Abstract
Egy urémiás betegnél tuberkulózisfertőzést követően hiperkalcémia alakult ki, és ionizált kalciumszintje korrelált az 1,25-dihidroxivitamin D3 (1,25(OH)2D3) szintjével. További vizsgálatokat végeztünk annak megállapítására, hogy a monociták a vese tubuláris sejteken kívül alternatív helyszínei-e az 1,25(OH)2D3 átalakulásának. Ebben a vizsgálatban ex vivo bioteszt segítségével azt találtuk, hogy az 1-α-hidroxiláz (CYP27B1) aktivitása a monocitákban szignifikánsan magasabb aktív tuberkulózisban (TBC) szenvedő betegeknél, mint azoknál, akik gyakran érintkeznek TBC-vel. Amikor azonban az aktív TBC-s betegek monocitáit Mycobacterium tuberculosisból származó antigénnel újra stimuláltuk, kevesebb 1,25(OH)2D3-t figyeltünk meg. Ezzel szemben az 1,25(OH)2D3 szintje nem változott a gyakori TB-kontaktusban lévőknél. Arra a következtetésre jutottunk, hogy a monociták alternatív forrása lehet az 1-α-hidroxiláz, amely a 25-hidroxivitamin-D3-at az aktívabb 1,25(OH)2D3-á alakíthatja át.
1. Bevezetés
A tuberkulózis a történelem előtti idők óta sújtja a világot. Egy nemrégiben készült jelentés szerint évente egymillió beteg esik áldozatul a tuberkulózisnak és a kapcsolódó társbetegségeknek . Az elmúlt évtizedekben óriási erőfeszítéseket tettek a betegség patofiziológiai folyamatának megértésére. Állatmodellek és humán vizsgálatok megnyitották az utat a Mycobacterium tuberculosisra (MTB) adott egyéni immunválaszok tisztázása előtt. Ezek a vizsgálatok bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy a D-vitamin fontos szerepet játszik az ember tuberkulózissal szembeni ellenálló képességében. 200 éve használják a D-vitamint a tuberkulózis elleni küzdelemben. A tőkehalmájolajat és a kalciferolt, a D-vitamin fő forrásait a 17. század óta használják tuberkulózisos betegek kezelésére . A normál fiziológiában a napsugárzás után a bőrben tárolt 7-dehidrokoleszterin D3 previtaminná alakult át, amit termikus izomerizáció követett D3-vitaminná . Ezután a D3-vitamin a májban 25-hidroxivitamin D3-á (25(OH)D3) hidroxilálódik. Ezután a 25(OH)D3-at az 1- hidroxiláz (CYP27B1) tovább hidroxilálja a D3-vitamin legaktívabb formájává, 1,25(OH)2D3-á. A vese tubuláris epitélsejtek az 1- hidroxiláz fő forrása, és kritikus szerepet játszanak a szérumban lévő 1,25(OH)2D3 koncentrációjának meghatározásában . A CYP27B1 jelenlétét a vesén kívüli szövetekben már évtizedek óta ismerik . Az extrarenális CYP27B1 hatását az 1,25(OH)2D3 szérumkoncentrációjára még nem határozták meg.
Egy 34 éves urémiás beteggel találkoztunk, aki 2 éve rendszeres hemodialízisben részesült. A beteg 2 napig fáradékonysággal járó izomgyengeséget tapasztalt, mielőtt felkereste a háziorvost. A vérkémia emelkedett ionizált kalciumszintet mutatott (5,44 mg/dl). A hiperkalcémia ellenére a beteg tünetei a hagyományos kezeléssel enyhültek. Négy hónappal később a betegnél progresszív izomgyengeséget tapasztaltak, amelyet láz kísért. A sürgősségin ismét emelkedett ionizált kalciumszintet észleltek (6,88 mg/dl). Emellett az EKG rendellenes szívritmust és rövid QT-intervallumot mutatott ki kiszélesedett T-hullámmal. A mellkasröntgen a jobb felső lebenyben tüdőinfiltrációt mutatott, amelyről később megállapították, hogy tüdőtuberkulózis. A beteg ezután 9 hónapos antituberkulózis-kezelésben részesült. Négy hónappal a kezelés után a beteg ionizált kalciumszintje normalizálódott (5,2 mg/dl), és a tünetek teljesen megszűntek. A beteg hypercalcaemiája patogenezisének tisztázása érdekében az ionizált kalciumszintek mellett 1,25(OH)2D3-szinteket is mértünk. Amint az 1. ábrán látható, az 1,25(OH)2D3 szintje magasan korrelált az ionizált kalcium szintjével.
Az ionizált kalcium és az 1,25(OH)2D3 koncentrációjának változása egy aktív TBC-s és urémiás beteg szérumában.
A renális CYP27B1-expresszió mellett a makrofágokat és a monocitákat a CYP27B1-expresszió fontos extrarenális helyeinek tekintik. Ebben a vizsgálatban ex vivo bioteszt segítségével értékeltük a monociták szerepét a D3-vitamin metabolizmusában. Továbbá, a monocitákat MTB-ből származó antigénnel stimuláltuk, hogy további betekintést nyerjünk abba, hogy a monociták hogyan modulálják a D3-vitamin metabolizmusát a bakteriális kihívásra adott válaszként.
2. Anyagok és módszerek
2.1. A monociták és a D3-vitamin metabolizmusa. Alanypopuláció
Ezt a vizsgálatot a Kaohsiung Orvosi Egyetemen végeztük. A résztvevőket két csoportra rétegezték: (1) aktív tbc-sek és (2) gyakori tbc-s érintkezők. Az aktív tüdőtuberkulózisban szenvedőket, akiknél a köpettenyésztés és a mellkasfilm megerősítette az aktív TBC csoportba sorolták (). A gyakori TBC-kontaktok () a következők voltak: (1) az egészségügyi személyzet, akik legalább 10 éve dolgoztak a tbc-központban, és soha nem fertőződtek meg, valamint (2) a tbc-s betegek családtagjai, klinikusok és ápolók, akik hosszú távon érintkeztek tbc-s betegekkel, és soha nem fertőződtek meg. Minden gyakori tbc-s kontaktot beoltottak BCG-vel, és évente mellkasröntgenvizsgálatnak vetették alá őket; ha a mellkasfelvételek kórosak voltak, Mantoux-tesztet végeztek. Kizártuk a cukorbetegségben, rosszindulatú daganatos betegségben vagy bármely más, immunhiányt okozó betegségben szenvedő személyeket. A két csoport neme és életkora megegyezett (1. táblázat).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| A betegség időtartamát a diagnózistól a vérvételig eltelt idő alatt határozták meg. A megbetegedés időtartamát a tbc-központban való munkavégzés kezdetétől a vérvételig eltelt időszakként határoztuk meg. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.2. táblázat. Sejtelőkészítés
A perifériás vér mononukleáris sejtjeit (PBMC) a donorok 2 csoportjától gyűjtött heparinnal kezelt vérből izoláltuk standard Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Svédország) gradiens segítségével. A PBMC-ket ( sejtek/ml) L-glutaminnal és 10% magzati borjúszérummal kiegészített RPMI 1640 közegben reszuszpendáltuk. A 75 cm2 -es lombikban, párásított 37 °C-os, 5% CO2 -os inkubátorban történő 1 órás inkubáció után a nem megtapadó sejteket tartalmazó közeget kúpos csőbe dekantáltuk, és a lombikot kétszer szérummentes közeggel mostuk, hogy eltávolítsuk a maradék nem megtapadó sejteket. A megtapadt monocitákat műanyag sejtkaparóval történő óvatos lekaparással távolítottuk el. A sejteket egy kúpos csőbe helyeztük át, centrifugáltuk a mosóoldat eltávolítása érdekében, és sejt/ml-re reszuszpendáltuk a sejteket kiegészített tápfolyadékban. Az adherens sejtpopuláció több mint 85%-ban CD14+ sejteket tartalmazott.
2.3. Antigén
A tuberkulózisos betegekből izolált MTB-t foszfát-pufferelt sóoldatban reszuszpendáltuk, majd 70 °C-os vízfürdőben 70 percig 70 °C-on hőkezeltük. A baktériumokat ezután New Highway szonikátorral (Farmingdale, NY, USA) szonikáztuk. A bakteriális homogenátum fehérjekoncentrációját a Pierce BCA protein assay kit (IL, USA) segítségével határoztuk meg és -20°C-on tároltuk.
2.4. Citofluorometriai elemzés
A citometriai elemzést FACS citométerrel (Becton Dickinson) végeztük. A sejteket minden egyes monoklonális antitesttel telítő mennyiségben 50 μL festőpufferben (Hank kiegyensúlyozott sóoldata: 1% BSA és 0,1% nátrium-azid) 1 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd háromszor mostuk PBS-szel. A sejteket 500 μL 1%-os paraformaldehidben PBS-ben történő szuszpenzióval készítettük elő az elemzéshez. A monocita-populációt oldalirányú szórás és előreirányú szórás pontdiagramja alapján választottuk ki az elemzéshez. Az egyes elemzésekhez összesen 5000 gated sejtet használtunk fel. A bekapcsolt sejteket fluoreszcens festéssel tovább elemeztük fluoreszcein-izotiocianát- (FITC-) konjugált anti-CD14 (Ancell) alkalmazásával.
2.5. Az 1,25(OH)2D3 mennyiségi meghatározása
Tisztított monocitákat tenyésztettünk sejt/mL sűrűségben 100 μL-ben egy 96 lyukú szövettenyésztő lemez minden egyes lyukában 200 nM 25(OH)D3-mal, 1%-os etanol végkoncentrációban feloldva. A reakció leállításához 3 óra inkubáció után 1 ml acetonitrilt adtunk. A sejteket és a tápfolyadékot leszedtük, és a lipidek eltávolítása érdekében azonos térfogatú metanollal egyesítettük. Az 1,25(OH)2D3 mennyiségét az 1,25-dihidroxivitamin D 125I RIA kit (INCSTAR, Stillwater, MN, USA) segítségével határoztuk meg. Röviden, 2 ml vizet és 5 ml metanolt/vizet (70 : 30) adtunk egy C18OH patronhoz a sók, poláros lipidek és pigmentek vákuum alatti eltávolításához. Ezután 5 mL hexánt/metilén-kloridot (90 : 10) adtunk a C18OH patronhoz a 25(OH)D3 eltávolításához, majd 5 mL hexánt/izopropanolt (99 : 1) adtunk a 24,25(OH)2D3/25,25(OH)2D3 eltávolításához. Mindegyik C18OH-patront szorosan egy szilícium-dioxid-patronnak a belsejébe illesztettük. A hexán/izopropanol (92 : 8) vákuum alatti hozzáadása után a C18OH-patront eltávolítottuk. Végül a tisztított 1,25(OH)2D3-at 5 ml hexán/izopropanollal (80 : 20) eluáltuk ki a szilikapatronnal. Az 1,25(OH)2D3 szintjét 125I-jelölt anti-1,25(OH)2D3 és anti-1,25(OH)2D3 antitestek felhasználásával kompetitív radioimmunoassay (RIA) segítségével határoztuk meg.
2.6. Kezelés MTB antigénekkel
A monocitákat ( sejtek/mL) 10 μg/mL MTB-vel és 200 ng/mL 25(OH)D3-mal inkubáltuk. Az inkubáció 3 órája után 1 mL acetonitrilt adtunk a reakció leállításához. Az így kapott 1,25(OH)2D3-at tisztítottuk a sejtekből és a közegből, és RIA-val mennyiségi meghatározást végeztünk. Az eljárás további része megegyezett az előző vizsgálatéval.
2.7. Statisztikai elemzés
Minden adatot Student-teszt segítségével elemeztünk.
3. Eredmények
3.1. Az eredmények
3.1. Ionizált kalcium és 1,25 Dihidroxivitamin D3 koncentráció aktív tbc-s és urémiás betegnél
A szérum ionizált kalcium és 1,25(OH)2D3 koncentrációját különböző időpontokban határoztuk meg az első látogatástól a tuberkulózis elleni kezelés befejezését követő egy évig. Amint az 1. ábrán látható, az ionizált kalcium szintje korrelált az 1,25(OH)2D3 koncentrációjával (1. ábra)
3.2. Vizsgálati populáció
Huszonöt személyt vontak be a gyakori TB-kontaktus csoportba és 25 beteget az aktív TB csoportba. Az átlagéletkor és a nemek aránya nem különbözött jelentősen a csoportok között. Az adathalmaz jellemzőit az 1. táblázat mutatja be.
3.3. Az adathalmaz jellemzői. 1,25(OH)2D3 kvantitáció
A monocitákat 25(OH)D3-mal tenyésztettük 3 órán keresztül. Ezután az 1,25(OH)2D3-at tisztítottuk a sejtekből és a közegből, és RIA-val mértük. Amint a 2. ábrán látható, az 1,25(OH)2D3 mennyisége az aktív TB csoportban pg/ml volt (átlag ± SD), ami szignifikánsan magasabb volt, mint a gyakori TB-kontaktus csoportban () (). Amikor a monocitákat egyszerre inkubáltuk MTB-vel és 25(OH)D3-mal 3 órán keresztül, az 1,25(OH)2D3 mennyisége az aktív TB csoportban jelentősen csökkent az MTB nélküli csoporthoz képest ( és , illetve) () () (lásd a 3. ábrát). A gyakori TB-kontaktus csoportban ( és , ill.) nem volt különbség az MTB-nek kitett és nem kitett monociták között.
Az 1,25(OH)2D3 mennyiségi meghatározása aktív TB-s betegeknél és gyakori TB-kontaktusokban. A 25(OH)D3-mal 3 órán át tenyésztett monocita szuszpenziókból tisztított 1,25(OH)2D3 RIA-mérése. Az 1,25(OH)2D3 mennyisége az aktív TBC-s csoportban szignifikánsan magasabb volt, mint a gyakori TBC-s kontaktuscsoportban. Az egyes oszlopok az 1,25(OH)2D3-kvantitások átlagát jelentik. A hibasávok a standard eltérést jelölik. *.
Az 1,25(OH)2D3 mennyiségi meghatározása aktív TBC-s betegeknél és gyakori TBC-kontaktoknál M. tuberculosis (MTB) antigénnel vagy anélkül. Monocitákat 25(OH)D3-mal pulzáltak MTB-vel vagy anélkül. Az 1,25(OH)2D3 mennyisége MTB-expozícióval szignifikánsan csökkent az aktív TB-csoportban az MTB nélküli csoporthoz képest. Az egyes oszlopok az 1,25(OH)2D3-kvantitások átlagát jelentik. A hibasávok a standard eltérést jelölik. *.
4. Megbeszélés
Megfigyeltük, hogy az 1,25(OH)2D3-szintek korreláltak az ionizált kalciumszintekkel egy tüdőtuberkulózisban szenvedő urémiás betegnél. Aktív tüdőtuberkulózisban az 1,25(OH)2D3 szérumszintje magas volt ennél a betegnél, ami viszont magas ionizált kalciumszintet indukált. A kezelés után mind az 1,25(OH)2D3, mind az ionizált kalcium szintje csökkent. Elméletileg egy urémiás betegnél a vese CYP27B1 aktivitása jelentéktelen. Az urémiás betegeknél gyakran megfigyelhető alacsony szérum 1,25(OH)2D3-szint . Az emberekben megfigyeltekkel összhangban egy anefriás egérmodellben is alacsony 1,25(OH)2D3-szintek figyelhetők meg . A CYP27B1 extrarenális forrását azonban már több mint 6 évtizede leírták. Harrell és Fisher az elsők között találták meg az 1,25(OH)2D3 extrarenális szintézisét patológiás körülmények között . Ezek a szerzők megállapították a diszregulált kalcium-homeosztázis és a szarkoidózis közötti összefüggést. Később kimutatták, hogy a szöveti makrofágok az 1,25(OH)2D3-termelés extrarenális forrását jelentik ezekben a betegcsoportokban . A különböző vizsgálati csoportok egyre több szövetben találtak CYP27B1 expressziót, például a bőr melanocitáiban, a szöveti makrofágokban és a placenta maradék sejtjeiben . Meglepő módon nem minden CYP27B1-et expresszáló sejt rendelkezik enzimaktivitással . Annak tisztázására, hogy a keringő monociták hozzájárulhatnak-e a magas 1,25(OH)2D3-szintekhez, ex vivo biotesztet alkalmaztunk, amelyben a CYP27B1 aktivitásának meghatározására 25(OH)D3-t használtunk szubsztrátként. Eredményeink azt mutatják, hogy az aktív tbc-s betegek monocitáiban a CYP27B1 aktivitása szignifikánsan magasabb, mint a gyakori tbc-s kontaktusban lévő egyének monocitáiban. A keringő monociták hozzájárulnak a 25(OH)D3 aktívabb 1,25(OH)2D3-á történő átalakulásához. Érdekes módon a D3-vitamint hagyományosan endokrin faktornak tekintették; a helyi helyeken (vesetubulusokban) termelt 1,25(OH)2D3-t a vér szállítja, hogy más szövetekre vagy szervekre, például a csontokra hasson. Az utóbbi évtizedekben azonban bebizonyosodott, hogy a D3-vitamin nem csak endokrin funkciókat tölt be. A gyulladásos sejtek által termelt 1,25(OH)2D3 serkentheti a D-vitamin-receptor expresszióját mind a szomszédos sejtekben, mind magukban a gyulladásos sejtekben. A D-vitamin receptorhoz és a retinoid receptorhoz kötődve a ligandum-receptor komplex számos gyulladásos gén promóteréhez képes kötődni. E hatások miatt a D3-vitaminnak parakrin és autokrin funkciókat egyaránt tulajdonítottak. A D3-vitamin kalciumszabályozó endokrin funkciójával ellentétben parakrin és autokrin funkciói a gyulladásos sejteket antibakteriális peptidek termelésére késztetik, és fokozzák az autofágia folyamatát . Mivel az 1,25(OH)2D3 lokálisan termelődik, és nem jut el a kalcium-homeosztázis szabályozásának célpontjaihoz, termelése nem befolyásolja a szérum kalciumszintjét. Érdekes módon ebben a vizsgálatban azt találtuk, hogy a monociták által termelt 1,25(OH)2D3 egy speciális eset. Bár a monociták által termelt 1,25(OH)2D3 lokálisan képes hatni, ezeket a sejteket a vér szállítja a szövetekbe az egész testben. A monociták által termelt 1,25(OH)2D3 endokrin faktorként is viselkedik. A monociták talán az egyetlen olyan sejtek a szervezetünkben, amelyek képesek a D3-vitamin endokrin, parakrin és autokrin funkcióit összehangolni. Érdekes kérdés, hogy a monociták 1,25(OH)2D3-forrása milyen relatív mértékben járul hozzá a teljes 1,25(OH)2D3-szinthez. Dusso és munkatársai megfigyelték, hogy a monociták 1,25(OH)2D3 maximális termelése jelentéktelen (fmol/óra/mikrogramm DNS-ben) a normál 1,25(OH)2D3 koncentrációhoz képest (pmol/mL-ben) . Az adatok azonban ex vivo kísérletből származnak, nem tudjuk, hogy a szervezetben hány monocitát stimulálnak 1,25(OH)2D3 termelésére. Feltételezzük, hogy az 1,25(OH)2D3 monocita forrásának relatív hozzájárulása a teljes 1,25(OH)2D3 szinthez a legtöbb esetben kicsi. Még a granulomatosus betegségben szenvedő betegek közül is csak keveseknek vannak a magas 1,25(OH)2D3-szintből eredő hiperkalcémia klinikai tünetei. A mi indikátoros esetünk ezek közé tartozik.
Azt is megállapítottuk, hogy amikor aktív tbc-s betegek monocitáit MTB-antigénnel tenyésztik, az 1,25(OH)2D3 konverziója szignifikánsan alacsonyabb, mint amikor nem adnak hozzá antigént. A gyakori TB-kontaktusos csoportban nem volt különbség aközött, hogy MTB-antigénnel vagy anélkül voltak. Ennek a megfigyelésnek két lehetséges magyarázata van. Először is, az aktív TBC-s betegekből származó primed monociták több 24(OH)-hidroxiláz (CPY24) aktivitást indukálhatnak, mint társaik, amelyek aktívan hidroxilálják az 1,25(OH)2D3-at kalcitromsavvá, amikor MTB-antigénnel tovább stimulálják őket. a D3-vitamin nemcsak gyulladásos géntermékeket, hanem a CPY24 expresszióját is indukálja. A CPY24 a D3-vitamin egyik fő katabolikus enzime. A CYP27B1 és a CYP24 aktivitását szögesen ellentétes módon modulálják az 1,25(OH)2D3 szérumszintjének szabályozásához . Ennek az összehangolt hatásnak köszönhetően a betegeknél ritkán figyelhető meg hiperkalcémia. A gyakori TBC-vel érintkezők csoportja még jobb összehangolt működést mutatott, ezért nem volt változás az 1,25(OH)2D3 átalakulásában MTB-antigénnel történő stimulációt követően. A másik magyarázat az, hogy a CPY27B1 aktivitása kimerül, amikor a monocitákat újra stimulálják MTB-antigénnel.
Az mRNS-expressziót ebben a vizsgálatban a következő okok miatt nem határoztuk meg. Először is, az ex vivo bioteszthez nagyszámú résztvevőktől származó monocitára volt szükség. Ha mind a kvantitatív mRNS-expressziót, mind az ex vivo biotesztet elvégeztük volna, akkor minden egyes résztvevőtől több mint 30 ml vért kellett volna gyűjtenünk. Ennek a vérmennyiségnek a levételét etikai bizottságunk elutasította. Másodszor, mint korábban jeleztük, egyes szövetek kimutatható enzimaktivitás nélkül is kifejezhetik a CYP27B1-et. Az mRNS-szintek nem mindig korrelálnak az enzimaktivitással. A CYP27B1 expressziója ellenére egyes szövetekben nem mutattunk ki enzimaktivitást. A jövőbeli vizsgálatokban a CYP27B1 és a CYP24 szintjét, valamint a D3-vitamin metabolitjait, például a kalcitromsavat és a 24,25(OH)2D3-at, számszerűsíteni kell a D3-vitamin metabolizmusának tisztázása érdekében a tuberkulózis patofiziológiai folyamatában.
5. Következtetés
Végeredményben a kalciumszintek korreláltak az 1,25(OH)2D3-szintekkel egy tuberkulózissal fertőzött urémiás betegnél. Továbbá azt találtuk, hogy a CYP27B1 aktivitása a monocitákban magasabb az aktív tuberkulózisban szenvedő betegeknél, mint azoknál, akik gyakran érintkeznek tuberkulózissal.
Etikai jóváhagyás
Ezt a vizsgálati projektet a Kaohsiung Orvosi Egyetem Kórházának Intézeti Felülvizsgálati Bizottsága hagyta jóvá. A jóváhagyási szám: KMUH-IRB-20130103.
Érdekütközés
A szerzők kijelentik, hogy nincs összeférhetetlenség a jelen tanulmány kapcsán.
A szerzők hozzájárulása
Yi-Ching Tung és Wen-Chan Tsai végezték a kísérleteket és írták a tanulmányt. Tsan-Teng Ou és Wen-Chan Tsai tervezték a vizsgálatot és gyűjtötték a mintákat. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges tanulmányt.