Bevezetés
A fluoreszcens fehérjéket (FP) az 1990-es évek közepe óta használják fehérjecímkékként, elsősorban sejtbiológiai és fluoreszcens mikroszkópiai célokra. Ezek a címkék nemcsak a sejtbiológiát forradalmasították azáltal, hogy szinte bármilyen fehérje leképezését lehetővé tették, hanem biokémiai alkalmazásokban is használják őket. Fontos példa erre az FP-címkézett fehérjék immunprecipitációja és affinitás tisztítása, amelyet a nagy hozamú, tisztaságú és affinitású affinitásgyanták, például a ChromoTek Nano-Traps (https://www.chromotek.com/products/detail/product-detail/nano-traps/) kifejlesztése tett lehetővé.
Ebben a blogban áttekintést nyújtunk a
- zöld fluoreszcens fehérjékről
- vörös fluoreszcens fehérjékről
- önjelző fehérjékről, amelyek egy fluoreszcens molekula kovalens csatolását igénylik
Fluoreszcens fehérjék típusai
A legtöbb kutató a GFP, mNeonGreen, TurboGFP, RFP vagy mCherry belső fluoreszcens fehérjéket használja. Alternatívaként extrinsically fluoreszcens vagy önjelölő fehérjéket is bevezettek, amelyek egy fluoreszcens molekula kovalens csatolását igénylik a nem fluoreszcens fehérjéhez, pl. a SNAP, CLIP és Halo fehérjecímkék. Ezek az öncímkéző fluoreszcens fehérjék a fluoreszcens színezékek tulajdonságai miatt bizonyos teljesítménybeli előnyökkel rendelkeznek az intrinsically FP-kkel szemben.
1. ábra: Fluoreszcens fehérjék struktúrái.
(A) A belső fluoreszcens fehérjék (FP-k), mint az EGFP, GFP, RFP, mNeonGreen, turboGFP stb. csak kevés közös maradékot tartalmaznak, de mindegyiket konzervált β-hordó szerkezetbe hajtják. Fluoreszcenciájuk a hordó közepén lévő három aminosavmaradvány gerincciklizációjával és oxidációjával jön létre (jobbra kiemelve), ami egy kétgyűrűs kromofórt eredményez. Ezt a kémiai folyamatot a kromofór érlelésének nevezik, a fehérje hajtogatásának velejárója, és csak olyan környezeti változóktól függ, mint a hőmérséklet és az oxigénkoncentráció, de további enzimektől nem. Az intrinzikálisan fluoreszcens fehérjék színe, fotostabilitása, kvantumhozama és egyéb spektrális tulajdonságai a kromofórt alkotó vagy a kromofór közelében elhelyezkedő aminosavakon belüli mutációk eredménye.
(B) Az extrinzikálisan fluoreszcens fehérjék, mint például a HaloTag, alap apoformájukban nem fluoreszkálnak. Csak ha egy megfelelő aktivált fluorofort adunk a HaloTag fehérjéhez, akkor ezt a fluorofort a HaloTag D106-os maradékához rögzíti és kovalensen megköti, ezáltal a HaloTag fluoreszkálóvá válik. (PDB azonosítók a struktúrákhoz: EGFP, 2y0g; apo-HaloTag, 5uy1; holo-HaloTag, 5uxz.)
A medúza zöld fluoreszcens fehérje (GFP) és származékai még mindig a leggyakrabban használt fluoreszcens fehérjék az orvosbiológiai kutatásban. A közelmúltban további zöld fluoreszcens fehérjéket vezettek be, amelyek más organizmusokból származnak. Ezek az FP-k ugyanazt az alapvető hajtást birtokolják, mint a GFP, de szekvencia-szinten nagymértékben eltérnek egymástól. Ezért új, dedikált kutatási eszközöket, például antitesteket igényelnek.
Az eredeti: GFP
A zöld fluoreszcens fehérjét először 1962-ben Osamu Shimomura izolálta az Aequorea victoria medúzából. Hosszú Stokes-eltolódású zöld fluoreszcenciával rendelkezik (ex 395 nm; em 509 nm). 30 évvel később Douglas Prashernek végül sikerült klónoznia a GFP szekvenciáját, Martin Chalfie pedig in vivo expresszálta ezt a szekvenciát. Később a Roger Tsien laboratórium a GFP-t valóságos kutatási eszközkészletté fejlesztette. Shimomura, Chalfie és Tsien 2008-ban Nobel-díjat kapott. Roger Tsien Nobel-díjas előadása itt tekinthető meg: https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2008/tsien/lecture/.
A tudósok különböző tulajdonságokkal rendelkező GFP-változatok sokaságát fejlesztették ki. Ezek az FP-k különböző funkcionális és spektrális tulajdonságokkal rendelkeznek. A GFP első jelentős továbbfejlesztése egy mutáció (S65T) volt, amely növelte a fluoreszcens jel intenzitását és stabilitását. A fő gerjesztési csúcs 488 nm-re tolódott (Heim és mtsai., 1995). Az elterjedt EGFP variáns a GFP módosított változata, ami megkönnyíti a GFP gyakorlati felhasználását számos különböző szervezetben és sejtben.
Zöld fluoreszcens fehérje A GFP-t avGFP, wtGFP és gfp10 néven is ismerik; az EGFP-t enhanced GFP és GFPmut1 néven.
https://www.fpbase.org/protein/avgfp/
https://www.fpbase.org/protein/egfp/
TurboGFP
A 2004-ben bemutatott TurboGFP egy gyorsan érő és fényes dimer zöld fluoreszcens fehérje, amely a Pontellina plumata kopepódából származó CopGFP-ből származik. A Copepoda TurboGFP evolúciós szempontból távol áll a medúzákból származó fluoreszcens fehérjéktől, például az EGFP-től, és csak mintegy 20%-os szekvenciaazonosságot mutat az általánosan használt GFP-változatokkal. Ezért a legtöbb anti-GFP antitest, beleértve a GFP-Trapben használt GFP-Nanobody-t, nem kötődik a TurboGFP-hez.
https://www.fpbase.org/protein/turbogfp/
mNeonGreen
mNeonGreen a Branchiostoma lanceolatum nevű lándzsás cethal multimeres sárga fluoreszcens fehérjéjéből származik. Az mNeonGreen tehát evolúciós szempontból távol áll a medúzákból származó FP-ktől. Az mNeonGreen és a közönséges GFP-származékok szekvenciaazonossága mindössze mintegy 20%. Az alacsony szekvencia-hasonlóság miatt várható, hogy a GFP-változatok affinitási eszközei (pl. antitestek) nem kötődnek az mNeonGreenhez. Minden bizonnyal a ChromoTek affinitási reagensek (anti-GFP nanobodies/ VHH-k és antitestek) esetében ez bebizonyosodott.
Az először 2013-ban közzétett mNeonGreen akár háromszor fényesebb, mint a GFP. Ez egy feltörekvő, monomer sokoldalú zöld/sárga fluoreszcens fehérje képalkotó alkalmazásokhoz, beleértve a szuperfelbontású mikroszkópiát. Az mNeonGreen továbbá a fluoreszcens rezonancia-energiatranszfer (FRET) alkalmazásokban a cián fluoreszcens fehérjék akceptoraként működik. Úgy tűnik, hogy ez az eddig ismert legfényesebb monomer zöld fluoreszcens fehérje, és gyors érési sebességgel rendelkezik.
https://www.fpbase.org/protein/mneongreen/
A GFP, TurboGFP összehasonlítása, és az mNeonGreen
Tulajdonságok |
EGFP (leggyakrabban használt GFP-származék) |
turboGFP |
mNeonGreen |
|---|---|---|---|
|
Feltárás/ Első publikáció |
|||
|
Origin |
GFP medúzából |
CopGFP a Pontellina nevű kagylóból. plumata |
multimeric yellow fluorescent protein from lancelet Branchiostoma lanceolatum |
|
Maturation rate (at 37°C) |
25 min |
10 min |
|
|
Sorazonosság az EGFP-vel |
~20% |
~20% |
|
|
GFP-ből származik? |
Igen |
Nem |
Nem |
|
Szerkezet |
Gyenge. dimer |
Dimer |
Monomer |
|
Gyakori változatok |
AcGFP, Clover, eGFP, Emerald, GFP, GFP5, GFP Envy, GFP S65T, mGFP, mPhluorin, PA-GFP, Superfolder GFP, TagGFP, TagGFP2, monomer eGFP A206K, CFP, eCFP, mCerulean, YFP, Citrine, eCitrine, eYFP, Venus, Ypet, BFP |
TurboGFP, CopGFP |
mNeonGreen |
|
gerjesztési/emissziós maximum |
488 nm/ 509 nm |
482 nm/ 502 nm |
506 nm/ 517 nm |
|
Hossz/ molekulatömeg (MW) |
239 aminosav, |
2x 232 aminosav, |
237 aminosav, |
|
A ChromoTek által kínált kutatási eszközök |
Immunoprecipitáció: Immunofluoreszcencia: GFP-Trap Western blot: Patkány anti-GFP antitest Kontroll: tisztított EGFP fehérje |
Immunoprecipitáció: TurboGFP-csapda |
Immunoprecipitáció: mNeonGreen-csapda Western blot: Mouse anti-mNeonGreen antitest |
A vörös fluoreszcens fehérjék (RFP-k) olyan FP-k, amelyek vörös-narancs fluoreszcens fényt bocsátanak ki. Az első kereskedelmi forgalomban elérhetővé vált RFP a DsRed volt. Ezt a Discosoma sp. tengeri anemonákból nyerték 1999-ben.
A DsRed-nek van néhány immanens gyakorlati problémája: (i) Érési ideje körülbelül 24 óra, ami használhatatlanná teszi rövid(er) idejű kísérletekhez. (ii) A DsRed tetramer formája veszélyeztetheti azon fehérjék működését, amelyekhez kapcsolódik. (iii) Fotostabilitása meglehetősen alacsony.
Ennek következtében a DsRedet helyirányított mutagenezisnek vetették alá, hogy általánosan alkalmazhatóvá váljon genetikailag kódolt fúziós tagként. Végül olyan monomer RFP-származékokat hoztak létre, amelyek jobb fluoreszcens teljesítménnyel (fényerő és fotostabilitás szempontjából) és nagyobb érési hatékonysággal rendelkeznek. Ezenkívül narancssárga, vörös és távoli vörös fluoreszcenciájú származékokat is előállítottak. Az RFP ezen monomerizált változatai lettek az értékes kutatási eszközök: mCherry, mOrange, mRaspberry, mPlum (más néven “mFruits”), mKO, mRFP (a.k.a. mRFP1), mRFPruby, mRuby, tagRFP, mKate2 és DsRed-Express stb.
Egyéb RFP-ket azonosítottak más emberszabásúakban (pl. anemónákban és korallokban), de ezek a fehérjék is többnyire tetramerek voltak. Így ezeket még nem optimalizálták tovább a kutatásban való felhasználásra.
mRFP (más néven mRFP1)
A dsRed első, Roger Tsien laboratóriumában genetikailag előállított monomer változatát egyszerűen mRFP-nek (vagy mRFP1), azaz monomer vörös fluoreszcens fehérjének nevezték el. A dsRedhez képest az mRFP1-et valamivel alacsonyabb abszorpciós szint, kvantumhozam és fotostabilitás jellemzi. Érési sebessége azonban körülbelül 10-szer gyorsabb, mint a dsRedé, ami élő sejtekben kifejezve hasonló effektív fényerőt eredményez.
https://www.fpbase.org/protein/mrfp1/
mCherry
Az mCherry valószínűleg a leggyakrabban használt RFP-változat. Ez egy monomer vörös fluoreszcens fehérje, amely fúziós fehérjeként széles körben alkalmazható különböző sejttípusokban. A többi mFruit RFP-hez hasonlóan az mCherry is az mRFP1 dsRed variánsból származik Roger Tsien laboratóriumának irányított evolúciója révén. A többi mFruittal összehasonlítva az mCherry rendelkezik a legnagyobb fotostabilitással, a leggyorsabb érési sebességgel és kiváló pH-állósággal. Kvantumhozama azonban alacsonyabb, mint az mRFP1-é.
https://www.fpbase.org/protein/mcherry/
mPlum
Roger Tsien laboratóriuma az mRFP1/dsRed egy messze vörös monomer származékát is létrehozta, amelyet mPlumnak neveztek el. A távoli vörös FP-k előnyösek az egész testet leképező alkalmazásokhoz, mivel a fő szöveti abszorberek, mint a víz, a lipidek és a hemoglobin a 650-900 nm-es emissziós tartományban szinte átlátszóak. A legtöbb vöröseltolódott RFP-hez hasonlóan az mPlum is kiterjesztett Stokes-eltolódással rendelkezik.
https://www.fpbase.org/protein/mplum/
A mCherry, mRFP (mRFP1) összehasonlítása, és mPlum
| Tulajdonság | mCherry | mRFP (mRFP1) | mPlum |
|---|---|---|---|
|
Felfedezés/első publikáció |
|||
|
Eredet |
DsVörös a tengeri anemonából |
DsVörös a tengeri anemonából |
|
|
Szaturációs sebesség (37°C-on) |
60 perc |
100 perc |
|
|
Szerkezet |
Monomer |
Monomer |
Monomer |
|
Aggregáció |
nem |
nem |
|
|
Excitációs/emissziós maximum |
587 nm/ 610 nm |
584 nm/ 607 nm |
590 nm/ 649 nm |
|
Hossz/ molekulatömeg (MW) |
236 aminosav, |
228 aminosav, |
229 aminosav, |
|
A ChromoTek által biztosított kutatási eszközök |
Immunoprecipitáció: RFP-Trap |
Immunoprecipitáció: RFP-csapda |
Immunoprecipitáció: RFP-csapda |
A Halo, SNAP és CLIP extrinsically fluorescent protein tagek egy kis fluoreszcens ligandum kovalens befogását igénylik, hogy fluoreszcens fehérjévé alakuljanak. Ennek érdekében ezek az önjelölő fehérjecímkék olyan enzimektől származnak, amelyek kémiai kötések kialakulását katalizálják: A SNAP és a CLIP címkék az O6-alkilguanin-DNS-alkiltranszferáz olyan változatai, amelyek benzilguanin-, illetve benzilcitozin-származékokkal reagálnak. A HaloTag egy haloalkán-dehalogenázból származik, és alkilhalogenidekkel reagál (1. ábra).
Az intrinsikusan és extrinsikusan fluoreszkáló fehérjéket általában egy adott fehérjéhez fuzionálják, hogy lehetővé tegyék annak sejtszintű képalkotását és kimutatását. Az extrinsically fluoreszcens fehérjékhez azonban egy reaktív fluorofór hozzáadása szükséges, aminek számos előnye van:
- Nagyobb kvantumhozam és fotostabilitás
- Erős fluoreszcencia élő és rögzített sejtekben egyaránt
- Fluoreszcens festékek szélesebb választéka
- Egyetlen genetikai konstrukció lehetővé teszi a különböző fluorofórok kiválasztását a többszínűséghez. képalkotás/multiplexelés
- A fluoreszcencia csak a jelölés hozzáadásakor indul be
A három, különböző szubsztrát/ligandum-specifitású, extrinsikusan fluoreszkáló fehérje rendelkezésre állása lehetővé teszi ortogonális használatukat multiplexelt kísérletekben, intrinsically FP-kkel kombinálva is.
A kísérleti igényektől függően használhatunk tetrametilródamin (TMR), Oregon Green, diAcFAM vagy kumarin alapú sejtpermeáns ligandumokat, amelyek könnyen átjutnak a sejtmembránon az intracelluláris fehérjék jelölésére. Alternatív megoldásként a sejtfelszíni gyors jelöléshez olyan sejtáteresztő fluorofórokon alapuló sejtáteresztő ligandumok, mint az Alexa Fluor® 488 és 660 is alkalmazhatók.
A HaloTag, SNAP-Tag összehasonlítása, és CLIP-Tag
| Tulajdonság | HaloTag | SNAP-Tag | CLIP-Tag | |
|---|---|---|---|---|
|
Felfedezés/első publikáció |
||||
|
Eredet |
Haloalkán dehalogenáz a Rhodococcus rhodochrousból |
humán O6-ból |
.alkilguanin-DNS-alkil-transzferáz |
human O6-alkilguanin-DNS-alkil-transzferáz |
|
Szerkezet |
Monomer |
Monomer |
||
|
Reaktivitás |
O6-benzilguanin-származékok |
Benzilcitozin-származékok |
||
|
Ligandok |
Csejtáteresztő vagy nem áteresztő festékek, fluoroforok, biotin és gyöngyök |
Szelláteresztő vagy nem-áteresztő festékek, fluoroforok, biotin és gyöngyök |
Szelláteresztő vagy nem-áteresztő festékek, fluoroforok, biotin, és gyöngyök |
|
|
Excitációs/emissziós maximum |
A kapcsolt fluorofórtól függ |
A kapcsolt fluorofórtól függ fluorofór |
A kapcsolt fluorofórtól függ |
|
|
Hossz/ molekulatömeg (MW) |
297 aminosav, |
182 aminosav, |
182 aminosav, |
|
|
A ChromoTek által kínált kutatási eszközök |
Immunoprecipitáció: |
Immunoprecipitáció: Halo-Trap |
Immunoprecipitáció: SNAP/CLIP-tag-Trap |
Immunoprecipitáció: SNAP/CLIP-tag-Trap |
HaloTag
Az önjelölő HaloTag a Rhodococcus rhodochrousból származó DhaA haloalkán dehalogenáz enzimből származik. Aktív helyét genetikailag módosították, hogy irreverzibilisen kösse a klóralkán-linker szubsztrátokat. Az ilyen típusú öngyilkos gátlásnak köszönhetően a katalitikus hely regenerálása a további dehalogénezéshez már nem lehetséges. A választott szubsztráttól függően a HaloTag fluoreszcens fehérjetaggá alakul át, vagy például agarózgyöngyökre immobilizálható.
Mivel a haloalkán-dehalogenázok hiányoznak az eukarióta sejtekben és a legtöbb prokariótában, beleértve az E. coli, nem lesz háttérjelölés.
SNAP-tag
A SNAP-tag önjelölő fehérjetag a humán O6-alkilguanin-DNS-alkil-transzferázból (hATG) származik, amely vad típusú fehérjeként eltávolítja az alkilációs károsodásokat a DNS-ről. Az így kapott, SNAP-tagként használt hAGT-változat O6-benzilguanin-származékokkal (azaz egy benzil-linkeren keresztül guanin vagy klórpirimidin távozó csoportokhoz konjugált fluoreszcens jelölővel) kovalens módon, irreverzibilis és rendkívül specifikus módon reagál. A jelölési reakcióban a szubsztrát szubsztituált benzilcsoportja kovalensen kapcsolódik a SNAP-taghez.
CLIP-tag
A SNAP-tag módosított változata, amelyet úgy alakítottak ki, hogy benzilcitozin helyett benzilguanin-származékokkal reagáljon. A SNAP-taggal együtt használva a CLIP-tag lehetővé teszi két fehérje egyidejű ortogonális és komplementer jelölését ugyanabban a sejtben.
A guide to choosing fluorescent proteins
Shaner N.C., Steinbach P.A. és Tsien R.Y. (2005)
Nature Methods 2(12), 905-909 doi: 10.1038/nmeth819
http://www.tsienlab.ucsd.edu/Publications/Shaner%202005%20Nature%20Methods%20-%20Choosing%20fluorescent%20proteins.pdf
Zöld fluoreszcens fehérjék:
A zöld fluoreszcens fehérje
Tsien R.Y. (1998)
Annual Review of Biochemistry, 67(1), 509-544. doi: 10.1146/annurev.biochem.67.1.509.
Javított zöld fluoreszcencia
Heim, R.: A zöld fluoreszcens fluoreszcenciája
Heim, R.: A zöld fluoreszcens fluoreszcenciája
, Cubitt A.B. és Tsien R.Y. (1995)
Nature, 373, 663-664. doi: 10.1038/373663b0
Structural basis for the fast maturation of Arthropoda green fluorescent protein
Evdokimov A.G., Pokross M.E., Egorov N.S., Zaraisky A.G., Yampolsky I.V., Merzlyak E.M., Shkoporov A.N., Sander I, Lukyanov K.A és Chudakov D.M. (2006)
EMBO reports, 7(10), 1006-1012. doi: 10.1038/sj.embor.7400787..
A Branchiostoma lanceolatumból származó fényes monomer zöld fluoreszcens fehérje
Shaner N.C., Lambert G.G., Chammas A., Ni Y., Cranfill P.J. Baird M.A., Sell B.R., Allen J.R., Day R.N., Israelsson M, Davidson M.W. és Wang J. (2013)
Nature Methods, 10(5), 407-409. doi: 10.1038/nmeth.2413
Vörös fluoreszcens fehérjék:
A Discosoma sp. vörös fluoreszcens fehérjéből származó monomer vörös, narancs és sárga fluoreszcens fehérjék
Shaner N.C., Campbell R.E., Steinbach P.A., Giepmans B.N.G., Palmer A.E. és Tsien R.Y. (2004)
Nature Biotechnology, 22(12), 1567-1572. doi: 10.1038/nbt1037
A monomer vörös fluoreszcens fehérje
Campbell R.E., Tour O., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A. és Tsien R.Y. (2002)
PNAS, 99(12), 7877-7882. doi: 10.1073/pnas.082243699
Evolution of new nonantibody proteins via iterative somatic hypermutation
Wang L., Jackson W.C., Steinbach P.A. és Tsien R.Y. (2004)
PNAS, 101(48), 16745-16749. doi: 10.1073/pnas.0407752101.
Recovery of Red Fluorescent Protein Chromophore Maturation Deficiency through Rational Design
Moore M.M., Oteng-Pabi S.K., Pandelieva A.T., Mayo S.L. és Chica R.A. (2012)
Plos ONE, 7(12), e52463. doi: 10.1371/journal.pone.0052463..
Halo, SNAP és CLIP:
Releasable SNAP-tag Probes for Studying Endocytosis and Recycling
Cole N.B. és Donaldson J.G. (2012)
ACS Chemical Biology,7(3): 464-469, doi: 10.1021/cb2004252
Site-Specific Protein Labeling with SNAP-Tags
Cole N.B. (2013)
Current protocols in protein science / editorial board, Coligan J.E. et al, 73: 30.1.1-30.1.16., doi: 10.1002/0471140864.ps3001s73
An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells
Gautier A., Juillerat A., Heinis C., Corrêa I.R., Kindermann M., Beaufils F. és Johnsson K. (2008)
Chemistry and Biology 15 (2): 128-136, doi: 10.1016/j.chembiol.2008.01.007
HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis
Los G.V., Encell L.P., McDougall M.G., Hartzell D.D., Karassina N., Zimprich C, Wood M.G., Learish R., Friedman-Ohana R., Urh M., Simpson D., Mendez J., Zimmerman K., Otto P., Vidugiris G., Zhu J., Darzins A., Klaubert D.H., Bulleit R.F. és Wood K.V. (2008)
ACS Chem. Biol. 3(6): 373-382 doi: 10.1021/cb800025k
Általános módszer fúziós fehérjék kovalens jelölésére kis molekulákkal in vivo.
Keppler A., Gendreizig S., Gronemeyer T., Pick H., Vogel H. és Johnsson K (2003)
Nat. Biotechnol. 21: 86-89, doi: 10.1038/nbt765
SNAP-tag fúziós fehérjéket expresszáló COS-7 fluoreszcens jelölése élő sejtek képalkotásához
Provost C.R. és Sun L. (2010)
Visualized Exp. 39: 1876, doi: 10.3791/1876
Kizárólag kutatási célra.
A ChromoTek termékei és technológiája a ChromoTek GmbH tulajdonában lévő vagy kizárólagos licenc alapján a ChromoTek GmbH rendelkezésére álló, megadott szabadalmak és folyamatban lévő bejelentések hatálya alá tartozik.
A ChromoTek, Chromobody, F2H, GFP-Trap, Myc-Trap, RFP-Trap, Spot-Tag, Spot-Label és Spot-Trap a ChromoTek GmbH bejegyzett védjegyei. A SNAP-tag a New England Biolabs, Inc. bejegyzett védjegye, a CLIP-tag pedig a New England Biolabs, Inc. védjegye. A Nanobody az Ablynx, a Sanofi vállalat bejegyzett védjegye. Más szállítók termékei az adott szállító védjegyei vagy bejegyzett védjegyei lehetnek. Az egyéb szállítók termékeire vonatkozó állításokat legjobb tudásunk szerint adjuk meg.