A PHMB bakteriális sejtmembrán aktivitása
Ha a PHMB antibakteriális aktivitása (ábra. 1a) a membránok megbontásának köszönhető, amint arról széles körben beszámoltak6,7,8,9,10 , akkor várhatóan permeabilizálja a bakteriális sejtfalakat növekedésgátló és növekedésgátló alatti koncentrációkban. E modell tesztelése érdekében először is meghatároztuk a PHMB minimális gátló koncentrációit (MIC) és időbeli pusztító tulajdonságait Escherichia coli (K-12 és MG1655 törzsek) és Salmonella enterica serovar Typhimurium (LT2 törzs) ellen. Amint arról korábban beszámoltunk2,4 , a PHMB erős növekedést gátló és ölő tulajdonságokat mutatott (2. kiegészítő táblázat és 1. kiegészítő ábra). A kezelést követően a sejteket fénymikroszkópiával is megvizsgáltuk. Váratlanul a PHMB növekedést gátló koncentrációi nem lizálták a sejteket, amint azt fénymikroszkópiával megfigyeltük. A mikroszkópia számára láthatatlan sejtbarrier-károsodás értékeléséhez E. coli K-12 kultúrákat növesztettünk a log-fázis közepéig, majd PHMB-vel kezeltük a SYTOX®Green fluoreszcens membránintegritás-szonda jelenlétében, majd fluorimetriával monitoroztuk. Ez a szonda hasznos a membrán károsodásának indikátoraként, mivel az intakt baktériumokból általában kizáródik, és fluoreszcencia-kvantumhozama a DNS-kötés hatására megnő. Ezért az intakt baktériumok várhatóan alacsony fluoreszcenciát mutatnak, és a fluoreszcencia várhatóan megnő a sejtgát károsodását követően16. A várakozásoknak megfelelően a frissen tenyésztett E. coli kultúrák fluoreszcenciája nagymértékben megnőtt az ismert sejtfalbontó polymyxin B-vel vagy hőkezeléssel történő kezelést követően (1b. ábra). Váratlanul a PHMB-kezelés viszonylag alacsonyabb fluoreszcencia-szintet eredményezett. A legszembetűnőbb, hogy a PHMB magasabb koncentrációi háttérszintű fluoreszcenciát eredményeztek. Ezek a megfigyelések nem összeegyeztethetők a membránbontással mint fő antibakteriális mechanizmussal, és ezért további kétségeket ébresztettek a felállított modellel kapcsolatban.
PHMB hatása a sejtmembrán permeabilitására és a baktériumokba való bejutásra.
(a) A polihexametilén biguanid (PHMB; CAS# 27083-27-8) szerkezete; alternatív kémiai nevek: polihexanid; kereskedelmi példák: Vantocil™, Cosmocil™, Baquacil™, Prontosan®. További részletekért lásd az 1. kiegészítő táblázatot. A PHMB ismétlődő bázikus biguanidin egységekből áll, amelyeket hexametilén szénhidrogénláncok kötnek össze, kationos és amfipatikus szerkezetet biztosítva, nagy hidrogénkötési, elektrosztatikus és hidrofób kölcsönhatásokkal. A PHMB-készítmények jellemzően vegyes hosszúságú polimereket tartalmaznak amin-, guanidin- és cianoguanidin végcsoportokkal (pl. átlagos n = 13,8, 3,035 g/mol44) b) A PHMB, hő, polymyxin B (pozitív kontroll) és triklozán (negatív kontroll) hatása a sejtek SYTOX®Green iránti permeabilitására. A vizsgált antibakteriális szerek MIC-értékeit színkódolt függőleges nyilak jelzik, felül. (c) Fluoreszcens mikroszkópia a PHMB-FITC különböző baktériumokba való bejutásáról. PHMB-FITC-t (2 μg/ml) adtunk baktériumtenyészetekhez, majd a sejteket DAPI-val ellenfestettük. (d) A PHMB-FITC (zöld) lokalizációját bemutató konfokális kép a B. megateriumban; a baktériumokat ellenfestettük a membránlokalizáló, Alexa Fluor-555-össel konjugált búzacsíra agglutinin (WGA) szondával (piros), és élő (fent) és rögzített (lent) sejtekként ábrázoltuk; sáv = 5 μm. (e) A PHMB-FITC és a WGA fluoreszcencia sejtlokalizációjának fluoreszcencia-intenzitásprofil-elemzése (a fehér vonal jelezte az elemzéshez használt keresztmetszetet). A zöld vonal jelzi a FITC szintjét és helyzetét (főként a sejten belül). A piros vonal a WGA szintjét és helyzetét (főként a membránon belül) jelzi.
A PHMB belép a baktériumokba
Ha a PHMB elsődleges célpontja nem a bakteriális sejtakadályok, vagy nem kizárólag a sejtakadályok, akkor valószínűleg belsőleg hat, és ehhez a sejtbe való belépésre lenne szükség. A bakteriális behatolás vizsgálatához PHMB-FITC konjugátumot szintetizáltunk (2a,b kiegészítő ábra), és mikroszkópiával és áramlási citometriával felmértük a Gram-pozitív (Staphylococcus aureus), Gram-negatív (Escherichia coli és Salmonella enterica serovar Typhimurium) és saválló (Mycobacterium smegmatis) baktériumokba való bejutást (1c ábra, 3. kiegészítő ábra). Erős sejt-asszociált zöld fluoreszcencia volt megfigyelhető minden vizsgált fajnál (1c. ábra). A sejtlokalizáció alaposabb vizsgálatához a nagyméretű Bacillus megaterium baktériumot PHMB-FITC-vel kezeltük, membránlokalizáló búzacsíra-agglutininnel (WGA-red) ellenfestettük és fluoreszcens mikroszkópiával vizsgáltuk (1d. ábra). A sejtbe jutást mind az élő, mind a rögzített sejtekben megfigyeltük, és a fluoreszcencia intenzitásprofil elemzése azt mutatja, hogy a PHMB-FITC a citoplazmán belül lokalizálódott, a sejthatáron való felhalmozódás nélkül (1e. ábra).
A megfigyelés, hogy a PHMB már alacsony mikrogramm/ml koncentrációban is bejut a sejtekbe, arra utal, hogy az élő sejtekbe is bejuthat. Annak vizsgálatára, hogy a PHMB baktériumokba történő felvételéhez szükség van-e energiaanyagcserére, a közepes log-fázisú E. coli kultúrákat 37 °C-on, illetve 2 órán át 4 °C-on inkubáltuk a sejtek ATP-szintjének csökkentése érdekében. Ezt követően a sejteket PHMB-FITC-vel (0-6 μg/ml) kezeltük, majd 2 órán át jégen inkubáltuk. A sejt-asszociált PHMB-FITC fluoreszcenciát fluorimetriával számszerűsítettük (3b. kiegészítő ábra). A 4 °C-on tartott sejtek a 37 °C-on inkubált sejtekhez képest csökkent PHMB-FITC-felvételt mutattak, ami egy energiafüggő sejtfelvételi folyamatnak felel meg. A PHMB-kezelés során több időpontban is megfigyeltünk zöld fluoreszcens és mozgékony baktériumokat (3. kiegészítő ábra). Mivel a baktériumok motilitása energiafüggő17 , a bizonyítékok arra utalnak, hogy a PHMB-FITC metabolikusan aktív sejtekbe jut. Ezért a PHMB különféle baktériumokba jut be, és a bejutást a mozgékony sejtekben figyeltük meg.
A PHMB megállítja a sejtosztódást és kondenzálja a bakteriális kromoszómákat
Az E. coli mikroszkópos vizsgálatakor megfigyeltük, hogy a PHMB-vel kezelt sejtek gyakran megnyúlt morfológiát mutattak, ami a sejtosztódás gátlására lehet jellemző (2a. ábra). A PHMB sejtnyúlásra gyakorolt hatásának méréséhez PHMB-t titráltunk az SS996 E. coli törzs növekvő kultúráiba (vide infra), és megmértük a sejtek hosszát. Növekedést gátló koncentrációban a sejtek több mint 80%-a megnyúlt (2b. ábra; 2. kiegészítő táblázat). Azt is megfigyeltük, hogy a PHMB vagy PHMB-FITC növekedést gátló koncentrációjával kezelt E. coli sejtek DAPI-festést követően kék fluoreszcens fókuszokat mutattak a sejtközpont közelében (2c. ábra). Ezek a struktúrák a nukleoidokhoz hasonlítottak18. A DNS-fókuszok vizualizálásának megkönnyítése érdekében filamentumos/multinukleáris E. coli-populációkat hoztunk létre a sejtosztódás gátlásával, az esszenciális sejtosztódási gén, az ftsZ19 RNS csendesítésével. Az RNS-csendesítést azért választottuk ehhez a kísérlethez, mert lehetővé teszi az esszenciális géntranszkriptek transzlációjának specifikus és szabályozható elnyomását20. A növekedés szempontjából esszenciális gének nem kapcsolhatók ki genombontási módszerekkel, mivel ez nem életképes törzseket eredményezne. PHMB hiányában a fonalas sejtek egyenletes DAPI-festést mutattak, míg a PHMB-vel kezelt sejtek kék “gyöngysorokat” (2d. ábra). Hasonlóképpen, a nagyméretű Gram-pozitív B. megaterium baktériumban PHMB-kezelést követően DAPI-festett fókuszokat figyeltünk meg (2e. ábra). Ezek az eredmények mind a Gram-negatív, mind a Gram-pozitív fajokban azt mutatják, hogy a PHMB-expozíció a baktériumokon belül kondenzált kromoszómákhoz vezet.
PHMB által közvetített sejtnyúlás és kromoszóma-kondenzáció baktériumokban.
(a) E. coli-t 90 percig kezeltük PHMB-vel és fényes térmikroszkópiával vizsgáltuk. (b) Az átlagos sejthossz a PHMB koncentráció függvényében. A MIC (nyíl) van feltüntetve. (c) A sejtek kromoszómaeloszlásának mintázata PHMB-FITC kezelést követően. E. coli, K-12 törzs kultúráit PHMB-FITC-vel kezeltük, DAPI-val ellenfestettük és fluoreszcens mikroszkópiával vizsgáltuk. A kromoszómák kondenzált DAPI-festett fókuszokként jelennek meg; a nagyított képen jobban láthatóak. (d) A kromoszómák eloszlásának mintázata filamentumos/multinukleáris E. coli-ban PHMB-expozíciót követően. Az ftsZ expresszió RNS csendesítését használtuk a sejtosztódás leállítására, majd a sejteket kezeletlenül vagy PHMB-vel kezeltük, DAPI-val festettük és fluoreszcens mikroszkópiával vizsgáltuk. (e) A kromoszómák eloszlásának mintázata B. megaterium sejtekben, amelyeket kezeletlenül vagy PHMB-vel kezeltek, DAPI-val és WGA-vörössel festettek és fluoreszcens mikroszkópiával vizsgáltak.
A PHMB által közvetített antibakteriális hatások függetlenek a stresszválasz útvonalaktól
A sejtek megnyúlása és a kromoszómák kondenzációja olyan jellegzetes morfológiák, amelyeket gyakran társítanak a bakteriális SOS-válaszhoz21,22. Ezért úgy gondoltuk, hogy ezek a hatások ezt a választ is magukban foglalhatják. A PHMB által közvetített hatások esetében azonban az SOS-válasz valószínűtlennek tűnt. Először is, az SOS-válasz jellemzően DNS-károsodással jár, és nincs bizonyíték a PHMB által közvetített genotoxikus vagy epigenetikai hatásokra23. Másodszor, az ftsZ csendesítését és a PHMB-kezelést követően megfigyelt kondenzáció egy recA-törzsben (TOP10) következett be, amely egy SOS-válaszmutáns. Mindazonáltal az antimikrobiális mechanizmusokat köztudottan nehéz megfejteni, és több mechanizmus is szerepet játszhat bennük. Ezért úgy döntöttünk, hogy egy SOS-reporter törzs és egy E. coli stresszválaszútvonal-mutánsok panelje segítségével felmérjük az SOS-válasz és más stresszválaszútvonalak lehetséges részvételét.
Hogy megvizsgáljuk, hogy a PHMB által közvetített sejtnyúlásra és kromoszóma-kondenzációra gyakorolt hatásokat megváltoztatják-e az SOS-válaszútvonal mutációi, három mutáns E. coli törzsben morfológiai válaszokat értékeltünk. Az SS996 törzs képes SOS-választ indítani, de a sulB mutáció miatt a válasz nem vezet sejtosztódásgátláshoz. Ennek oka, hogy az SS996 az ftsZ egy mutáns alléljával (sulB103) rendelkezik, amelynek terméke érzéketlen az SOS által indukált SulA24 sejtosztódásgátló hatására. A JW2669 törzs nem termel funkcionális RecA-t, és így SOS-hiányos. Az AB2474 törzs mutációval rendelkezik a LexA represszorban, ami miatt azt a RecA nem tudja megtörni, és így nem képes SOS-választ indukálni (a törzs további részleteit a 3. ábra és a kiegészítő információk 3. táblázata tartalmazza). A log fázis közepén lévő kultúrákat PHMB-vel kezeltük, DAPI-val festettük és fluoreszcens mikroszkóp alatt figyeltük meg. Ahogy az E. coli K-12-nél megfigyeltük, a mutáns törzsek PHMB-kezelést követően megnyúlt morfológiát és kondenzált kromoszómákat mutattak (3a. ábra). Ezért a PHMB által közvetített sejtosztódási és kromoszómaszerkezeti hatások az SOS programozott választól függetlenül jelentkeznek.
A PHMB hatása a baktériumok SOS-válaszaira.
(a) Kromoszóma-kondenzáció az SS996 (sulB103; SulA-ra érzéketlen FtsZ mutáns), JW2669 (recA-; recA knock-out) és AB2474 (lexA1, SOS-válasz indukcióját megakadályozó mutáció) E. coli törzsekben 2 órás PHMB kezelés után. A sejteket DAPI-vel festettük a DNS kimutatására. (b) SOS-válasz riporter-expresszió, fluorimetriával számszerűsítve. A kromoszómális sulAp-gfp fúziót hordozó SS996 SOS riporter E. coli törzset kezeletlenül vagy PHMB-vel, mitomicin C-vel, egy ismert SOS induktorral, vagy triklozánnal kezelték, amely nem indukál SOS választ. Az SS996 elleni MIC-értékek a következők voltak: PHMB, 0,75 μg/ml; triklozán, 2 μg/ml; mitomicin C, 0,06 μg/ml, és ezeket az értékeket használtuk a %MIC kiszámításához.
Annak közvetlenebb mérésére, hogy a PHMB indukál-e SOS választ, az SS996 E. coli törzset használtuk, amely egy olyan riporter törzs, amely sulAp-gfp kromoszómális SOS válasz/reporter rendszert tartalmaz24,25. Ha a PHMB SOS-választ okoz, akkor a PHMB-expozíciónak ebben a törzsben GFP-expressziót kell indukálnia. Az SS996 kultúrákat 18 órán keresztül kezelték PHMB-vel, majd megmérték a zöld fluoreszcenciát. Pozitív kontrollként a DNS-t károsító mitomicin C-t, negatív kontrollként pedig a zsírsav-bioszintézist gátló triklozánt használtuk. A várakozásoknak megfelelően a mitomicin C a GFP-expresszió nagymértékű növekedését idézte elő, a triklozán pedig nem indukálta a GFP-expressziót. A mitomicin C-vel ellentétben a PHMB nem indukálta a GFP-expressziót, ami azt jelzi, hogy a PHMB nem indukál SOS-választ (3b. ábra).
A következőkben azt vizsgáltuk, hogy a hibás vagy deregulált SOS-válaszokkal rendelkező törzsek különböznek-e a PHMB iránti érzékenységben. A recA-mediált hatások érzékenységre gyakorolt hatásának vizsgálatához egy olyan E. coli törzset használtunk, amelyből hiányzik a recA (JW2669), valamint egy olyan törzset, amely az induktor IPTG hozzáadására túlreprezentálja a recA-t (ASKA JW2669), és meghatároztuk a MIC-értékeket. Sem a recA deléciója, sem indukált túlterjedése nem változtatta meg a PHMB iránti érzékenységet (Kiegészítő információk 3. táblázat, sötétszürkével árnyékolt sorok). Ezzel szemben a recA-törzs 2-szer érzékenyebb volt az SOS-választ indukáló nalidixinsavra, a recA-túlrepresszió pedig 8-szor csökkentette a nalidixinsavval szembeni érzékenységet. A lexA-mediált PHMB-érzékenységre gyakorolt hatások vizsgálatához az AB2474 lexA1(Ind-) törzset használtuk, amely nem képes SOS-választ indukálni. A szülőhöz képest az AB2474 1-szer érzékenyebb volt a PHMB-re és 1-szer kevésbé érzékeny a nalidixinsavra (3. kiegészítő táblázat, világosszürkével árnyékolt sorok). Ezért a vizsgált SOS-válasz mutánsok egyike sem mutatott olyan változásokat a PHMB iránti fogékonyságban, amelyek az SOS-válasz részvételére utalnak.
Végezetül megvizsgáltuk, hogy más (nem SOS) stresszválasz útvonalak befolyásolják-e a PHMB iránti fogékonyságot. Egy sor ismert E. coli stresszválaszmutánst vizsgáltunk párhuzamosan a szülővel a PHMB iránti fogékonyság szempontjából. A mutánsok egyike sem mutatott olyan változást a MIC-értékekben, amely bármelyik stresszválasz útvonal funkcionális részvételére utalna (3. kiegészítő táblázat). Ezért a PHMB antibakteriális hatásai a vizsgált stresszválasz-mechanizmusok panelétől függetlenül jelentkeznek.
A PHMB in vitro kondenzálja a bakteriális kromoszómákat
Ha a PHMB a sejteken belül kondenzálja a bakteriális kromoszómákat, ez a DNS-re gyakorolt közvetlen vagy közvetett hatásokon keresztül történhet. Közvetlen hatásokra gyanakodtunk, mivel a PHMB-ről kimutatták, hogy in vitro kötődik a DNS-fragmentumokhoz15. Úgy döntöttünk, hogy izolált E. coli kromoszómális DNS felhasználásával megvizsgáljuk a PHMB DNS-kötő tulajdonságait. A PHMB-DNS kölcsönhatásokat először elektroforetikus mobilitási eltolódási próbával (EMSA) és festékkizárási próbával vizsgáltuk. A PHMB-t E. coli K-12-ből izolált kromoszómális DNS-sel kevertük, és a keverékeket agaróz/TBE gélekben frakcionáltuk, majd a DNS-t etídium-bromiddal festettük. A PHMB:DNS keverékek tömeg:tömeg arányai ≥0.5 egyértelműen késleltetett elektroforetikus mobilitást mutatott, amit a DNS-nek a lyukban való visszatartása jelzett (4a. ábra). Hasonló eredményeket kaptunk a PHMB-FITC esetében is. A késleltetett mobilitás és a lyukakban való visszatartás összhangban van a PHMB és a DNS közötti stabil kölcsönhatásokkal. Az EMSA-vizsgálatok is csökkent etídium-bromid fluoreszcenciát jeleztek PHMB vagy PHMB-FITC jelenlétében, ami arra utal, hogy az etídium-bromid a PHMB:DNS-komplexek kialakulása miatt nem tudott a DNS-hez kötődni. Ezt a megfigyelést tovább vizsgáltuk a SYTOX®Green DNS-kötő festékkel egy festékkizárási vizsgálatban. PHMB hiányában a SYTOX®Green kötötte az izolált E. coli DNS-t, amit a fluoreszcencia nagymértékű növekedése jelzett a festék önmagában történő hozzáadásához képest. A PHMB előzetes hozzáadása azonban >80%-kal csökkentette a fluoreszcenciát (4b. ábra). A PHMB tehát olyan komplexet képez a bakteriális DNS-sel, amely lassítja az elektroforetikus mobilitást és elrejti a DNS hozzáférését a DNS-ligandumokhoz. Mindegyik kísérlet eredménye arra utal, hogy a PHMB közvetlenül kötődik a DNS-hez.
PHMB kötődése a bakteriális kromoszómális DNS-hez in vitro.
a) A PHMB-t vagy a PHMB-FITC-t E. coli K-12 törzsből izolált kromoszómális DNS-sel kevertük, és a mintákat EMSA-val elemeztük. A gélben mutatkozó késleltetett mobilitás mintázata a PHMB DNS-hez való kötődésére utal. (b) PHMB által közvetített SYTOX®Green kötődés kizárása izolált E. coli kromoszómális DNS-hez, ahol a csökkent fluoreszcencia a PHMB általi DNS-kötődést jelzi. (c) PHMB és izolált E. coli kromoszómális DNS keverékének cirkuláris dichroizmus spektroszkópiája. (d) Az ellipticitás ábrázolása a PHMB:DNS arány függvényében.
Hogy többet tudjunk meg arról, hogy a PHMB DNS-hez való kötődése hogyan befolyásolja a kromoszómális DNS szerkezetét, biofizikai módszereket és mikroszkópiát használtunk. A PHMB és az izolált E. coli kromoszómális DNS kombinációit cirkuláris dichroizmus (CD) spektroszkópiával vizsgáltuk. A PHMB önmagában nem mutatott jellegzetes CD-spektrumot, míg az izolált kromoszómális DNS tipikus DNS-spektrumot mutatott 260 nm körüli pozitív ellipszismaximummal, 252 nm körüli negatív átmenettel és 245 nm körüli negatív mélyponttal. Ez lehetővé tette számunkra, hogy felmérjük a DNS CD-spektrumában a PHMB hozzáadását követően bekövetkező változásokat. A PHMB és a DNS keverékei csökkent ellipticitást mutattak 260 nm-nél, ami a DNS strukturális változásaira utal a PHMB megkötése után (4c,d. ábra). A dinamikus fényszórás (DLS) is kimutatta, hogy a PHMB DNS-hez való kötődése körülbelül 50-60 nm-es nanorészecskék kialakulását eredményezi, alacsony polidiszperzitási indexszel (4a. kiegészítő ábra). Végül a transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM) és a fluoreszcens mikroszkópia szintén azt mutatta, hogy a PHMB DNS-hez való kötődése nanorészecskék képződését eredményezi (4b,c kiegészítő ábra). Ezek az eredmények tehát megerősítik azokat a korábbi jelentéseket, amelyek szerint a PHMB DNS-hez kötődik26 , és azt mutatják, hogy a PHMB izolált bakteriális kromoszómális DNS-hez kötődik, és a kromoszómákat alacsony polydiszperzitású nanorészecskék populációjává tudja kondenzálni.
A PHMB antibakteriális hatását egy dsDNS ligandum elnyomja
A PHMB baktériumokra gyakorolt hatásaira vonatkozó eredményeink nem egyeztethetők össze a PHMB elsődleges antibakteriális hatásmechanizmusára vonatkozó membránbontási modellel. Inkább egy új modellt javasolunk, amelyben a PHMB bejut a baktériumokba, majd kondenzálja a kromoszómákat, amint azt az 5a. ábra szemlélteti. Ha helyes, az új modell a PHMB és más DNS-ligandumok közötti funkcionális kölcsönhatásokat is megjósolná, és ez az elképzelés lehetőséget biztosított számunkra a modell tesztelésére. Röviden, ha ez a modell helyes lenne, akkor a kis molekulatömegű DNS-ligandok várhatóan elnyomnák a PHMB antibakteriális hatását azáltal, hogy versengenek a kromoszómákon belüli DNS-kötőhelyekért. E lehetőség tesztelésére a PHMB és a Hoechst 33258 páros kombinációit használtuk növekedési érzékenységi vizsgálatokban. A Hoechst 33258 egy olyan DNS-ligandum, amely előnyösen kötődik az AT-gazdag szekvenciák kis barázdájához27 , és sejtáteresztő, így megfelelő választás volt ehhez a versengési kísérlethez.
Modell a PHMB antibakteriális hatásmechanizmusára és a növekedésgátlás elnyomására.
(a) A PHMB javasolt antibakteriális hatásmechanizmusa. (b) Páros növekedésgátló kölcsönhatások a PHMB és a Hoechst 33258, valamint a negatív kontroll nem-DNS-kötő ligandumok (triklozán és trimetoprim) között különböző baktériumfajokban. (c) A bakteriális genom AT-tartalma és a PHMB-vel való antibakteriális kölcsönhatások közötti kapcsolat. A növekedésgátló kölcsönhatások és a DNS AT-tartalmának ábrája különböző fajoknál. A kölcsönhatási értékek a PHMB és a Hoechst 33258 vagy a negatív kontroll nem DNS-kötő ligandumok (trimetoprim és triklozán) közötti frakcionált gátló koncentrációs mutatók (FICI). (d) Bacillus megaterium növekedésének gátlása PHMB által és elnyomása a Hoechst 33258 DNS-liganddal való kombinációkkal (kék vonalak). A fajok listáját és a gátlási értékeket lásd a 4. kiegészítő táblázatban.
A gyógyszerkölcsönhatásokat frakcionális gátló koncentrációindex-értékek (FICI) formájában számoltuk ki egy eltérő baktériumfajokból álló panel segítségével. A PHMB:Hoechst FICI-értékei szignifikánsan magasabbak voltak, mint a PHMB és a két nem DNS-ligandummal rendelkező antibakteriális szer bármelyikével kombinált PHMB esetében (5b. ábra). Továbbá a PHMB:Hoechst kombinációk FICI értékei pozitív korrelációt mutatnak a kromoszóma AT-tartalmával (5c. ábra). Más szóval, a PHMB antimikrobiális hatása a sejteken belüli DNS-hez való hozzáféréstől függ. B. megateriumban a PHMB:Hoechst kombinációk hatása szembetűnő volt, ahol a PHMB által okozott növekedésgátlást szubinhibitorikus Hoeschst 33258 koncentrációkkal elnyomták (5d. ábra). A Hoechst 33258 kis molekulájú DNS-ligandum tehát megmentette a baktériumokat a PHMB gátló koncentrációitól.
Ezek a páros gyógyszer-kölcsönhatások azt mutatják, hogy a PHMB antibakteriális hatásai elsősorban a baktériumok DNS-ét célozva jelentkeznek. Összhangban a PHMB esetében megfigyelt sejtpermeabilitás-változási profillal (1b. ábra); az eredmények a PHMB és egy DNS-ligandum közötti versengésre is utalnak a sejteken belüli DNS-kötőhelyekért. Ezért a két ismert DNS-ligandummal végzett külön kísérletek eredményei összhangban vannak a PHMB aktivitására vonatkozó új modellünkkel.
A PHMB bejut az emlőssejtekbe, de a sejtmagokból kizáródik
A PHMB aktivitásának uralkodó modellje szerint a PHMB a baktériumokat a bakteriális membránok károsítása révén öli meg, és a polimer nem lép kölcsönhatásba az emlőssejtek membránjaival (lásd fent). Tekintettel azonban a PHMB váratlan bakteriális sejtbejutási tulajdonságaira és a közelmúltbeli megfigyeléseinkre, miszerint a PHMB bejut a tenyésztett makrofágokba28 és keratinocitákba29 , úgy döntöttünk, hogy közvetlenül megvizsgáljuk, hogy képes-e bejutni emlőssejtek egy csoportjába. PHMB-FITC-t adtunk több emlőssejtvonalhoz és primer fibroblasztokhoz, és a felvételt fluoreszcens mikroszkópiával és áramlási citometriával értékeltük. Minden vizsgált sejttípusban egyértelmű felvételt figyeltünk meg (6a,b. ábra). Emellett ezek a körülmények nem vezettek az emlős sejtmembrán integritásának megbontásához (5a. kiegészítő ábra). A mikroszkópos képek alapos vizsgálata azt mutatja, hogy a PHMB-FITC a vezikulákban volt, és a sejtmagokból kizárva (6a. ábra). Ha igaz, hogy az endoszómák magukba zárják a PHMB-t, akkor a citoplazmába történő felszabadulásnak a PHMB-FITC-t ki kellene iktatnia, és a fluoreszcencia növekedéséhez kellene vezetnie. Ez azért van így, mert a FITC fluoreszcencia alacsony pH-n kioltódik, és a késői endoszómális pH <630, míg a citoplazma pH-ja 7,4. Megfigyeltük, hogy a PHMB-FITC-vel kezelt sejtek fluoreszcenciáját növelte a klorokin, egy ozmolitikus/pufferoló szer31 hozzáadása (6c. ábra), ami összhangban van az endoszómákba zárt polimerrel. A PHMB tehát hatékonyan jut be az emlőssejtekbe, de az endoszómákba záródik, ami a jelek szerint korlátozza a sejtmagokba való bejutást.
PHMB bejutása az emlőssejtekbe.
(a) Primer fibroblasztokat kezeltünk PHMB-FITC-vel (3,5 μg/ml), ellenfestettük Hoechst 33258-cal, és fluoreszcens mikroszkópiával megfigyeltük. (b) PHMB-FITC-vel kezelt emlőssejtek panel áramlási citometriás elemzése. Melléklet: reprezentatív példa a kezeletlen (lila populáció) vagy PHMB-FITC-vel (0,4 μg/mL) kezelt (zöld populáció) HeLa sejtpopulációk áramlási citometriás hisztogramjára. (c) A HeLa sejteket PHMB-FITC-vel (3,5 μg/mL) és klorokinnal (0-20 μM) kezelték 2 órán keresztül. A klorokin fluoreszcenciára gyakorolt hatását áramlási citometriával mértük, a fluoreszcencia intenzitásának geometriai átlagát használva (önkényes egységek (A.U.), logaritmikus skála).