Cellavonalak
A sejtvonalak és forrásaik a következők: 293T (ATCC CRL-11268), 786-O (ATCC CRL-1932) és HK-2 (ATCC CRL-2190). A THP-1 sejteket a Kínai Tudományos Akadémia őssejtbankja bocsátotta rendelkezésünkre. A sejteket DMEM (293T és 786-O esetében), MEM (HK-2 esetében) vagy RPMI 1640 (THP-1) táptalajban, 10% magzati szarvasmarha szérummal és 2 mM l-glutaminnal, 37 °C-on, 5% CO2 jelenlétében tenyésztettük. A baktériumokkal való fertőzés, a fehérjékkel való kezelés vagy a kemotaxis analízis előtt a táptalajt szérummentes táptalajra cseréltük.
Baktériumtörzsek és plazmidok
A vizsgálatban használt baktériumtörzseket és plazmidokat az S3 kiegészítő táblázat tartalmazza. Az E. coli törzseket 37 °C-on, Luria-Bertani (LB) táptalajon, statikus körülmények között 12 órán keresztül tenyésztettük, szükség esetén megfelelő antibiotikumokkal, a következő koncentrációkban: Kanamicin 50 μg/ml, ampicillin 100 μg/ml és klóramfenikol 15 μg/ml. A ΔhlyA törzset a hlyA cat génnel való helyettesítésével hoztuk létre λ-Red rekombináz segítségével. A ∆hlyA p-hlyA törzs létrehozásához a hlyA gént PCR-rel amplifikáltuk az UPEC CFT073 törzs kromoszómájából, és a KpnI és XbaI enzimhelyeken ligáltuk a pTRC99A törzsbe, majd a plazmidot elektroporációval transzformáltuk a ∆hlyA törzsbe. A CFT073-ból származó hlyC és hlyA géneket vagy a Nektin-2-t kódoló komplementer DNS-t (cDNS) PCR-rel felszaporítottuk és klónoztuk a pET-28a ( + ) plazmába, hogy aktív FLAG- vagy HA-jelölt HlyA vagy Nektin-2 rekombináns fehérjéket állítsunk elő. Az inaktív FLAG-taggal jelölt HlyA (pro-HlyA) előállításához a CFT073-ból származó hlyA gént a hlyC nélkül a pET-28a ( + ) enzimhelyeken XbaI és XhoI klónoztuk. A Myc-címkézett Nektin-2-t a pLenti-Hygro vektorba integráltuk a transzfekcióhoz.
HlyA, pro-HlyA és humán Nektin-2 rekombináns fehérje expressziója és tisztítása
A rekombináns HlyA vagy pro-HlyA expresszióját E. coli BL21 (DE3)-ban, a Nektin-2 expresszióját pedig Rosetta (DE3)-ban végeztük. A 100 μM IPTG-vel történő indukció előtt a baktériumokat 37 °C-on tenyésztettük, amíg el nem érték a 0,6-0,8 OD600 értéket. A tenyésztett baktériumokat 12 órás, 16 °C-on, IPTG-t tartalmazó LB-ben végzett 16 órás indukció után centrifugálással (8000 × g 5 percig 4 °C-on) gyűjtöttük össze. A baktériumokat lizozimmal és ultrahanggal lizáltuk, majd a felülúszót centrifugáltuk a részecskék eltávolítása érdekében (18 000 × g 30 percig 4 °C-on). A fehérjéket ezután Ni-NTA tisztító rendszerrel (GenScript, Nanjing, Kína) tisztítottuk. A fehérjéket 250 mM imidazollal eluáltuk. A HlyA fragmentumokat tartalmazó frakciókat összevontuk, 150 mM imidazolban, 50 mM imidazolban és kétszer PBS-ben dializáltuk. Ezt követően a kívánt fehérjét tartalmazó frakciókat Amicon Ultra-15 centrifugális szűrőegységek (Millipore, Burlington, MA, USA) segítségével 500 μl-re koncentráltuk. A tisztított HlyA fehérjéhez hasonló ionos környezettel rendelkező utolsó dialízispuffert a tisztított fehérje kontrolljaként használtuk a kísérletek során. A végső fehérjekoncentrációt spektrofotometriásan határoztuk meg (Nanodrop-2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) a BCA Protein Assay Kit (23225, Thermo Scientific) segítségével.
Egerek pyelonephritis modellje
Minden állatkísérletet a Tianjin Medical University (Tianjin, Kína) Állatgondozási és Állatfelhasználási Bizottsága felülvizsgált és jóváhagyott. Minden erőfeszítést megtettünk az állatok szenvedésének minimalizálására és a felhasznált állatok számának csökkentésére. A 6-8 hetes nőstény C57BL/6J egereket a Katonai Orvosi Tudományos Akadémiától (Peking, Kína) vásároltuk. Az akut pyelonephritis egérmodellt a korábban leírtak szerint hoztuk létre.53 A baktériumokat egy éjszakán át statikus LB táptalajban tenyésztettük 37 °C-on. A tenyésztett baktériumokat centrifugálással (5000 × g 5 percig 4 °C-on) pelletáltuk és PBS-ben reszuszpendáltuk, hogy 2 × 1010 CFU/ml sűrűséget kapjunk. 3 órás időközönként altatott nőstény C57BL/6J egereket intraurethralisan beoltottunk kétszer 50 μl UPEC törzzsel (109 CFU).54,55 12, 24 és 48 óra elteltével az egereket feláldoztuk, veséjüket aszeptikusan eltávolítottuk és 1 ml 0,025% Triton X-100-t tartalmazó PBS-ben homogenizáltuk, majd sorozatosan hígítottuk a baktériumok megszámlálásához. 24 hpi-kor a veseszöveteket áramlási citometriás, szövettani és pro-inflammatorikus citokin analízisre is felhasználtuk.
Áramlási citometriás analízis
Az egysejtű szuszpenziókat 1,5 mg/ml kollagenáz IV (C5138, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) és 100 ng/ml DNáz I PBS-ben történő emésztésével állítottuk elő 30 percig 37 °C-on, enyhe rázás mellett. Az emésztett sejtszuszpenziókat ezután 70 μm-es sejtszűrőn (352350, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) keresztül szűrtük, hogy egysejtes szuszpenziókat kapjunk. Az Fc-receptorokat CD16/32 (101319, Biolegend, San Diego, CA, USA) segítségével blokkoltuk, majd az egysejtes szuszpenziókat a következő antitestekkel inkubáltuk: (17-0112-82, Thermo Fisher Scientific), anti-Ly6G konjugált PE-vel (127608, Biolegend), anti-F4/80 konjugált FITC-vel (11-4801-82, Thermo Fisher Scientific), anti-CD11c konjugált PE-vel (127608, Biolegend), anti-CD206 konjugált PerCP/Cy5-vel.5 (141716, Biolegend). A sejteket FACSCanto II áramlási citométeren (BD Biosciences) elemeztük a Flow Jo szoftver (FlowJo, Ashland, OR, USA) segítségével.
H&E festés és immunhisztokémia
A veséket 10% foszfáttal pufferelt formalinban fixáltuk legalább 24 órán keresztül, majd a fixált szövetet paraffinba ágyaztuk és 5 mm-es metszetekre vágtuk. A preparátumokat hematoxilinnal és eozinnal festettük meg. A vese szövettani elváltozásait egy 6 pontos skála segítségével értékeltük, amelyben a 0, 1, 2 és 3 normális, enyhe, mérsékelt és súlyos szövettani elváltozásokat jelzett (a kóros károsodás elsősorban a medullában és a kortikális-medulláris átmenetben helyezkedett el); míg a 4, 5 és 6 enyhe, mérsékelt és súlyos szövettani elváltozásokat jelzett (a kóros károsodás elsősorban a vese több részén helyezkedett el). A szövettani vizsgálatokat két személy elemezte, akik vakok voltak a kísérleti csoportok tekintetében.56,57 Az immunhisztokémiai elemzéshez a metszeteket anti-Nektin-2 antitesttel (27171-I-AP, 1:200, Proteintech, Chicago, IL, USA) festették meg. A képeket mikroszkóp alatt készítettük (BX46, Olympus, Tokió, Japán).
A szövetek és sejtek immunfluoreszcens elemzése
A veséket folyékony nitrogénnel OCT vegyületbe ágyaztuk. A fagyasztott blokkokat 5 µm-es metszetekre vágtuk, majd 1 órán át szobahőmérsékleten levegőn szárítottuk, és 10 percig hideg acetonnal fixáltuk. A fagyasztott metszeteket ezután azonnal 20 percre metanolba, majd 10 percre 3%-os hidrogén-peroxiddal kevert metanolba merítettük. A szöveteket 5%-os szarvasmarha szérumalbuminnal (BSA) 1 órán át blokkoltuk, majd szükség esetén anti-F4/80 antitesttel (ab6640, Abcam, 1:200), anti-Ly6G antitesttel (ab210402, Abcam, 1:200), Nektin-2 antitesttel, (ab135246, Abcam, 1:200) blokkoló pufferben egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk. Ezután a tárgylemezeket ötször mostuk PBS-szel, majd Alexa Fluor 488/549-jelölt másodlagos ellenanyaggal (Proteintech, 1:200) inkubáltuk 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. A sejtmagok láthatóvá tételéhez a szöveti metszeteket DAPI-val ellenfestettük. A képeket fluoreszcens mikroszkóp alatt készítettük (IX73, Olympus). A pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2-vel transzfektált 293T sejteket Lab-Tek kamrás fedőüvegen növesztettük és 75 nM HlyA-val kezeltük 6 órán keresztül, majd 4%-os paraformaldehiddel fixáltuk 15 percig, és anti-MYC-Tag antitesttel (66003-2-Ig, 1:25, Proteintech) és HA-Tag antitesttel (2367S, 1:200, CST) immunfluoreszcens festést végeztünk 4 °C-on egy éjszakán át. Alexa Fluor 488/594-jelölt második antitestet (Proteintech) használtunk, szobahőmérsékleten inkubálva 1 h. A sejteket konfokális fluoreszcens mikroszkóppal (FV1000-D, Olympus) képeztük le.
Vese epitélsejtek UPEC törzsekkel történő fertőzése
A humán vese epitélsejteket (786-O vagy HK-2) 24 lyukú lemezekbe vetettük, 24 órával az UPEC fertőzés előtt. Az ADAM10 gátlásához a sejteket a fertőzések előtt 20 órával előinkubáltuk a GI254023X (Sigma-Aldrich) ADAM10 gátlóval. A sejteket 6 órán keresztül fertőztük baktériumokkal a jelzett fertőzési multiplicitással (MOI), vagy 12 órán keresztül stimuláltuk a tisztított HlyA vagy pro-HlyA jelzett koncentrációival. Néhány kísérletben a sejteket ∆hlyA-val kezeltük (MOI 0.01), amelyet tisztított HlyA-val (75 nM) spicceltek 6 órán keresztül. Az inváziós vizsgálathoz a 6 órás fertőzést követően a sejteket ötször mostuk PBS-szel, majd 1 órán keresztül 200 μg/ml gentamicinnel kezeltük az extracelluláris baktériumok elpusztítása érdekében. Ezután a sejteket kétszer mostuk PBS-szel, majd 500 μl 0,2%-os triton X-100-mal PBS-ben lizáltuk, és LB agar lemezekre ültettük az intracelluláris baktériumok megszámlálásához.
Enzimhez kötött immunoszorbens teszt (ELISA)
A fertőzött 786-O sejtek, a HlyA/pro-HlyA-val kezelt 786-O sejtek vagy a fertőzés után homogenizált vesék felülúszójában a GM-CSF szintjét ELISA fejlesztőkészlettel (Neobioscience Technology Company, Shenzhen, Kína) mértük a gyártó utasításai szerint. Az egerek veséit eltávolítottuk és 1% Triton X-100-at és teljes mini-EDTA-mentes proteáz inhibitor koktél tablettát (11697498001, Roche, Indianapolis, IN) tartalmazó PBS-ben homogenizáltuk. A homogenátumokat 30 percig jégen inkubáltuk, majd 10 000 × g-n 10 percig 4 °C-on centrifugáltuk; a felülúszókat összegyűjtöttük és a GM-CSF, IL-1β, TNF-α, IL-6 és MIP-2 ELISA vizsgálatához használtuk a gyártó utasítása szerint (Neobioscience Technology Company, Shenzhen, Kína).
Citotoxicitási vizsgálatok
A tisztított fehérjékkel vagy dialízispufferrel 12 órán keresztül kezelt 786-O sejtek sejtkultúra felülúszóit gyűjtöttük, és CytoTox-96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit (G1780, Promega, Madison, WI, USA) segítségével kimutattuk a laktát-dehidrogenázt (LDH).
Páciensek vizeletmintái
A Tianjin Orvosi Egyetem Második Kórházában kezelés alatt álló UPEC-törzsekkel fertőzött betegektől gyűjtöttünk vizeletmintákat, és az egyes betegek vizeletéből izolált UPEC-törzsben a hlyA gén jelenlétét PCR segítségével határoztuk meg (S2 és S4 kiegészítő táblázatok). A vizeletet Amicon Ultra-15 centrifugális szűrőegységek (UFC901024, Millipore) segítségével 200 μl-re koncentráltuk, majd a koncentrált folyadékot ELISA fejlesztőkészlettel (Neobioscience Technology Company) detektáltuk. A betegmintákkal kapcsolatos vizsgálatokat a Tianjin Orvosi Egyetem Etikai Bizottsága jóváhagyta, és minden betegtől beszereztük az írásos beleegyezést.
RNS extrakció és qRT-PCR
786-O sejteket CFT073, ∆hlyA vagy ∆hlyA p-hlyA (MOI 0,01) fertőztünk 4 órán keresztül. Az RNS-t a gyártó protokolljának megfelelően Total RNA Extraction Kit (Solarbio, Peking, Kína) segítségével extraháltuk, majd a RevertAid First Strand cDNS Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific) segítségével reverz transzkripciót végeztünk. A qRT-PCR-t FastStart Universal SYBR Green Master mix (Roche, Basel, Svájc) segítségével végeztük egy 7900 Fast Real-Time PCR System (Roche) segítségével. A PCR ciklikus körülmények a következők voltak: 95 °C 5 percig, majd 40 ciklus 95 °C 20 másodpercig, 60 °C 20 másodpercig és 72 °C 20 másodpercig. A β-aktint használtuk endogén kontrollként, és az adatokat a vad típusú β-aktin transzkripciós szintje alapján normalizáltuk, és az összehasonlító kritikus küszöbciklus 2-∆∆Ct módszerrel számszerűsítettük. A felhasznált primereket az S4. kiegészítő táblázat tartalmazza.
Kémotaxis vizsgálatok
A sejtmigrációs vizsgálatokat Transwell-kamrák (pórusméret 5 μm, Costar, Corning 3421, Corning, NY, USA) segítségével végeztük. A THP-1 sejteket (2 × 106 200 μl-ben) újra szuszpendáltuk szérummentes RPMI 1640 médiumban, és a felső kamrába adtuk. A fertőzött 786-O sejtek felülúszóját 1 μg/ml humán GM-CSF elleni neutralizáló antitesttel (502203, BVD2-23B6, Biolegend) vagy kontroll IgG2a (400515, Rat IgG2a, Biolegend) kevertük és 30 percig inkubáltuk. Ezután 600 μl, a felülúszót tartalmazó médiumot adtunk az alsó kamrába kemoattraktánsként. A 3 órás vagy 6 órás 37 °C-on, 5%-os CO2 párásított légkörben történő inkubáció után megszámoltuk az alsó kamrában lévő migrált sejteket.
Klodronát liposzómák és anti-GM-CSF antitest kezelés
A makrofágok eliminálására 200 µl PBS-t vagy klodronát liposzómákat adtunk az egereknek intravénásan 24 órával a fertőzés előtt.32,33 A GM-CSF semlegesítésére GM-CSF elleni semlegesítő antitestet (505408, MP1-22E9, Biolegend, 250 µg) vagy kontroll IgG2a-t (400533, Rat IgG2a, Biolegend, 250 µg) adtunk be intravénásan az egereknek 1 órával a fertőzés előtt.33,58
Az antitestek és a western blotting
Az antitesteket a következő cégektől szereztük be: monoklonális anti-FLAG antitest (F1804, Sigma-Aldrich), anti-MYC-Tag antitest (66004-I-Ig, Proteintech, Chicago, IL, USA) és anti-Nectin-2 antitest (ab135246, Abcam, Cambridge, UK). A teljes sejtlizátumokat RIPA lízispufferrel (Millipore), teljes proteáz inhibitorokkal (Roche, Basel, Svájc) készítettük. A fehérjekoncentráció meghatározásához a BCA Protein Assay Kit-et (Thermo Fisher) használtuk. A HRP-konjugált antinyúl IgG-t (1:10000, Sigma-Aldrich) vagy antiegér IgG-t (1:10000, Sigma-Aldrich) használtunk az antitestek kötődésének kimutatására. Az immunreaktív komplexeket Immobilon Western kemilumineszcens HRP szubsztrát (Millipore) segítségével detektáltuk és GE Amersham Imager 600 gépen exponáltuk.
Távol-nyugati blotting és LC-MS/MS elemzés
A távol-nyugati blotting protokollt a korábban leírtak szerint végeztük.59 A 786-O sejteket kétszer mostuk jéghideg PBS-szel, majd a sejtmembrán fehérjéket a Membrane and Cytosol Protein Extraction Kit (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Kína) segítségével izoláltuk a gyártó protokolljának megfelelően. Az oldható membrán-asszociált fehérjéket nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel elemeztük 10%-os géleken. A fehérjéket ezután polivinilidén-fluorid (PVDF) membránra (Merck Millipore, Darmstadt, Németország) vittük át. A transzferált fehérjéket AC pufferrel renaturáltuk a guanidin-HCl koncentráció fokozatos csökkentésével.59 Ezután a membránt 5%-os sovány tejjel blokkoltuk TBST pufferben 1 órán keresztül. Ezt követően a membránt 30 μg/ml tisztított FLAG-taggal jelölt HlyA-val vagy dialízispufferrel inkubáltuk egy éjszakán át 4 °C-on. Mosás után a membránt 1:1000 arányban hígított anti-FLAG antitesttel (Sigma-Aldrich) inkubáltuk egy éjszakán át 4 °C-on 5%-os sovány tejben, TBST pufferben. Ezután a membránt alaposan mostuk, majd HRP-konjugált anti-egér IgG-vel inkubáltuk (1:10000, Sigma-Aldrich)
A dialízispuffer csoport és a FLAG-jelölt HlyA csoport közötti különböző sávokat LC-MS/MS segítségével azonosítottuk, amelyet egy nanoLC-LTQ-Orbitrap XL tömegspektrométer (Thermo, San Jose, CA, USA) és egy Eksigent nano LC 1D plus HPLC rendszerrel összekapcsolt nanoLC-LTQ-Orbitrap XL tömegspektrométerrel végeztünk a Majorbio (Sanghaj, Kína) vállalatnál. A kriptikus peptideket teljesen enzimatikusan emésztettük és ionizáltuk nano elektrospray ionizációval.33 Az adatokat teljes letapogatású tömegspektrummal (300 és 1800 m/z között) elemeztük. Végül a Proteome Discoverer (1.4.0.288 verzió, Thermo Scientific) programot használtuk az MS-adatok elemzéséhez.
RNS-interferencia és Nektin-2 overexpresszió
A célzott génekre vonatkozó kis interferáló RNS-eket (siRNS) és egy sramblezett kontroll siRNS-t (siScr) a GenePharma (Shanghai, Kína) szintetizálta. Az siRNS-eket Lipofectamine 3000 (Invitrogen) segítségével transzfektáltuk 786-O vagy HK-2 sejtekbe. pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2-t Lipofectamine 3000 (Invitrogen) segítségével transzfektáltuk 786-O vagy HK-2 sejtekbe a Nectin-2 felülreprezentálása céljából. Negyvennyolc órával a transzfekciót követően a sejtek fehérjeexpresszióját Western blotting segítségével elemeztük. Az siRNS-ek szekvenciáit az S4. kiegészítő táblázat tartalmazza.
Immunoprecipitáció
293T sejteket transzfektáltuk a pLenti-Hygro vektorral vagy a pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2-vel, majd 48 órán át tenyésztettük. A sejteket ezután a transzfekciót követően 6 órán keresztül FLAG-taggal jelölt HlyA-val (75 nM) inkubáltuk, majd lízispufferben (50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1% NP-40, 0,2 mM EDTA, 150 mM NaCl) frissen lizáltuk őket a western blotting vagy immunprecipitációs (IP) vizsgálatokhoz. A 786-O sejteket FLAG-taggal jelölt HlyA-val (75 nM) vagy dialízispufferrel inkubáltuk 6 órán keresztül, majd lízispufferrel lizáltuk a fehérje IP-vizsgálathoz. A sejtek felülúszóját anti-FLAG M2 gyöngyökkel (A2220, Sigma-Aldrich) vagy anti-Myc M2 gyöngyökkel (A7470, Sigma-Aldrich) inkubáltuk 12 órán keresztül 4 °C-on a FLAG-taggal jelölt vagy Myc-taggal jelölt fehérje IP-hez. A Nektin-2 fehérje IP-hez a sejtek felülúszóját anti-Nektin-2 antitesttel (ab135246, Abcam) inkubáltuk 12 órán keresztül 4 °C-on, majd Protein A/G agarózzal (20241, Thermo Fisher) inkubáltuk 2 órán keresztül 4 °C-on. Kontrollként normál nyúl IgG-t (2729S, CST) használtunk. Az inkubációt követően a csapadékot centrifugálással gyűjtöttük össze, ötször mostuk lízispufferrel, majd monoklonális anti-FLAG antitest, anti-MYC-Tag antitest vagy anti-Nektin-2 antitest alkalmazásával immunoblottinggal elemeztük.
A bakteriálisan expresszált, tisztított rekombináns FLAG-taggal jelölt HlyA-t (1 µg) 1 μg bakteriálisan expresszált, tisztított rekombináns Nektin-2-vel inkubáltuk kötőpufferben (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,1% Triton-X 100, 100 mM NaCl, 20% glicerin,1% BSA) 12 órán keresztül, majd a komplexeket FLAG-taggal jelölt fehérje IP vagy Nektin-2 fehérje IP-nek vetettük alá. Végül a komplexált fehérjéket immunoblotting segítségével elemeztük.
Statisztikai elemzés
A csoportok közötti különbségek statisztikai szignifikanciáját varianciaanalízissel (ANOVA) vizsgáltuk. Az in vivo kísérletekben a statisztikai szignifikancia kiszámítására a nemparametrikus Mann-Whitney-tesztet használtuk.