donor fluoreszcenciája egy hidrolízis-defektív SR1 D398A molekulával történő stop-flow keverés után, amely az OG fluorofort hordozza egy szubsztituált Cys-44-en. (D) A Rubisco SR398A-hoz való kötődésének sebessége ATP jelenlétében (amelyet a megállított áramlású fecskendőbe töltés előtt adtak hozzá). (E) A Rubisco kötődésének sebessége egy SR398A gyűrűhöz, ha azt ATP-vel egyidejűleg adjuk hozzá.
A Rubisco kiterjedtebb kötődése, ha először ATP-t adunk hozzá.
A hozzáadás sorrendjének a szubsztrátfehérje kötődésére gyakorolt hatásának vizsgálatához 35S-jelölt Rubisco-t használtunk, és a végtermék-keverékek gélszűrésével mértük a stabil SR1/GroES/Rubisco-komplexek és a nem kötött polipeptidek szétválasztásához a hozzáadás sorrendjében végzett inkubációk során az SR1 által kötötté vált mennyiséget. Ez azt mutatta, hogy ≈10 000 cpm 35S-Rubisco kötődött, amikor 40 000 cpm 35S-Rubisco-t (125 nM) adtunk 2 másodperccel az ATP előtt, és ≈30 000 cpm kötődött, amikor ATP-t adtunk 2 másodperccel a Rubisco előtt (3B ábra). Ez utóbbi kötődés mértékét akkor is elértük, amikor a 10 perc alatt képződött SR1-Rubisco bináris komplexeket ATP-vel és GroES-szel együtt inkubáltuk (3B ábra). A szubsztrátkötés mértékének ezek a mérései tehát párhuzamosak az enzimatikus aktivitás helyreállásának mértékével (vö. 3B. ábra és 3A. ábra), és alátámasztják azt a következtetést, hogy az ATP/polipeptid hozzáadása közötti 2 s-os intervallumban az ATP hozzáadása kezdetben a hatékonyabb szubsztrátfehérje-kötésnek kedvez.
Nagyobb mértékű Rubisco-kötődés az ATP-exponált chaperonin gyűrűhöz.
A Rubisco nagyobb mértékű kötődésének előző megfigyelése egy olyan adalékolási sorrendben végzett kísérletben, amelyben kezdetben ATP-t adunk, arra utal, hogy a Rubisco asszociációjának sebessége az ATP-mobilizált apikális doménekkel nagyobb lehet. Ennek tesztelésére az SR1 egy ATP-hidrolízis-defektív D398A változatát használtuk, amelyben a 44-es pozícióban (C138A háttérben) egy ciszteinre szubsztituált OG kapcsolódik, és FRET segítségével jelentettük a CPM-jelölt Rubisco kötődésének sebességét (3. ábra C-E). Megfigyeltük, hogy a Rubisco kötődésének sebessége – az előbbi adalékolási sorrend-kísérletekkel azonos körülmények között végezve – 2-szer nagyobb volt ATP jelenlétében vs. hiányában (hasonlítsuk össze a 3. 3D ábrát a 3C ábrával). Amikor az ATP-t és a nem-natív Rubisco-t egyszerre adtuk hozzá, ami a fiziológiás helyzetet tükrözi, a Rubisco-kötés sebessége hasonlított ahhoz, mint amikor az ATP-t a Rubisco előtt adtuk hozzá (3E. ábra, vö. a 3D ábrával). Ezek az adatok alátámasztják, hogy a Rubisco gyorsabban társul egy olyan gyűrűhöz, amelynek apikális doménjei ATP-mobilizáltak, és hogy fiziológiás körülmények között, amikor ATP és nem-natív szubsztrát is jelen van, az ATP-mobilizált apikális domének működnek a szubsztrátkötésben.