Frontiers in Immunology

Ez a szemléleti áttekintés két táblázatos ábra köré rendeződik, az egyik az NMDAR1 autoantitest (AB) eredményeit foglalja össze és integrálja egy magyarázó modellbe (1. ábra), a másik pedig az ismeretek jelenlegi állása alapján próbál egyértelmű ajánlásokat adni az immunszuppresszív kezelésre vonatkozó klinikai döntési folyamathoz (2. ábra).

Megjegyezzük, hogy az NMDAR1/NR1 új nómenklatúráját, a GluN1-et itt figyelmen kívül hagyjuk a vonatkozó áttekintett irodalom többségével való összhang érdekében.

NMDA-receptorok az agyban és a periférián

A N-metil-d-aszpartát receptorok (NMDAR) glutamátkapus ioncsatornák, amelyek bőségesen kifejeződnek az emlősök agyában (1). NR1, NR2 és NR3 alegységekből álló heteromereket alkotnak, az NR1 az egyetlen kötelező partner. Az NMDAR-ok kulcsfontosságúak a neuronális/szinapszisfunkció szabályozásában, és az agyban nem neuronális sejttípusok, például az asztrociták, oligodendrociták vagy endotélsejtek is expresszálódnak (2-5). Emellett perifériás expresszióról is beszámoltak, például a gasztrointesztinális traktusban vagy immunsejtekben (6).

Anti-NMDAR encephalitis

Az NMDAR1 ellen irányuló immunglobulin G (IgG) osztályú autoantitesteket eredetileg az “anti-NMDAR encephalitis” nevű állapothoz kapcsolták (7-10). Dalmau és munkatársai 2007-ben írtak le először egy paraneoplasztikus szindrómát, 12 petefészek teratomában szenvedő nőn alapulva, akik NMDAR NR1/2 alegységek elleni IgG AB-t hordoztak. A szindróma változóan pszichózisból, kognitív hanyatlásból, epilepsziás rohamokból, diszkinéziából, csökkent tudatállapotból és autonóm instabilitásból állt. A szerzők számos későbbi publikációban az anti-NMDAR encephalitisben szenvedő egyének növekvő száma alapján beszámoltak az IgG osztályú NMDAR1-AB magas szérum- és liquor- (liquor-) titeréről ebben az állapotban, valamint az immunszuppresszív terápiára adott gyakran kedvező válaszról (7-10). A szindrómához tartozó patofiziológiai mechanizmusként az NMDAR1-AB által indukált NMDAR-mediált áramok csökkenését javasolták, ami a receptor fokozott internalizációjának és ezáltal csökkent felszíni expressziójának köszönhető (11). Több éven keresztül azonban az egészséges alanyokat nem is vizsgálták számottevő számban az NMDAR1-AB szeroprevalenciája szempontjából. Ennek ellenére az IgG osztályú NMDAR1-AB jelenlétét a szérumban (nem csak a liquorban) betegségspecifikusnak állították és állítják (7-10), ami némi zavart okozott az irodalomban és sajnos a klinikai gyakorlatban is.

NMDAR1-antagonizmusra emlékeztető szindrómák

Mivel az NMDAR hipofunkciót a skizofrénia központi mechanizmusának feltételezték az antagonisták által indukált pszichotikus tünetek miatt (12, 13), néhány évvel ezelőtt felmerült a kérdés, hogy a skizofrén betegek egy alpopulációja lehet-e korábban figyelmen kívül hagyott anti-NMDAR encephalitises eset. Eddig az irodalom – többnyire kis mintanagyságon alapulva és az eredeti “az IgG osztályú NMDAR1-AB betegségspecifikus állítását” követve – ellentmondásos eredményeket hozott (14-20). Analóg módon más, szintén NMDAR-antagonizmusra emlékeztető kóros állapotokat, pl. epilepsziát vagy demenciát vizsgáltak az NMDAR1-AB jelenlétére. Publikációk özöne jelent meg – sok közülük esetjelentés -, amelyek az NMDAR1-AB és a legkülönbözőbb szindrómák összefüggéseit írják le. Végül más immunglobulin (Ig) osztályok (IgM és IgA) NMDAR1-AB-jeiről is beszámoltak, amelyek betegségekkel kapcsolatosak (17, 21-23). Egy érdekes, mindeddig teljesen nyitott kérdés, hogy az NMDAR1-AB vezethet-e “perifériás fenotípusokhoz” is, figyelembe véve az NMDAR perifériás szervekben és szövetekben való expresszióját (6).

A szérum NMDAR1-AB egyenlő eloszlása egészség és betegség között

Nem várt módon, a közelmúltbeli munkánk és mások együttesen >5000 egyénen végzett munkája megkérdőjelezte bármely NMDAR1-AB “betegségspecifikus állítását”, mivel korfüggő, akár >20%-os NMDAR1-AB szeroprevalenciát mutatott ki, beleértve az IgM, IgA és IgG-t, egészséges és beteg alanyokban egyaránt. Érdekes módon az IgE osztályba tartozó NMDAR1-AB-t kerestek, de soha nem mutatták ki (24). Az ezekben a vizsgálatokban vizsgált betegségek között neuropszichiátriai állapotok (skizofrénia, affektív zavarok, Parkinson-kór, amyotrófiás laterálszklerózis, Alzheimer-kór, stroke, szklerózis multiplex és személyiségzavarok), valamint általános egészségügyi állapotok, pl. cukorbetegség vagy magas vérnyomás szerepelnek (24-28). A szérum NMDAR1-AB-titerének tartománya és az Ig-osztályok eloszlása is hasonló volt az összes vizsgált betegségcsoportban, valamint az egészséges egyéneknél (24-28). Minden 40 éves személynek ~10%, minden 80 éves személynek ~20% esélye van NMDAR1-AB szeropozitivitás kimutatására (24).

A NMDAR1-AB funkcionalitása

Ez a meglepő felfedezés felvetette a kérdést, hogy vajon ezek az AB-k mind funkcionálisak-e? Mivel az összes NMDAR1-AB-meghatározáshoz biochip-mozaikokat és sejtalapú vizsgálatot, a klinikai standard eljárást (NMDAR1 és humán IgG, IgM vagy IgA elleni másodlagos AB-vel transzfektált HEK293T-sejtek; Euroimmun, Lübeck, Németország) használtak (lásd alább is), további vizsgálatokat kellett végezni e váratlan eredmények további megszilárdításához az AB funkcionalitásának bizonyításával. Ezek az in vitro vizsgálatok (mindegyiket az immunglobulinok ammónium-szulfátos kicsapását és dialízisét követően szérumokkal végezték) az NMDAR1-AB-nak az Ig-osztálytól független, hasonló hatását mutatták ki a receptor internalizációjára a humán IPSC-ból származó neuronokban, valamint az elsődleges egérneuronokban. Hasonlóképpen, az összes Ig-osztályba tartozó NMDAR1-AB csökkentette a glutamát által kiváltott áramlásokat az NR1-1b/NR2A-t expresszáló Xenopus laevis oocitákban (26, 28, 29). Az egéren és emberen végzett in vivo vizsgálatok az összes Ig-osztályba tartozó szérum NMDAR1-AB hasonló hatására utalnak az agyi funkciók modulációját illetően (további részleteket lásd alább).

Az AB kimutatás módszerei – még mindig van hova fejlődni

A még mindig függőben lévő, szabványosítást igénylő probléma az AB meghatározására alkalmazott, eltérő specificitású és érzékenységű módszerek sokfélesége. Az NMDAR1-AB tekintetében (ahol a legszilárdabb saját tapasztalattal rendelkezünk) a sejtalapú vizsgálatok minden bizonnyal a jobb módszer az NMDAR1-AB kimutatására, mivel az epitópok természetes módon exponálódnak, így az AB specifikusan detektálja őket. De még ezek a próbák is különböznek, egyes szerzők tranziens módon transzfektált élő sejteket használnak, elfogadva azok potenciális változékonyságát és a tételek közötti variációs problémákat, míg mások a teljes NMDAR1 alegységet expresszáló, rögzített és permeabilizált sejteket használnak, ami valószínűleg jobb standardizálást tesz lehetővé (Euroimmun). Ez utóbbi vizsgálatot jelenleg világszerte használják az NMDAR1-AB encephalitis diagnosztizálására. A párhuzamosan végzett funkcionalitási vizsgálatokkal (receptor internalizáció, elektrofiziológia és in vivo vizsgálatok) együtt végzett saját tapasztalataink alapján jelenleg ez tűnik a legmegbízhatóbb módszernek. Erősen ajánlott azonban ezt a vizsgálatot a különböző Ig-osztályokra (anti-humán IgG, anti-humán IgA és anti-humán IgM) nagyon specifikus másodlagos AB-kkel kombinálva használni, mivel a keresztreagáló AB-k téves következtetésekhez vezethetnek pl. az IgG AB prevalenciájára vonatkozóan. A specifikus AB immunhisztokémiai kimutatására szolgáló patkány-, egér-, humán- vagy majomagy metszetek használata hasznos kiegészítő bizonyítékot nyújthat. Ezzel szemben a peptideken alapuló tipikus ELISA nem ajánlható az NMDAR1-AB kimutatási módszereként, mivel a természetellenes (a sejtmembránban elfoglalt helyéről eltávolított) epitóp expozíció miatt sok hamis pozitív és/vagy hamis negatív eredményt kaphatunk. Ezek a vizsgálatok csak utóvizsgálatokra tűnnek alkalmasnak, például az AB titerfolyamat meghatározására ugyanattól a donortól származó, korábban sejtalapú és funkcionális vizsgálatokkal egyértelműen szeropozitívnak diagnosztizált minták sorozatának felhasználásával.

A vér-agy gát (BBB) döntő szerepe a szindrómás jelentőségben

Azzal kapcsolatban, hogy miért marad olyan sok szérum NMDAR1-AB hordozó egészséges, azt feltételeztük, hogy egy veszélyeztetett BBB dönthet a patofiziológiai jelentőségükről. Fontos, hogy a fokozott BBB-permeabilitás regionálisan eltérő lehet, ami megmagyarázza az egyénileg változó tüneti következményeket (30). Állatmodellként olyan ApoE-/- egereket vizsgáltunk, amelyeknél a BBB szivárgása ismert volt a vad típusú alomtestvérekhez képest (31). NMDAR-AB szeropozitív (IgM, IgG és IgA) humán személyekből származó tisztított Ig-frakciók intravénás injekciója kizárólag ApoE-/- egerekben vezetett a spontán nyílt terepi aktivitás és az MK-801-re adott hiperszenzitív (pszichózissal kapcsolatos) válasz megváltozásához a nyílt terepen (28). A veszélyeztetett BBB szerepét később emberekben is feltárva, valóban súlyosabb neurológiai tüneteket láttunk olyan NMDAR1-AB-hordozóknál (bármely Ig-osztályból), akiknek a kórtörténetében születési komplikációk vagy neurotrauma szerepeltek, olyan állapotok, amelyek valószínűleg krónikusan szivárgó BBB-vel járnak (28). Ugyanezen a vonalon vizsgáltuk az APOE4-hordozókat is, mivel az APOE4 haplotípust permeábilis BBB-vel hozták összefüggésbe (32, 33). Első utalásokat kaptunk arra, hogy az NMDAR-AB fokozhatja a nagyzási téveszméket és a mániát neuropszichiátriai betegségben szenvedő APOE4-hordozóknál, akiket aztán nagyobb valószínűséggel diagnosztizálnak skizoaffektívnek (29). Az előzetesen keringő NMDAR1-AB (ismét minden osztályból) módosító szerepét humán ischaemiás stroke-ban is megfigyelték. Az inzultus bekövetkezése előtt intakt BBB-vel rendelkező betegeknél az NMDAR1-AB védelmet nyújtott az elváltozás méretének alakulása tekintetében, míg az APOE4-hordozóknál az NMDAR1-AB nagyobb inzultustérfogattal járt együtt (24). Ezek az eredmények hangsúlyozzák, hogy nemcsak a BBB diszfunkciójának mértéke, hanem időtartama is – akut versus krónikus – döntő szerepet játszhat az NMDAR1-AB által kialakított szindróma alakításában.

Az agy mint az NMDAR1-AB immunprecipitátora

A stroke után átmenetileg minden Ig izotípusú NMDAR1-AB keringése csökkent (24). Ez arra a feltételezésre vezetett bennünket, hogy az agyszövet a sűrűn expresszált NMDAR1-gyel (amely a BBB lebontása után hozzáférhető) a keringő NMDAR1-AB csapdájaként működhet (25). Először azzal a kérdéssel foglalkoztunk, hogy a szérum NMDAR1-AB kimutatható-e a liquorban. Az N = 271 középkorú (szklerózis multiplexszel diagnosztizált vagy betegséggel kontrollált), CSF-szérum párossal rendelkező alany közül 26 volt NMDAR1-AB szeropozitív (ami a várt tartományban van), de figyelemre méltó módon csak 1 volt CSF-pozitív. Ezzel szemben a tetanusz-AB (amely a kötelező védőoltás miatt mindenütt jelen van, de nem kötődik az agyszövethez) minden alany szérumában és liquorában jelen volt, a liquorszintek pedig magasabbak voltak veszélyeztetett BBB esetén. Egereken végzett transzlációs kísérletek igazolták azt a hipotézist, hogy az agy “immunprecipitátorként” működik: NMDAR1-AB IgG és egy nem agyhoz kötődő “nem-szensz-AB” (anti-GFP IgG) egyidejű injekciózása az előbbinek csak az agyban (a BBB diszfunkciója esetén egyértelműen kifejezettebb), az utóbbinak csak a liquorban való nagyfokú kimutathatóságát eredményezte (25). Ezek az adatok segíthetnek az agyi antigének ellen irányuló szérum-AB lehetséges tüneti következményeinek magyarázatában. Míg a BBB szivárgásának jelentős szerepe van, és azt értékelni kell azokban az esetekben, amikor a keringő NMDAR1-AB patológiai relevanciáját gyanítják, a liquorban mért AB-titerekre vonatkozó negatív eredmények nem zárhatják ki automatikusan az agyi hatásokat.

Az NMDAR1-AB által felismert epitópok

A következő kérdés az volt, hogy ezek a látszólag összfunkcionális NMDAR1-AB-k ugyanazt az epitópot ismerik-e fel, és hogy ez potenciálisan magyarázhatja-e magas szeroprevalenciájukat. Ismét váratlanul az epitóp-térképezés hét különböző NMDAR1-konstrukciót használva különböző epitópok felismerését mutatta ki az NMDAR1-AB-pozitív szérumok által, amelyek az extracelluláris ligandumkötő és az N-terminális doménben (NTD), valamint az intracelluláris C-terminális és az extra nagy pórus doménben helyezkedtek el. Az NMDAR1-AB szeropozitivitás a vizsgált szérumok felében poliklonális/polyspecifikus volt, a másik felében pedig valószínűleg mono- vagy oligoklonális/oligospecifikus (főként IgG). Összességében nem mutatkozott különösebb betegséggel kapcsolatos mintázat: Az NMDAR1-epitópok hasonlóak voltak a betegségcsoportok között (26). Az NMDAR1-AB epitópokkal kapcsolatos publikált munkák e szisztematikus vizsgálat előtt ritkák voltak, és az NTD-t és az NTD-G7 domént (N368/G369) felismerő IgG-re összpontosítottak, valószínűleg azért, mert ezt a régiót és Ig-osztályt tartották először az anti-NMDAR encephalitis patognomonikusnak (8, 34). Valóban úgy tűnik, hogy a fiatal nőket az NMDAR1-asszociált autoimmunitás neuropszichiátriai megnyilvánulásaira hajlamosító tényezők az NTD vagy az NTD-G7 epitópokhoz kapcsolódnak. Az IgG hangsúlyos szerepe ebben a kontextusban még csak spekuláció, de valószínűleg a gyulladás által kiváltott osztályváltással függ össze az agyban (36).

Az NMDAR1-AB hordozására vagy fokozására hajlamosító tényezők

Az in vitro és in vivo eredmények alapján azt kell feltételeznünk, hogy alapvetően minden természetesen előforduló NMDAR1-AB rendelkezik patogén potenciállal, függetlenül az epitóptól és az Ig-osztálytól. Ez azonban nem jelenti azt, hogy az Ig-osztály típusa nem indíthatja el a másodlagos események különböző kaszkádjait, és ezáltal nem alakíthatja tovább a végső szöveti választ. Most azonban még több kérdés merül fel: Hogyan magyarázható az NMDAR1-AB betegségtől független, az életkorral növekvő magas szeroprevalenciája? Ismerünk-e hajlamosító tényezőket, és ha igen, hogyan integrálhatjuk szerepüket a teljes képbe? Az NMDAR1-AB-t kezdetben onkológiai állapotokkal (teratoma) hozták összefüggésbe (7). Később influenza A és B szeropozitivitás esetén hajlamot mutattak ki ezen AB-k hordozására, és ezt a megállapítást egy független mintában is megismételték (25, 28). Szintén egy genom-szerte szignifikáns genetikai markert, az rs524991-et, amely még az NMDAR biológiájával is összefüggésbe hozható az NMDAR1-AB-vel (28). Hogy a szivárgó BBB, amely a központi NMDAR1 fokozott expozícióját okozza az immunrendszer sejtjei számára, indukálhatja-e az NMDAR1-AB kialakulását és/vagy fokozhatja-e a már meglévő specifikus B-sejtklónokat, jelenleg nem világos és szisztematikusan vizsgálandó. Egy másik vonzó elképzelés, amelyet az NMDAR1-AB területén még nem vizsgáltak, a mikrobiom lehetséges moduláló hatása az NMDAR1-AB fokozására (37).

Más agyi antigénvezérelt AB

Miért látunk olyan bőségesen NMDAR1-AB-t egészségben és betegségben? Igaz ez más agyi antigének ellen irányított AB-kre is? E kérdések megválaszolása érdekében analóg módon 24 másik, korábban kóros állapotokkal összefüggésbe hozott agyi antigén-irányított szérum-AB-t vizsgáltunk. Ismét némi meglepetésre ez a munka hasonló gyakoriságot, titereket és Ig-osztályok eloszlását mutatta ki egészséges és beteg alanyokban. A szeroprevalencia azonban mind a 24 AB esetében jóval alacsonyabb volt (<2%), szemben az NMDAR1-AB-vel (akár >20%) (27). Feltűnő, hogy az uralkodó Ig-osztály sem az egészségi állapottól vagy a betegségtől, hanem az antigén helyétől függött, az intracelluláris epitópok hajlamosítottak az IgG-re (27). E 24 egyéb AB egyenlő eloszlása egészségi állapotban és betegségben kevésbé meglepő, ha figyelembe vesszük, hogy több agyi irányultságú AB-t jelentettek egészséges emberek és különböző más emlősfajok szérumában (38, 39), valamint bőségesen encephalitises esetek liquorjában (40), még akkor is, ha a megfelelő agyi antigéneket nem határozták meg. Összefoglalva, úgy tűnik, hogy az agyi antigének által irányított AB általában és az NMDAR1-AB különösen egy már meglévő autoimmun repertoár része (37, 41-44), amely (pato)fiziológiai jelentőséget nyer az intrathecális szintézis vagy a BBB sérülése esetén, például sérülés, fertőzés, agyi gyulladás vagy a BBB szivárgására való genetikai hajlam (APOE4 haplotípus) esetén.

Következtetések és ajánlások

Minden természetesen előforduló szérum NMDAR1-AB nyilvánvalóan patogén potenciállal rendelkezik. Még mindig széles körben feltáratlan okok miatt igen gyakoriak (gyakoribbak, mint más, eddig azonosított agyi irányítású AB), és előfordulási gyakoriságuk az életkorral egyértelműen növekszik. Az NMDAR-AB szeropozitivitás önmagában biztosan nem indokolja az immunszuppresszív kezelést. A szérum NMDAR1-AB szindrómás relevanciája az agyhoz való hozzáférhetőségtől, azaz a BBB áteresztőképességétől függ. Ezenkívül az agyi gyulladás valószínűleg döntő szerepet játszik a szindróma súlyosságának és súlyosságának meghatározásában, amihez hozzájárul a keringő NMDAR1-AB, és még hangsúlyosabban a megfelelő plazmasejtek, amelyek gyulladásos körülmények között az agyban tartózkodnak vagy potenciálisan az agyba vándorolnak, hogy intrathecalisan AB-t termeljenek (40). A gyulladásos miliőben az epitóp-expozíció hatására felerősödnek, és IgG-re történő osztályváltást tapasztalnak (36). A herpesz-encephalitisben szenvedő egyéneknél tapasztaltak tovább erősíthetik ezt a nézetet (22, 45).

Minden alapjául szolgáló encephalitis, legyen az fertőző, lézió okozta, genetikai vagy “idiopátiás”, az NMDAR1-AB jelenléte által kialakított markáns szindrómán mehet keresztül a “Dalmau-féle encephalitis” értelmében (7-10), ami aztán az okozó encephalitis kezelésén felül immunszuppresszív terápiát igényel (ha van). Azt, hogy az intrathecalisan termelt NMDAR1-AB önmagában, az alapjául szolgáló előzetes gyulladás nélkül okozhat-e “Dalmau-féle agyvelőgyulladást”, még meg kell határozni. Minden olyan esetben, amikor egyébként az agyi antigének ellen irányuló szérum-AB tüneti következményeinek gyanúja merül fel nyílt encephalitis hiányában, értékelni kell a BBB szivárgását. Mivel az albuminhányados (amelyet klinikai közelítésként alkalmaznak a BBB szétesésének diagnosztizálására) inkább a vér-CSF-gát zavarát jelzi, és a BBB szivárgásának enyhe eseteiben nem mindig kóros (46-48), a BBB (globális vagy lokális) zavarának kiegészítő meghatározása egy új mágneses rezonancia képalkotó (MRI) módszerrel (47), amely a rutin kontrasztanyaggal megerősített MRI kiegészítőjeként hozható létre, hasznos lehet különösen a kiterjesztett immunszuppresszív terápiás beavatkozások szükségességének és hasznának megítélésében.

A szerző hozzájárulása

A szerző megerősíti, hogy ő az egyedüli szerzője ennek a munkának, és jóváhagyta annak közzétételét.

>Kérdések összeférhetetlenségi nyilatkozata

A szerző kijelenti, hogy a kutatást olyan kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolatok hiányában végezte, amelyek potenciális összeférhetetlenségként értelmezhetők.

Finanszírozás

Ezt a munkát a Max Planck Társaság, a Max Planck Förderstiftung, a DFG (CNMPB), az EXTRABRAIN EU-FP7 és a Niedersachsen-Research Network on Neuroinfectiology (N-RENNT) támogatta.