Abstract
A diszacharidázok (DS) a vékonybél enterociták mikrovilluláris membránjába ágyazott ecsethatár enzimek. Kezeletlen coeliakiában (CD) a DS-aktivitás általános csökkenése figyelhető meg. Ez a kézirat a DS-aktivitás különböző aspektusait tekinti át CD-ben: hasznosságukat a diagnózisban és alkalmazásukat az in vitro toxicitás vizsgálatában. Ez utóbbit a CD-kutatásban még soha nem alkalmazták. A vékonybél organoid technikák legújabb fejlődésével azonban a DS-t biomarkerként lehetne alkalmazni in vitro vizsgálatokban. Ez magában foglalja a szövetből kinyert önmegújító epitélsejtek létrehozását, amelyek differenciálódási markereket expresszálnak, beleértve a kefehatár enzimeket is. A duodenális DS-aktivitás meghatározása további információval szolgálhat a CD diagnosztikája során: (i) számszerűsítheti a megfigyelt szövettani elváltozások súlyosságát, (ii) prediktív értékeket adhat a nyálkahártya villus atrófia fokozatára vonatkozóan, és (iii) segítheti a CD diagnózisát, ha kisebb szövettani elváltozások észlelhetők. A DS további információval szolgálhat a gluténmentes diétára adott válasz értékeléséhez is, mivel aktivitásuk jelentős növekedése négy héttel a diéta megkezdése után következik be. A DS-t befolyásoló különböző endogén és exogén tényezők szintén relevánsak lehetnek, amikor a DS szerepének vizsgálatát fontolgatjuk más betegségekben, beleértve a nem coeliakiás gluténérzékenységet és a DS-hiányt.
1. Bevezetés
Egyéneknél a gyomor-bélrendszeri tünetek, beleértve a hasmenést is, a táplálékkal bevitt szénhidrátok bizonyos formáinak fogyasztásához kapcsolódnak. A tünetek a vékonybélnyálkahártya egy vagy több, a diszacharidokat hidrolizáló enzimhiányára vezethetők vissza . Ezek közé tartozik a laktázhiány (veleszületett és felnőttkori típus), a szukráz-izomaltázhiány, a maltáz-glükoamilázhiány és a trehalázhiány. A felnőttkori laktázhiány kivételével a fent felsorolt egyéb hiányosságok viszonylag ritkák . Egyéb, vékonybélkárosodást okozó állapotok, beleértve a coeliakiát (CD), a diszacharidáz (DS) aktivitás csökkenését okozhatják. Azt is feltételezték, hogy a másodlagos DS-hiány okozhatja a tüneteket azoknál a CD-s betegeknél, akiknek ép villijük van .
A laktóz, amelyet a laktáz enzim emészt meg, egyike a rosszul felszívódó rövid szénhidrátoknak, amelyeket gyakran FODMAP-nak (fermentálható, oligo-, di-, di-, monoszacharidok és poliolok) neveznek. Kimutatták, hogy a csökkentett FODMAP-bevitel javítja a gyomor-bélrendszeri tüneteket a nem coeliakiás gluténérzékenységben (NCGS) szenvedő betegeknél. Kimutatták, hogy a búzában lévő gluténen kívül más összetevők is fontosak lehetnek az NCGS-ben, nevezetesen az amiláz-tripszin inhibitor . Az erre az állapotra vonatkozó biomarkerek hiánya arra ösztönözheti a kutatókat, hogy vizsgálják meg az ecsethatár enzimek, például a laktáz lehetséges szerepét.
A kezeletlen CD-ben a DS-aktivitás általános csökkenése figyelhető meg . A szerológiai vizsgálatok megjelenése előtt a vékonybél DS-aktivitása fontos laboratóriumi paraméter volt a CD diagnózisának segítésében. Az egyéni DS-aktivitás meghatározása a veleszületett anyagcserezavarok differenciáldiagnosztikájában is kulcsfontosságú volt. Az aktivitás mérése segíti az elsődleges és másodlagos DS-hiányok megkülönböztetését . A DS-hiányok elsődleges típusai egy adott enzim “veleszületett anyagcsere-hibái” . Erre példa a veleszületett laktázhiány, amelyben a maltáz és a szukráz normális szintje mellett a laktáz szintje csökkent. A CD másodlagos DS-hiány, mivel a vékonybélnyálkahártya glutén okozta sérülése miatt minden DS csökkent .
A DS-aktivitás jelentős növekedése négy héttel a gluténmentes diéta (GFD) megkezdése után következik be, de aktivitásuk ismét csökken, ha a coeliakiás betegek visszatérnek a normál étrendhez . Kezelt CD-s betegeknél a glutén intraduodenális instillációja 3,5 órán belül jellegzetes szövettani változásokat és ezzel együtt a diszacharidáz aktivitás jelentős csökkenését eredményezi . A DS-aktivitás csökkenése korrelál a biopszia szövettani osztályával, így a DS a CD biomarkereként használható.
Ez a kézirat a DS-aktivitás különböző aspektusait tekinti át a CD-ben: hasznosságukat a diagnózisban és alkalmazásukat az in vitro toxicitás vizsgálatában. Továbbá ismertetjük a vékonybél organoid technikák legújabb fejlesztéseit, beleértve az immunsejtekkel való kokultúrát, amelyek izgalmas lehetőséget kínálnak a CD-kutatás korszerű in vitro modelljeinek kifejlesztésére. Ebben a modellben a kefehatár enzimeket a CD patogenezisének markereiként lehetne alkalmazni.
2. A vékonybél-diszacharidáz aktivitás diagnosztikai szempontjai CD-ben
A CD diagnózisának és a GFD hatásának követésének arany standardja a duodenális biopsziák vizsgálata a CD szerológiával együtt, beleértve a szöveti transzglutaminázt is. A DS-aktivitás mérése további információt nyújt a diagnózis felállításakor és a nyomon követés során a GFD-re adott válasz értékeléséhez . Továbbá kimutatták, hogy a DS-aktivitás meghatározása segítheti a CD diagnózisát, ha enyhébb szövettani elváltozások, beleértve a Marsh I és II rendellenességeket a vékonybél-biopsziákban .
2.1 . A nyálkahártya villosus atrófia pozitív és negatív prediktív értékei
A kefeszegély enzimaktivitás mérése további objektív eszközt kínál a szövettani eltérések súlyosságának értékelésére kezeletlen coeliakiás betegeknél . A duodenális DS-aktivitások jó előrejelzői a nyálkahártya villosus atrófia fokának CD-ben. A mérsékelt vagy súlyos villusatrófia pozitív prediktív értékei a következők:(i)90% a maltáz (maltáz U/g fehérje)(ii)86% a szukráz (<40 U/g fehérje)(iii)71% a laktáz (<20 U/g fehérje) esetében.
A csökkent maltáz és szukráz aktivitás tehát magas pozitív prediktív értékkel rendelkezik a nyálkahártya villusatrófia mértékét illetően. A laktázaktivitás prediktív értéke alacsonyabb, valószínűleg a coeliakiás betegek primer laktázhiányának jelenléte miatt. Egyetlen olyan beteg sem mutatott súlyos villusatrófiát, akinek DS-aktivitása a normál tartományban volt .
2.2. Nyálkahártya-gyógyulás CD-ben gluténmentes diétával (GFD)
Tudott, hogy a kefehártya határán lévő enzimek aktivitása csökkent a kezeletlen coeliakiás betegeknél. Az aktivitás azonban a remisszió során helyreáll, nevezetesen négy héttel a GFD megkezdése után . Fontos megjegyezni a DS és a GFD közötti eltérő reakciókat; az alfa-glükozidázok aktivitása jelentősen megnő, míg a laktázaktivitás sok betegnél alacsony marad . Peña és munkatársai kimutatták, hogy a laktáz válasza a GFD-re változó, néha néhány hónap alatt teljes gyógyulást mutat, de néha évekig nyomott marad . A beteg életkora nagy jelentőséggel bír a laktázaktivitás helyreállásának mértékében. A 30 évnél fiatalabb betegek általában néhány hónap alatt teljes gyógyulást mutatnak, míg az idősebb betegek többsége ennyi idő alatt alig vagy egyáltalán nem gyógyul . Az alacsony laktázaktivitás fennmaradását a jó szövettani javulás ellenére más vizsgálatokban kimutatták néhány betegnél, különösen felnőtteknél .
A laktáz kivételével a DS mérése a vékonybélnyálkahártya javulásának mennyiségi indexét adhatja ; növekedésük jól korrelál a vékonybél biopsziás szövettani vizsgálata alapján a nyálkahártya helyreállásával . A szövettani és szerológiai nyomon követés mellett a DS-aktivitás mérése további potenciális eszközt kínál a CD GFD-vel történő kezelésének értékelésére. A szukráz aktivitás a legjobb mutatója a GFD-re adott nyálkahártya-válasznak. Érdekes azonban megjegyezni, hogy még a CD kétéves GFD-kezelését követően sem emelkedik a szukráz aktivitás a distalis duodenumban a kontrollok szintjére, bár a klinikai hatások már korábban megfigyelhetők . Általában a remisszióban lévő CD-s betegek vékonybélnyálkahártyájának enzimaktivitása alacsonyabb, mint az életkor, a nem és a biopszia helye szerint illeszkedő kontrollcsoportoké . A GFD-t kapó cöliákiás betegeknél azonban a maltáz és a szukráz szintje szignifikánsan emelkedett, de a laktáz aktivitás korlátozottan nőtt a kezeletlen csoporthoz képest . Érdemes megemlíteni, hogy a szigorú GFD nem csak a CD, hanem a CD-hez társuló másodlagos DS-hiányos állapotok esetén is a választandó kezelés .
2.3 . A CD diagnózisa a vékonybélnyálkahártya-biopsziák Marsh I/II pontszámával (szubklinikai CD)
A vékonybélnyálkahártya-biopsziákban I és/vagy II Marsh pontszámmal nincs villusatrófia . A villusatrófia csak a betegség klinikai lefolyásának végstádiumát jelenti; a CD fokozatosan fejlődik a vékonybélnyálkahártya-gyulladástól a cryptahiperpláziáig és végül a villusatrófiáig .
A lymphocytás infiltrációra korlátozódó, cryptahiperpláziával vagy anélkül járó enyhébb biopsziás változások további adatokat igényelhetnek a CD diagnózisának bizonyossága érdekében, mivel ezek a szövettani változások nem kizárólag a CD-re jellemzőek . A CD diagnózisát megerősítheti a genotipizálás (HLA-DQ2 vagy HLA-DQ8); a szerológiai markerek és a CD-s betegeknél található γδ+ve intraepiteliális limfociták immunhisztokémiai festése szintén felhasználható a diagnózis megerősítésére .
A microvilli károsodása lehet az egyik legkorábbi glutén okozta elváltozás a CD-ben . Ezért a biokémiai változások megelőzhetik a duodenális biopsziában fénymikroszkópiával megfigyelhető szövettani eltéréseket . Murray és munkatársai arról számoltak be, hogy 37 betegből 4-nél (10,8%) ismételt biopszia alapján diagnosztizáltak CD-t, akiknél a néhány évvel korábbi kezdeti biopszia során nem volt villusatrófia. E négy betegnél azonban csökkent DS-aktivitás és kisebb szövettani elváltozások (Marsh I vagy II) voltak a kezdeti biopsziában. A csökkent DS-aktivitás villusatrófia nélkül tehát korai CD-t jelenthet .
Mones és munkatársai a DS-aktivitás jelentős csökkenését figyelték meg olyan CD-s gyermekbetegeknél, akiknek vékonybélbiopsziáján a szövettani elváltozások Marsh I. vagy II. értéket mutattak (intakt cimpákkal). A CD előrejelzésére szolgáló pozitív tesztet az egyéni DS-aktivitás következő határértékeivel határozták meg: laktáz, ≤15 egység/g fehérje; szukráz, ≤25 egység/g fehérje; maltáz, ≤100 egység/g fehérje; és palatináz, ≤5 egység/g fehérje. A diagnosztikai érzékenység 74% és 85% között mozgott, a legmagasabb érzékenységet a laktáz esetében figyelték meg. A diagnosztikus specificitás 57% és 91% között volt, a legmagasabb specificitás a szukráz esetében volt. A DS-hiány pozitív prediktív értéke a CD előrejelzésére 70% és 91% között volt. A negatív prediktív érték (normális DS-szint) 72% és 76% között volt a CD-nek nem tekinthető biopszia előrejelzésére. A duodenális biopsziákban talált DS-hiány tehát segítheti a CD diagnózisát az ép villivel rendelkező biopsziákban . Hasonló eredményről számoltak be egy másik vizsgálatban, ahol a DS-aktivitás értékelése bizonyítékot szolgáltatott a CD diagnózisának alátámasztására néhány betegnél .
3. A diszacharidáz-aktivitás kutatási szempontjai a coeliakiában
A vékonybélnyálkahártya-biopsziákban a DS-aktivitás a Dahlqvist-módszerrel határozható meg. A szövetet a megfelelő diszachariddal inkubáljuk, és a felszabaduló glükózt kolorimetriás vizsgálattal határozzuk meg TRIS-glükóz-oxidáz reagenssel. A DS-aktivitás mértékegységeit a nyálkahártya grammonként (nedves tömeg) percenként hidrolizált diszacharid mikromolban fejezik ki .
3.1. Az enzimaktivitást befolyásoló tényezők
Az aktív coeliakiában a DS csökkent. Csökkenhetnek más állapotokban is, beleértve a gyulladásos bélbetegséget, az ételallergiát, a diszpepsziát, a fehérje-energia felszívódási zavarokat, az immunhiányt és a fertőző betegségeket (például giardiasis, vírusfertőzések és vékonybél-baktériumok túlszaporodása) . A DS-aktivitás csökkenése általában visszafordítható az alapbetegség sikeres kezelésével. Érdekes módon a DS a cukorbetegeknél is kórosan megnövekedhet . Az egyes DS-aktivitások csökkenése az elsődleges DS-hiányoknál figyelhető meg, amelyek közé tartozik a veleszületett laktózintolerancia, a szukráz-izomaltáz-hiány, a maltáz-glükoamiláz-hiány és a trehaláz-hiány .
A DS-aktivitások egészséges egyéneknél az abszolút értékek széles skáláját mutathatják . Számos endogén és exogén tényező befolyásolja az aktivitásukat.
3.1.1. Endogén tényezők
A DS-aktivitások a bél hossztengelye (duodenum-jejunum-ileum) mentén változnak . A laktáz aktivitása a Treitz-szalagtól 50-200 cm-re maximális, a distalis ileumban szinte hiányzik. A szukráz aktivitás a vékonybél mentén állandó. A maltáz kétszer olyan gyakori a disztális ileumban, mint a proximális jejunumban .
Az etnikai hovatartozás befolyásolja a DS értékeket, amint azt a normális villusarchitektúrájú afrikai és finn gyermekek összehasonlításakor kimutatták; az előbbieknél alacsonyabb volt a duodenális laktáz, szukráz és maltáz aktivitása. A finn gyermekek körülbelül egyharmadának laktázaktivitása a megállapított 20 U/g fehérje referenciatartomány alatt van, szemben az afrikai gyermekek kétharmadával .
A nem befolyásolja egyik DS-aktivitást sem . Az életkornak csak a laktázaktivitásra van jelentős hatása; az életkorral csökken. Egyes fekete gyermekeknél a laktázhiány 3 éves kor után alakulhat ki, és nem jár nyálkahártya-betegséggel .
A cirkadián ritmus befolyásolja a DS-aktivitást . Ezenkívül a DS-aktivitások oszcillációja korrelál a táplálékfelvétel ritmusával .
A CD-ben előforduló foltos nyálkahártya-elváltozások befolyásolják a DS-aktivitások biopsziákban talált abszolút értékeit. Jonsson és munkatársai kimutatták, hogy a nyombél két helyéről vett minták DS-aktivitása körülbelül 30%-os variációs együtthatóval rendelkezik.
3.1.2. Exogén tényezők
A szacharóztáplálásról ismert, hogy növeli a szacharáz-izomaltáz aktivitását. A növekedés az enzim de novo szintézisének eredménye, amely 12 órával a szacharóztartalmú étrend megkezdése után éri el csúcspontját (2,6-szoros növekedés) . Az enzim lebomlása független az étrendtől .
A böjt akadályozza a bélhámsejtek megújulását. A vékonybél tömegének, a villusméretnek és a kripták enterocita mitotikus indexének csökkenését okozza. A szénhidrátmegvonás a bélszukráz csökkenését idézi elő, ami szénhidráttáplálással helyreáll .
A DS szintje a biopszia helyétől függően is változik . Ez nemcsak a vékonybél hosszanti tengelyére (duodenum-jejunum-ileum), hanem a crypt-villás tengelyre is vonatkozik. Mivel a DS a villusos enterociták mikrovilláiba ágyazódik, aktivitásuk a biopsziában jelen lévő villusos enterociták számától függ, így a nagyobb hámtartalmú, felületesebb biopsziákban magasabb lehet a DS-tartalom.
3.2. Ex vivo és in vitro módszerek a gluténtoxicitás vizsgálatára a coeliakiában
Nincs olyan állatmodell, amely a coeliakia minden jellemzőjét reprodukálná . Az in vivo vizsgálat az arany standard a coeliakiás toxicitás értékelésére . Jól ismert azonban, hogy a glutén in vivo beadása szisztémás károsodást okozhat a betegben. Ezért általában in vitro módszereket alkalmaznak, mielőtt in vivo vizsgálatokat végeznének az élelmiszerek CD-toxicitás hiányának vizsgálatakor .
A legmegbízhatóbb in vitro módszer a vékonybél nyálkahártya biopsziás tenyésztése, amelyet gyakran duodenális biopsziás szervkultúrának (OC) neveznek. A módszert eredetileg Browning és Trier írta le . Jelentős igény van a preklinikai in vitro vizsgálatokra, ezért Browning és Trier módszerének elvét továbbfejlesztették és alkalmazták a probiotikumok vizsgálatára, amely a bélnyálkahártya-explantátumok apikális stimulációját igényli . Az OC számos egyéb alkalmazást tesz lehetővé, például a DS szintézisének és feldolgozásának biokémiai vizsgálatát , a DS dimerikus összeszerelését és az inzulin hatásának tanulmányozását a DS emelkedett aktivitására cukorbetegeknél .
Browning és Trier eredeti módszerét úgy módosították, hogy a rendszer a glutén káros hatásait a táptalajhoz adva és az azt követő szövettani, morfológiai és immunológiai rendellenességek értékelésével detektálja. A módosított Browning és Trier technikát még mindig széles körben használják a CD patogenezisét vizsgáló vizsgálatokban és a coeliakiás toxicitás tesztelésében . Az OC-rendszer szintén hasznosnak bizonyult a CD diagnózisának segítésében, főként a villus atrófia nélküli esetekben vagy szeronegatív betegeknél .
3.2.1 . A vékonybél szervkultúrával és az ecsetparti enzimek vizsgálatával kapcsolatos korai munkák a CD-ben
A coeliakiás betegség jellemzője az enterociták károsodása . A glutén vékonybélnyálkahártyára gyakorolt toxikus hatását biokémiai úton, az alkalikus foszfatáz (AP) ecsethatár enzim aktivitásának mérésével mutatták ki OC-ban. A kezeletlen CD-betegek biopsziáiból nyert AP aktivitása megnőtt, amikor a szövetet gluténmentes közegben inkubálták. Ezt a növekedést gátolta a glutén peptidek jelenléte a táptalajban, ami a glutén toxikus hatását bizonyítja.
Katz és Falchuk ezt követően javasolta a vékonybél OC technika használatát, mint prediktív tesztet a gluténérzékenység végleges diagnózisához. A 26 CD-vel diagnosztizált beteg közül huszonkettőnél a kezdeti biopsziák in vitro gluténérzékenységet mutattak. Az e 22 betegből származó bélszövet AP-aktivitásának emelkedését gátolta a gluténpeptidek jelenléte a közegben. A CD diagnózis felállításának hamis-negatív aránya ezért 15% volt (26-ból 4). Vizsgálatukban 14 olyan beteg is volt, akinek a nyálkahártyája kóros volt, de nem bizonyult CD-snek. Közülük tizenhárom nem mutatott gluténérzékenységet in vitro (7%-os hamis pozitív arány). A normális biopsziával rendelkező betegek mindegyikét helyesen sorolták be. Ezek az izgalmas eredmények azt sugallták, hogy a vékonybél szervkultúrát fel lehet használni a CD prospektív diagnózisára. Egy másik vizsgálatban Falchuk és munkatársai ismét kimutatták a gluténérzékenységet in vitro aktív CD-ben szenvedő betegeknél. Továbbá azt sugallták, hogy különbségek vannak az alanyok hisztokompatibilitási típusa szerint.
Más kutatók hasonló OC-vizsgálatokat végeztek, mérve az AP-aktivitást és egy másik ecsethatár enzimet, az α-glükozidázt. Howdle és munkatársai, valamint Hauri és munkatársai nem tudták reprodukálni a glutén in vitro hatását a kezeletlen CD-betegek duodenális biopsziáin, sem az AP, sem az α-glükozidáz aktivitás mérésével.
Mitchell és munkatársai kimutatták, hogy az OC során a szövetekből fokozatosan távoznak a fehérjék. Ezzel egyidejűleg a brush border enzimek szintje csökken és felhalmozódik a közegben. Ezért azt javasolták, hogy az enzimaktivitásokat mU/ml táptalajban fejezzék ki, szemben az U/g fehérjével, a szervkultúra során bekövetkező fehérjeveszteségek és a táptalajban visszanyert enzimaktivitások miatt .
Más szerzők a vékonybél biopsziás OC-ban vizsgálták a fehérjéket, a DNS-tartalmat és a kefehártya-enzimeket. A legtöbbjük mindezen paraméterek csökkenését figyelte meg a tenyésztett biopsziákban, kivéve az AP aktivitást, amely gyakorlatilag minden esetben növekedett . A DS valószínűleg könnyebben távozik a táptalajba a tenyésztés során, mint az AP .
3.2.2. Sejtmodellek és enzimaktivitások
A CD beteg vékonybélnyálkahártya OC mellett a kutatók különböző sejtvonalakat használtak a CD in vitro vizsgálatára. A bevált sejtmodellek a gluténérzékeny T-sejtvonalakon és a CD-ben szenvedő egyénekből izolált klónokon alapulnak, amelyeket még mindig széles körben használnak a CD toxicitásának szűrésére . Jelentős mennyiségű kutatást végeztek rákos eredetű epitélsejtvonalakkal is, amelyek viszonylag könnyen tenyészthetők. Nem állapították meg azonban, hogy a rosszindulatú átalakulás milyen mértékben befolyásolja a környező mikrokörnyezeti hatásoktól való esetleges függőségüket. Kimutatták, hogy a normál hámsejtekkel ellentétben a vastagbélrákos sejtvonalak nem igényelnek növekedési faktorok hozzáadását in vitro terjeszkedésükhöz . Ezenkívül a Caco2 sejtek a normál enterocitákhoz képest lényegesen kisebb mennyiségben expresszálják a kefehatár enzimeket .
Mielőtt Sato és munkatársai közzétették a bélorganoidokkal kapcsolatos áttörő felfedezésüket, az enterocitákat köztudottan nehéz volt in vitro termeszteni. Az évtizedek során a normál bélhámmal kapcsolatos számos tanulmány számolt be arról, hogy nehézségekbe ütközött e sejtek néhány napnál hosszabb ideig történő tenyésztése ( és az ott található hivatkozások), annak ellenére, hogy különböző izolálási protokollokat és későbbi tenyésztési körülményeket alkalmaztak. Sokáig úgy gondolták, hogy primer emberi szövetekből nem lehet hosszú távú tenyészeteket létrehozni, hacsak a sejteket genetikailag nem transzformálják. Azt is felfedezték, hogy a normál hámsejtek és a környező extracelluláris mátrix közötti kölcsönhatások megszakítása a sejtek apoptózisát idézi elő .
Quaroni és munkatársainak azonban sikerült patkány vékonybélhámsejtek hosszú távú tenyésztését létrehozniuk. Az izoláláshoz használt kezdeti megközelítésük az OC-ban alkalmazott megközelítés volt, de a tenyésztett epitélsejtek a differenciálatlan vékonybél kriptasejtek jellemzőit mutatták. A tenyésztett enterociták in vitro gyenge differenciálódási szintjéről számoltak be más, humán, egér, patkány és szarvasmarha bélbiopsziákon végzett vizsgálatokban, amelyek összhangban vannak a mi megfigyeléseinkkel (nem publikált adatok). Rusu és munkatársai a differenciálódást in vitro vizsgálták a maltáz és az AP specifikus aktivitásának értékelésével szarvasmarha mintákban, a) frissen lekapart hámsejtekben, b) organoid szuszpenziókban, amelyeket a kultúrák beültetésére használtak (nem tévesztendő össze a Sato-féle organoidokkal), és c) bélsejtkultúrákban, amelyek elsődlegesen tenyésztett sejteket és az első és második passzázs után tenyésztett sejteket tartalmaznak. Az organoid szuszpenziók 50%-os csökkenést mutattak a friss hámkészítményhez képest. A differenciálódási markerként használt maltáz aktivitás egyértelműen csökkent az elsődleges kultúrákban és a későbbi tenyésztési passzázsok során egy stabilan alacsony szint felé. Hasonló eredményeket kaptunk a bél AP-aktivitásának méréséből is. Ezek az eredmények a sejtek in vitro differenciálódásának elvesztését tükrözték.
A hám csak egy (i) a négy komponens közül egy integrált funkcionális egységben, amely szintén (ii) extracelluláris mátrixból, (iii) mesenchimából származó sejtekből és (iv) luminális faktorokból áll. Az enterociták elszigetelése a mesenchymális környezetüktől a differenciálódás elvesztését eredményezi . A műanyagon tenyésztett, nem transzformált humán magzati vékonybélsejtek a differenciálatlan kriptás enterociták jellemzőit mutatják . Kötőszöveti és luminális molekulák szekvenciális hozzáadása nem malignus humán magzati enterocitákhoz in vitro a teljes differenciálódás felé mutató változások spektrumát idézte elő a hámsejttípusban . Egy patkány vékonybél sejtvonal is differenciálódott, amit a szukráz aktivitás jelentős növekedésével értékeltek, amikor mesenchyme jelenlétében tenyésztették . A vékonybélhám normális fejlődése és differenciálódása tehát a mesenchymával és más alkotóelemekkel való kölcsönhatástól függ .
A vékonybélből izolált normális primer humán epithelsejtek hosszú távú tenyésztése mára jól bevált. Humán epiteliális “minibél” bélkriptákból és egyes őssejtekből tenyészthető . Lehetőség van az egér és az emberi bélből származó organoid kultúrák in vitro szaporítására . Ezek az organoidok korlátlan ideig tenyészthetők, és a vékonybélhám minden jellegzetességét mutatják az architektúra, a sejttípusok és az önmegújulás jellemzői tekintetében .
Sato és munkatársai meghatározták azokat a feltételeket, amelyek elősegítik az organoidok proliferációját és differenciálódását. Az őssejteket, valamint az organoidokat Matrigelbe kellett beágyazni, amely egy laminin- és kollagénben gazdag mátrix, amely a bazális lamellát utánozza. Az emberi vékonybélkultúra összetettebb, mint az egérbélé. Az R-spondin, a Noggin és az epidermális növekedési faktor mellett a humánra optimalizált tenyésztési körülmények több kiegészítőt igényelnek (Wnt3A, gasztrin, nikotinamid, Alk-inhibitor és p38-inhibitor). A tenyésztett humán vékonyhám organoidok differenciálódása a bél különböző sejttípusaiba bizonyos kiegészítők kivonását igényli (Wnt3, nikotinamid és p38-inhibitor). Az érett enterociták differenciálódási markerét ecsethatár AP festéssel vizualizáltuk . Egy másik tanulmányban Middendorp és munkatársai szintén kihagytak bizonyos tenyésztési kiegészítőket a humán organoidok vékonybél-differenciálódásának eléréséhez. Érdekes módon azonban az érett enterociták szukráz-izomaltáz festéssel történő vizualizálása jól működött az ileális organoidok esetében, de a nyombél esetében nem. A laktáz expresszióját mind az ileális, mind a duodenális organoidokban indukálta az ún. differenciáló közeg.
3.2.3. A bélorganoid módszerek legújabb fejleményei
Az organoid technológia a bélhám ex vivo expanziójával és transzplantációjával alkalmazható lehet egyes bélbetegségek regeneratív terápiájában . Ez a módszer lehetővé teszi a beteg emésztőrendszeri szövetek in vitro szaporítását is, ami felvilágosíthatja a betegség patogenezisét és a terápiák fejlesztését . A bélorganoidokat már használták a hámot érintő monogén betegségek, a gyulladásos bélbetegségek (a sejthalál, a nyálkahártya integritásának és a gyulladásos citokinek hatásainak vizsgálata), valamint a bélszövetek és a mikrobák közötti kölcsönhatások és a rák modellezésére ( és az ezekre vonatkozó hivatkozások). A CD-kutatás elmarad ezektől az előrelépésektől. Jól ismert, hogy a CD patogenezisében számos sejttípus vesz részt, és mint ilyen, az organoidokból sok olyan sejttípus hiányzik, amely az in vivo rendszerben jelen van. A komplexitás azonban növelhető az immunsejtekkel való kokultúrával. Nozaki és munkatársai leírták egérorganoidok és intraepiteliális limfociták (IEL) kokultúráját, amelyben mind az αβT, mind a γδT sejtek sikeresen proliferáltak és ugyanolyan mozgékonyak voltak, mint az in vivo környezetben élő IEL-ek. Az organoidok kokultúráit leírták az enterális idegrendszer és a myofibroblasztok esetében is .
A cöliákia diagnosztikájában a szerológiai és genetikai vizsgálatok fejlődésének köszönhetően a duodenális biopszia sok beteg esetében már nem szükséges. Ennélfogva a biopsziás anyag ritkulni fog. Ugyanakkor embrionális őssejtekből vagy indukált pluripotens őssejtekből ( és az ezekre vonatkozó hivatkozások) bélorganoidok is létrehozhatók, amelyek létrehozása ugyan hosszabb időt vesz igénybe, és technikailag igényesebb és költségesebb, mint a biopsziából származó organoidoké, de jelentősen növelhetik a keletkező organoidok számát, és lehetővé teszik, hogy a klinikai anyagot inkább az immunsejtek felnevelésére használják fel.
3.2.4. A bélorganoidok előállítása a biopsziából származó organoidoknál hosszabb időt vesz igénybe, és technikailag költségesebb és költségesebb. Az intestinális organoid munka és a kefe-határ enzimek jelentősége a CD-kutatás korszerű in vitro módszereinek fejlesztése szempontjából
Az jól ismert, hogy a CD patogenezisében veleszületett és adaptív immunválaszokat váltanak ki ; azonban ezeknek a patológiai eseményeknek a pontos sorrendjét a mai napig nem sikerült tisztázni. Az organoid technológia azonban lehetővé teszi a sejtek szekvenciális hozzáadását a kokultúrába, ezáltal lehetővé teszi a veleszületett immunválasz tanulmányozását a coeliac organoidok és az IEL-ek rekonstruálásával az adaptív immunválasz hatásaitól elkülönítve. Ezután viszont a szintén in vitro tenyészthető gluténspecifikus T-sejteket is be lehet vonni a CD ezen in vitro modelljébe, hogy elősegítsük a gluténnek a bélhámra gyakorolt teljes toxikus hatását.
Az organoid technológia lehetővé teszi az enterociták szerepének tisztázását is a gliadin peptidek feldolgozásában a CD-ben. Az enterociták képesek antigénprezentáló sejtekként működni, ahol a T-sejtek stimulációját HLA-DR molekuláik közvetítik . Továbbá a gliadin olyan peptideket tartalmaz, amelyek veleszületett immunválaszt válthatnak ki . Érdekes módon a coeliakiában a veleszületett immunitást kiváltó glutén peptidek másképp kerülnek feldolgozásra az enterocitában, mint az adaptív immunválaszt kiváltó peptidek, amelyekben a peptidek eljutnak a HLA-DR pozitív késői endoszómákba, és a lamina propria T-sejtek elé kerülnek . Mivel az enterociták ecsethatárának károsodása az egyik legkorábbi elváltozás a CD-ben, a DS felhasználható a glutén toxikus hatásainak tanulmányozására a CD-ben. Fontos megjegyezni, hogy a kefehatár enzimek az érett villus enterociták szerves részét képezik, és mennyiségileg kapcsolódnak a differenciálódásukhoz . A DS-aktivitás azonban nem feltétlenül korrelál az enterociták életképességével, mivel a kefehatár-enzimek aktivitását nem életképes epithelsejtekben is kimutatták . Ezért az immunfestés, pontosabban a kefehatár-enzimek immunfestésének hiánya a mikrovillák pusztulása, nem pedig aktivitásuk miatt, a CD patogenezisének markereként használható.
Az organoid technológia jelentős potenciállal rendelkezik a betegség modellezésében, és így a CD-ben a patogén események szekvenciájának felderítésében, amelyben a kefehatár-enzimek felhasználhatók. Az őssejtkutatás legújabb eredményein alapuló új in vitro modellek megkönnyíthetik a CD új terápiás stratégiáinak kifejlesztését.
4. Következtetések
A vékonybélnyálkahártya szerkezete és a benne zajló élettani folyamatok nagyon összetettek. A CD növeli ezt a komplexitást, mivel a bél számos komponensét érinti, beleértve a DS-t is. Annak ellenére, hogy a DS-tevékenységek korábban fontos szerepet játszottak a CD diagnózisának segítésében, a DS-tevékenységek alkalmazása a CD in vitro kutatásában még mindig várat magára. A hámsejtek ex vivo növekedése terén a közelmúltban elért eredmények egy izgalmas új platformot jelentenek, amely elérhetővé vált. Ez lehetővé teszi a normális vagy beteg epithelium szövettechnológiával történő vizsgálatának alkalmazását. A hámsejtek meghatározott körülmények között növekednek és differenciálódnak, amelyek magukban foglalják az extracelluláris mátrix és a növekedési faktorok jelenlétét. A hámsejtek önmegújító populációja kefehatár-enzimeket expresszál, amelyeket a CD in vitro vizsgálataiban lehet alkalmazni, ha a modellbe más immunsejteket is rekonstituálnak.
Érdekütközések
A szerzők kijelentik, hogy nincsenek érdekellentétek.
A köszönetnyilvánítás
A szerzők köszönetet mondanak Dr. H. Julia Ellisnek a hasznos beszélgetésekért és a kézirat átnézéséért. Tanja Šuligoj köszönetet mond a Clinical Research Trustnak a támogatásért. Borut Božič szeretné megköszönni a Szlovén Tudományos Alapítvány részleges pénzügyi támogatását, Grant no. SZF-BBozic01/2007.