Eredmények és vita
A báziskivágási javításból és spontán depurinációból/depirimidinációból származó AP helyek kialakulásának és javításának jobb megértése in vivo, megmértük az endogén AP-helyek számát felnőtt patkányok különböző szöveteiből és transzplantációs minőségű emberi májból kivont genomi DNS-ben az ASB-próbával (3). Az endogén AP-helyek száma nagymértékben különbözött a szövetek között (1. ábra)⇓ , de a szöveteken belül nem. A legtöbb AP-helyet az agyban mutatták ki, 106 nukleotidra 30 AP-helyet, ezt követte a szív és a vastagbél. Ezzel szemben a patkánymáj, a vese és a tüdő mutatta a legalacsonyabb AP-helyek számát (8-9 AP-hely 106 nukleotidra). Az endogén AP-helyek száma az emberi májban hasonló volt, mint a patkánymájban. Ezek az adatok azt jelzik, hogy normál fiziológiás körülmények között 50 000-200 000 AP-hely marad fenn emlőssejtenként. A genomi DNS-ben lévő AP-helyek állandósult számának tükröznie kell az AP-helyek kialakulása és javulása közötti egyensúlyt. Az agyban található endogén AP-helyek magasabb számának lehetséges értelmezései a következők: (a) a depurináció és/vagy az endogén DNS-adduktképződés nagyobb sebessége, ami több AP-helyet eredményez; (b) a DNS-glikoziláz nagyobb aktivitása, ami több AP-helyet indukál; (c) a II. típusú AP-endonukleáz alacsonyabb aktivitása, ami az AP-helyek felhalmozódását okozza; és (d) a dRp-áz vagy β-elimináció kisebb hatékonysága, ami 5′-nicked AP-helyeket hagy maga után.
Endogén AP helyek patkány és emberi szövetekben. A DNS-t 4°C-on extraháltuk intakt patkányszövetekből és normál emberi májból, és az AP-helyek számát ASB-próbával mértük. A, tipikus röntgenfilm, amely patkányszövetek endogén AP-helyeit mutatja. A DNS-t (beleértve a standard DNS-mintákat is) NC-membránra töltöttük (résenként 1,5 μg). B, patkány- és humán szövetek endogén AP-helyeinek pásztázási denzitometriai adatai. Oszlopok, öt-nyolc egyedi minta duplikált réseinek átlagai; sávok, SD.
Az AP-helyek javításának fő folyamata a II. típusú AP-endonukleáz-/β-pol-függő útvonal (7). A II. típusú AP-endonukleáz képes felismerni az AP-helyeket, és közvetlenül 5′-re a lézióktól bemetszi a foszfodiészter gerincet, 3′-hidroxilcsoportot és 5′-AP-hely terminust hagyva (5). Az 5′-dRp ezt követően felszabadul, és az egynukleotidos rés kitöltődik. Kimutatták, hogy az emlőssejtek sejtmagjában jelentős mennyiségű II-es típusú AP-endonukleáz van jelen (8). Korábban kimutattuk, hogy az ASB-teszt és a II. típusú AP-endonukleáz vagy NaOH kombinációja az AP-helyek 3′ vagy 5′ hasítását indukálja (3). Az AP-endonukleáz és a dRp-áz in vivo aktivitásának megértése érdekében tovább optimalizáltuk az AP-hely hasítási próbát. Ebben a kísérletben az Exo III-at használtuk II. típusú AP-endonukleázként az AP-helyek 3′-hasadásának azonosítására, és putreszcint az 5′-nickek kimutatására (2. ábra)⇓. Az AP-helyek hasításának jellemzésére olyan DNS-t inkubáltunk hővel és savas pufferrel, amelyet MX-szel előkezeltünk, hogy az AP-helyek számát 106 nukleotidonként 3,8 ± 0,5 AP-helyre (átlag ± SD) csökkentsük. A hő/sav inkubáció különböző időtartamai 11, 47, 115 és 320 AP-helyet indukáltak 106 nukleotidonként. Az Exo III egyszeri kezelése minden egyes DNS-mintában 4-10 AP-ponttal csökkentette az AP-helyek számát 106 nukleotidonként, függetlenül a kezdeti számtól (3. ábra)⇓. Ez a csökkenés az Exo III által az 5′ oldalon végzett enzimatikus metszés és az AP-helyek nem specifikus 3′ hasításának kombinációjából adódhat az Exo III-mal történő inkubáció során. Ez a nem specifikus 3′ hasítás megakadályozta a DNS-ben lévő 3′-nicked AP-helyek számának pontos mennyiségi meghatározását ezzel a vizsgálattal. Ezzel szemben a putreszcin-kezelés nem mutatta az AP-helyek számának csökkenését. Exo III-mal, majd putreszkinnel történő inkubációt követően az AP-helyek száma az MX-szel előkezelt borjútímusz DNS-ben az AP-helyek eredeti számára csökkent. Az AP-helyek hasításának hatékonysága az Exo III és putreszcin kombinációjával >99% volt.
Az AP-helyek hasításának sémája. A II. típusú AP-endonukleáz, valamint a dRp-áz in vivo aktivitásának jobb megértése érdekében meghatároztuk az AP-helyek 5′ vagy 3′ oldalán történő hasítások meglétét genomi DNS-ben. A putreszcin és az Exo III (II. típusú AP-endonukleáz) 3′-, illetve 5′-hasított AP-helyeket hagy maga után. Az intakt AP-helyek esetében, ahol nincs bemetszés az AP-helyek 3′ és 5′ oldalán, az ASB-teszt elméletileg képes kimutatni az eredeti AP-helyek számát az Exo III vagy putreszcin kezelés után, mivel az AP-helyek az AP-hely melletti foszfodiészterkötés bármelyik oldalán történő bemetszés után a DNS gerincen maradnak. Az Exo III és a putreszcin kombinációja azonban az AP-hely 3′ és 5′ oldalán is hasít, ami az AP-helynek a DNS-gerincről való leválását eredményezi. Az ilyen felszabadult AP-helyeket ez a vizsgálat nem detektálja. Az e hasítási reakció után a DNS-gerincen maradt AP-helyek száma alapján megbecsülhető az 5′- és 3′-hasított AP-helyek száma. Ha a DNS-ben 5′-hasított AP-helyek vannak jelen, akkor a putreszcin egyszeri kezelése az 5′-nicked AP-helyeket az AP-helyek 3′-kivágásával felszabadíthatja. Hasonlóképpen, a DNS-ben lévő 3′-rákkolt AP-helyek az Exo III segítségével 5′-excizícióval felszabadíthatók.
AP-helyek hasításának vizsgálata hő/sav pufferrel kezelt borjú tímusz DNS-en. Az AP-hely hasítási assay validálása érdekében megvizsgáltuk az Exo III és a putreszcin hatását a borjú thymus DNS-ben indukált intakt AP-helyekre. A borjútímusz DNS-ben lévő AP-helyek eredeti számát MX (CTD/MX) csökkentette. Ezután a DNS-t különböző ideig hő/sav pufferben inkubáltuk, hogy különböző számú intakt AP-helyet vezessünk be (-/-; 9. hivatkozás). A DNS-t Exo III-mal és/vagy putreszkinnel inkubáltuk, és a borjú tímusz DNS-ben megmaradt AP-helyek számát ASB-próbával mértük. Oszlopok, három egyedi minta duplikált réseinek átlagai; sávok, SD. A, 106 nukleotidonként 115 AP-helyet tartalmazó DNS AP-hely hasításának vizsgálata. B, különböző számú AP-helyet tartalmazó DNS AP-hely hasítási próbájának összefoglalása.
Ezt a próbát patkány és emberi szövetekből kivont genomi DNS-en alkalmaztuk az endogén AP-helyek jellemzésére. Az intakt és hasított AP-helyek, valamint a maradék aldehidikus elváltozások frakcióit a 4. ábra foglalja össze⇓. A patkány- és humán szöveti DNS-t Exo III-mal, majd putreszkinnel inkubáltuk, hogy megvizsgáljuk, hogy az észlelt elváltozások tényleges AP-helyek-e. Az AP-helyek 5′ és 3′ hasítása után 106 nukleotidonként 1,5-2,2 maradék aldehidikus elváltozást detektáltunk. Ezek az adatok azt jelzik, hogy az ASB-teszt helyesen méri az endogén AP-helyeket. A maradék léziók az AP-helyek hasításában az enzimreakciók korlátai, valamint az endogén aldehid bázisléziók, például a formiluracil jelenléte miatt maradhatnak fenn (10). Ezenkívül a különböző szövetekben a 3′-hasított és az ép AP-helyek együttes frakciója 106 nukleotidra vetítve ∼2-3 károsodást mutatott ki, ami ∼1/3-1/10-e az endogén AP-helyek teljes számának. Az 5′-hasított AP-helyek számának vizsgálatához DNS-t inkubáltunk putreszcinnel. Az AP-helyek putreszcin általi csökkenése (az AP-helyek eredeti száma mínusz a putreszcin inkubáció után megmaradt AP-helyek száma) jelentette az 5′-hasított AP-helyek számát. A hő/sav pufferrel előkezelt borjútímusz DNS-sel ellentétben a putreszcinnel kezelt genomiális DNS-ben jelentősen csökkent az AP-helyek száma. Ezek az adatok arra utalnak, hogy az endogén AP-helyek körülbelül kétharmada vagy több mint kétharmada már in vivo is hasad az AP-helyek 5′ oldalán.
Patkány és humán szöveti DNS AP-hely hasítási vizsgálatának összefoglalása. Az 1B. ábra legendájában leírt eredeti AP-helyek száma⇓ 5′-hasított, 3′-hasított, intakt AP-helyekből és maradék aldehidikus elváltozásokból állt. Az 5′-hasított AP-helyek számát az AP-helyek eredeti számából mínusz a pusztán putreszcin kezelés után megmaradt AP-helyek száma alapján számoltuk ki. A 3′-hasított és intakt AP-helyek együttes frakciója a putreszcin-kezelés és az Exo III és putreszcin kombinált kezelése közötti különbség volt. A megmaradt AP-helyek a nem tisztított aldehidikus léziók számát mutatták.
Az AP-helyek II-es típusú AP-endonukleáz általi 5′ hasítása után a metszett AP-helyeket ezt követően a DNS-gerincről az 5′-dRp-maradékok kivágása révén kell felszabadítani. Ezt a felszabadítási folyamatot valószínűleg a dRp-áz végzi el hidrolitikus reakcióval (11) vagy β-eliminációval (12), vagy egy olyan endonukleolitikus enzim segítségével, amely az 5′-dRp-részeket az 5′-dRp után metszi (13). Kimutatták, hogy a Xenopus és a humán β-pol az 5′-dRp-t β-eliminációval szabadítja fel (14). A β-pol-null vagy -hiányos sejtekben a javítófoltok méretét használva kimutatták, hogy a β-pol-hiányos sejtekben egyetlen résjavító útvonal dominált, de a β-pol-null sejtekben nem (15). Ezenkívül a humán AP-endonukleáz és a β-pol közötti kölcsönhatás in vitro felgyorsítja az 5′-dRp-maradékok felszabadulását (16). Az 5′-dRp-részek javítási hatékonyságát azonban sem sejtekben, sem in vivo nem jellemezték jól. Élesztősejtmentes kivonatok felhasználásával megállapították, hogy az 5′-dRp-részek feldolgozása az uraciltartalmú DNS báziskiválasztásos javításának sebességkorlátozó lépése (17). Vizsgálták továbbá a β-pol katalitikus hatékonyságát az 5′-dRp eltávolításában (18). Érdekes módon a β-pol 5′-dRp-áz aktivitásának Kcat értéke ∼100-szor alacsonyabb volt, mint az AP endonukleáz Kcat értéke. Ez a vizsgálat egyértelműen bizonyítja az 5′-incizált AP-helyek perzisztenciáját patkány és humán szövetekben. Ezek az adatok arra utalnak, hogy az AP-endonukleáz általi inzekció és az azt követő 5′-dRp-maradékok felszabadulása in vivo nem feltétlenül kapcsolódik össze hatékonyan alapszinten, és hogy az 5′-dRp javítási folyamata lehet a bázis-kivágásjavítás egyik sebességkorlátozó lépése.
A korábbi tanulmányban (3) kimutattuk, hogy fiziológiás körülmények között naponta 106 nukleotidonként 1,5 AP-helyen történt spontán depurináció. Annak vizsgálatára, hogy az agyban található magasabb számú endogén AP-helyek forrása vajon a hőálló DNS-adduktok, mint például az N3- és N7-alkil-purinok, depurinációs vizsgálatot végeztünk agyi és máj-DNS-en. Az agyban és a májban azonban nem észleltünk különbséget (az adatok nem láthatóak). Ezért az endogén AP-helyek állandósulása nem biztos, hogy labilis bázislézióknak köszönhető. Az egyik legfontosabb és leggyakoribb endogén DNS-elváltozás az oxidatív DNS-báziskárosodás. Arról számoltak be, hogy az 5-hidroxi-citozin állandósult állapota patkányagyban ∼2-szer magasabb, mint patkánymájban (19). Az ilyen oxidatív pirimidinbázisokat az End III javítja, AP-helyeket hagyva a DNS-gerincen. Annak vizsgálatára, hogy az oxidatív stressz összefüggésbe hozható-e a DNS-ben lévő AP-helyek steady-state számával, az End III-érzékeny helyeket az ASB assay és az E. coli End III kombinációjával számoltuk. Az End III-érzékeny helyek száma háromszor magasabb volt az agyban (14 károsodás 106 nukleotidra vetítve), mint más szövetekben (4-5 károsodás 106 nukleotidra vetítve). Nemrégiben klónozták és jellemezték az End III gén humán homológját (hNTH1) (20). E gén mRNS-expressziója szervenként az endogén AP-helyek számának megfelelő mintázat szerint változik (20). Az oxidált bázisok javításában részt vevő legtöbb DNS-glikoziláz rendelkezik AP-liáz aktivitással, amely az AP-helyek 3′ oldalát hasítja. Ezért az endogén 5′ AP-helyek nem az oxidált bázisok ilyen DNS-glikozilázok általi hasításából származnának. Egy előzetes kísérlet azt mutatta, hogy a hidrogén-peroxid FeSO4-mal közvetlenül, enzimek nélkül indukált 5′-hasadt AP-helyeket a borjú tímusz DNS-ben (az adatok nem láthatóak). Ezek a vizsgálatok arra utalnak, hogy az oxidatív stressz lehet az egyik olyan tényező, amely az 5′ hasítású AP-helyek állandósulásáért felelős.
Eredetileg arra számítottunk, hogy a genomi DNS-ben alacsony számban találunk endogén AP-helyeket a toxicitásuk és mutagén hatásuk miatt. Ez a vizsgálat azonban azt mutatja, hogy az AP-helyek állandósult állapota ∼1 elváltozás 105 nukleotidra vetítve a genomi DNS-ben. Bár az AP-helyek folyamatosan javításra kerülnek, az AP-helyek javításon kívül eső része valószínűleg hozzájárul a mutációkhoz, kromoszóma-aberrációkhoz és transzkripciós hibákhoz, amelyek a spontán korral járó betegségekhez, például a rákhoz és a degeneratív rendellenességekhez köthetők.