A kriptokrómok

A cirkadián biológiai órák olyan biokémiai oszcillátorok, amelyek körülbelül 24 óránként ciklizálnak, és a fény és más környezeti jelek hatására újraindulnak. Az állatokban van egy központi oszcillátor az agyban, amely az egész szervezet cirkadián viselkedését irányítja, valamint perifériás oszcillátorok egyes szövetekben. Az oszcilláció egy transzkripciós visszacsatolási hurokból ered, amelyben egy sor óratranszkripciós faktor, köztük az időtlen (Tim), a periódus (Per), az óra (Clk) és a Bmal1, valamint a kriptokrómok vesznek részt. A kriptokrómok minden élőlény szerveiben és szöveteiben ubiquitikusan expresszálódnak, és általában nukleáris fehérjék, amelyek a génexpressziót szabályozzák. A legjobban tanulmányozott állati kriptokrómok a Drosophila kriptokróm Cry és az egér kriptokróm Cry1 és Cry2 , és a két Arabidopsis kriptokróm CRY1 és CRY2 is széles körben tanulmányozták.

Drosophilakriptokrómok

A Drosophila Cry egy túlnyomórészt nukleáris fehérje, amely a cirkadián óra fény általi szabályozását közvetíti , bár a citoszolban is megtalálható. A cirkadián órát úgy szabályozza, hogy közvetlenül kölcsönhatásba lép a Tim fehérjével, hogy elnyomja az óra negatív visszacsatolási hurkát (3a. ábra). A fény stimulálja a Cry-Tim kölcsönhatást, ami elősegíti a Tim ubikvitinációját és proteoszóma-függő degradációját, és elnyomja a Per-Tim heterodimer kialakulását. A Clock és Cycle fehérjék heterodimerének gátlása a Per-Tim heterodimer által így feloldódik, és a cirkadián oszcilláció fázisa visszaáll (3a. ábra). Úgy tűnik azonban, hogy a kriptokróm nem az egyetlen olyan fotoreceptor, amely a Drosophila cirkadián óráját behangolja. A crybmutáns légy viselkedési ritmikussága, amelyből hiányzik a Cry funkciója, ennek ellenére a fényre adott válaszreakcióban mégis beidegződhet, hacsak a vizuális pigment általi jelátvitel nem szűnik meg . A Drosophila központi oszcillátorának beidegzésében betöltött fotoreceptor szerepe mellett a Cry-nek fénytől független szerepe is van a perifériás cirkadián oszcillátor működésében .

Az emlős kriptokrómok

A Drosophila Cry két funkciója – mint a cirkadián órának a vizuális pigmentekkel együtt történő beidegzését végző fotoreceptor és mint a cirkadián oszcillátor fehérjekomplex szerves alkotórésze – az emlős kriptokrómokra is jellemző. Az emlős kriptokrómok túlnyomórészt nukleáris fehérjék, de a citoszolban is megtalálhatók. A Drosophila Cry-hez hasonlóan az emlős kriptokrómok is fényfüggő és fényfüggetlen funkciókat látnak el a cirkadián óra szabályozásában. Számos megfigyelés bizonyítja az emlős Cry fehérjék fényfüggő szerepét. Az egyik vagy mindkét Cry gént nélkülöző knockout egerek fény hatására csökkent vagy megszűnt az olyan gének, mint a per és a protoonkogén c-fos expressziójának indukálására való képességük. Sőt, a Cry1 és Cry2 gént egyaránt nélkülöző mutáns egerek pupillái csökkent fényre adott reflexválaszokkal rendelkeznek .

Másrészt a cry1 cry2 kettős mutáns egér látszólag normális ritmizmust mutat fény-sötét ciklikus körülmények között, de a ritmizmust azonnal és teljesen elveszíti szabadon futó (mindig sötét) körülmények között . Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a Cry-fehérjék alapvető és fénytől független funkciót töltenek be az emlősök központi cirkadián oszcillátorában, és hogy a kriptokrómok nem az egyetlen fotoreceptorok, amelyek az óra fényvezérlését közvetítik. Az a tény, hogy a kriptokrómok az egér központi oszcillátorának szerves részei, szinte lehetetlenné teszi az óra fény általi irányításában játszott szerepük közvetlen vizsgálatát. Mindazonáltal azt találták, hogy a Drosophila helyzetével némileg analóg módon az egér cry mutánsa megőrzi a fényvezérlés közvetítésének képességét, hacsak a vizuális pigmentek funkciója nem sérül egyidejűleg. A mindkét kriptokróm mutációját egy retina-degeneratív mutációval együtt hordozó tripla mutáns egerek fény-sötét ciklikus körülmények között szinte aritmiásak . Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az emlős Cry-fehérjék valóban részt vesznek a cirkadián óra fény általi szabályozásában, de a cirkadián óra fény általi irányításában betöltött szerepüket redundánsan más fotoreceptorok végzik. Most már világosnak tűnik, hogy az emlősök cirkadián oszcillátorának irányításában a kriptokrómokkal együtt ható további fotoreceptorok a vizuális pálcikacsont-opszinok és a rokon melanopszin fehérje .

A Drosophila Cry-hez hasonlóan az emlősök kriptokrómjai is fizikai kölcsönhatásba lépnek az órafehérjékkel, beleértve a promóter-kötő transzkripciós szabályozókat, a Per-t, a Clk-t és a Bmal1-et (3b ábra). A Drosophila Cry-vel ellentétben az emlős Cry-fehérjék a cirkadián óra negatív visszacsatolási hurokjának komponensei (3b. ábra). A kriptokróm fizikai kölcsönhatása más órakomponensekkel befolyásolja azok aktivitását, kölcsönhatását, degradációját vagy nukleáris forgalmát, és ennek következtében megváltoztatja az óragének transzkripciós szabályozását . Úgy tűnik azonban, hogy a kriptokrómok és más órafehérjék, például a Per, a Clk és a Bmal1 közötti kölcsönhatást nem befolyásolja a fény, ami arra utal, hogy nem az ilyen kölcsönhatások jelenthetik a cirkadián óra fotó-korlátozásának mechanizmusát, mint a Drosophilában. A transzkripciónak a promóter-kötő transzkripciós regulátorokkal való fizikai kölcsönhatáson keresztül történő közvetlen szabályozása mellett a kriptokrómok a hisztonmódosulások szabályozásában való részvételükkel is befolyásolhatják a cirkadián órát , de hogy ez hogyan működik, még tisztázásra vár.

Arabidopsisz kriptokrómok

Arabidopsis CRY1 és CRY2 túlnyomórészt nukleáris fehérjék, amelyek a génexpresszió szabályozását és a cirkadián óra fényre adott entrénmentálását közvetítik . A CRY1 és CRY2 fontos szerepet játszik a növényi fotomorfogenezisben, például a szárny megnyúlásának kék fény általi gátlásában, a levélnyúlás kék fény általi stimulálásában és a virágzás beindulásának a naphossz által történő szabályozásában . Úgy tűnik, hogy a kriptokrómok a fény hatására bekövetkező génexpressziós változásokon keresztül szabályozzák a növények fejlődési változásait. A CRY1 és a CRY2 együttesen felelősek az Arabidopsis genom akár 10-20%-ának kék fénytől függő génexpressziós változásaiért .

Legalább két mechanizmus létezik, amellyel a kriptokrómok befolyásolhatják a nukleáris génexpressziós változásokat a fény hatására. Először is, a kriptokróm molekula kölcsönhatásba léphet a transzkripciós gépezethez kapcsolódó fehérjékkel, hogy közvetlenül befolyásolja a transzkripciót. Az Arabidopsis CRY2 DNS-szekvencia-független módon kötődik a kromatinhoz ( és M. Maymon és C.L., publikálatlan megfigyelések), de nem világos, hogy egy szekvencia-független kromatin-interakcióban lévő fehérje hogyan szabályozhatja a génexpressziót. Az állati kriptokrómokkal ellentétben, amelyekről kimutatták, hogy a promóter-kötő transzkripciós regulátorokkal való fizikai kölcsönhatáson keresztül szabályozzák a transzkripciót, a növényi kriptokrómokról nem számoltak be ilyen kölcsönhatásról. Egy alternatív modell szerint a növényi kriptokrómok más sejtfunkciókat betöltő fehérjékkel léphetnek kölcsönhatásba, hogy szabályozzák a transzkripciós regulátorok stabilitását, módosulását, sejtszintű mozgását. Például a növényi kriptokrómok kölcsönhatásba lépnek egy E3 ubikvitin ligázzal, a COP1-gyel, ami arra utal, hogy a növényi kriptokrómok az állati kriptokrómok esetében még nem felfedezett módon működhetnek. Ezzel a nézettel összhangban a közelmúltban azt is megállapították, hogy az Arabidopsis kriptokrómjai közvetítik egy fontos virágzásszabályozó, a CONSTANS proteaszóma-függő degradációjának kék fény általi elnyomását. Hogy ezt pontosan hogyan teszik a kriptokrómok, azt még tovább kell vizsgálni.

Mechanizmus

A kriptokrómok katalitikus mechanizmusa még nem teljesen tisztázott, de néhány támpontot találhatunk a CPD fotolázok mechanizmusában, ahol a FAD játssza a fő katalitikus szerepet . A DNS-javítási reakcióban a CPD fotoliáz a DNS pirimidin-dimeréhez kötődik, és “kifordítja” azt a DNS-duplexből az enzim FAD-hozzáférési üregébe, hogy stabil komplexet képezzen. A másik kromofór (pterin vagy deazaflavin), amelyet “antenna” kromofórnak is neveznek, elnyeli a kék vagy UV-A fény fotonjait, és a gerjesztési energiát átadja a FAD flavinjának. A gerjesztett állapotban lévő flavin egy elektront adományoz a pirimidin dimernek a ciklobutángyűrű felhasítása érdekében. Az elektron ebben a folyamatban visszakerül a flavinhez, ami az alapállapotú flavin regenerálódását eredményezi. A helyreállított dinukleotid már nem fér be a FAD-hozzáférési üregbe, ezért disszociál a fotoliázról. A FAD és a FAD-hozzáférési üreg pontos szerepe a kriptokrómok működésében egyelőre tisztázatlan, de elképzelhető, hogy az elektrontranszfer-reakciókban is részt vesz.

Noha a kromofór(oka)t tartalmazó PHR-régió a fehérjék legkonzerváltabb része, a karboxi-terminális doménről kimutatták, hogy mind az állati, mind a növényi kriptokrómok működésében vagy szabályozásában szerepet játszik. Az Arabidopsis kriptokrómok karboxi-terminális doménjének a b-glükuronidáz markerenzimhez fuzionált expressziója konstitutív növekedési választ ad a fényre még sötétben is a PHR régió hiányában . Ezzel szemben a Drosophila és Xenopus kriptokrómok PHR régiói fiziológiailag aktívak a karboxi-terminális domén hiányában . A Drosophila Cry karboxi-terminális doménje fontos a fehérje stabilitásához, a Tim-mel való kölcsönhatáshoz és a fotoreceptor cirkadián fényjelekre való érzékenységéhez , míg a Xenopus Cry karboxi-terminális doménje szükséges a nukleáris lokalizációhoz .

A kriptokrómokat foszforilációval szabályozzák . Kimutatták, hogy az Arabidopsis kriptokrómok foszforilálódnak kék fényre adott válaszként, és ez összefügg a fotoreceptorok működésével és szabályozásával . Továbbá, amikor az Arabidopsis CRY1-et rovarsejtekben expresszálták, azt találták, hogy ATP-függő és kék fénytől függő autofoszforiláción megy keresztül . Nem ismert, hogy az állati kriptokrómok is kötődnek-e ATP-hez, bár kimutatták, hogy az egér kriptokrómok foszforilálódnak .

Az Arabidopsis CRY1 PHR régió és az ATP közötti kölcsönhatás néhány érdekes tulajdonsága emlékeztet a pirimidin dimer és a fotoliáz közötti kölcsönhatásra : az ATP foszfátcsoportjai ki vannak téve az oldószernek; az adenin- és ribózrészek mélyen a FAD-hozzáférési üregben vannak eltemetve; és az ATP víz által közvetített kapcsolatba kerülhet a FAD-dal . Az Arabidopsis CRY1 pHR régiójának ATP-vel való kölcsönhatása szintén nélkülöz számos, a fehérje-ATP kölcsönhatásokban általában megtalálható jellemzőt, mint például a fehérje-foszfát kölcsönhatás, a fehérje-Mg2+ kapcsolat és egy közeli szerin-maradék a foszfotranszferhez . A CRY1 PHR régió szerkezetének topológiájának vizsgálata azonban azt mutatja, hogy mindezeket a tulajdonságokat potenciálisan a kriptokróm karboxi-terminális doménje is biztosíthatja (4. ábra). Az a megfigyelés, hogy a β-glükuronidázzal fuzionált Arabidopsis kriptokrómok szerinben gazdag karboxi-terminális doménjei in vivo konstitutívan foszforilálódnak (, arra utal, hogy foszfotranszfer történhet a FAD-hozzáférési üreghez kötött ATP-ről a közeli karboxi-terminális doménre (4a. ábra). Az is elképzelhető, hogy a fotonok által gerjesztett FAD elektronátvitelt indíthat el a nukleotidra és foszfotranszfert az ATP-ről a karboxi-terminális domén szerinmaradványaira. Mivel a PHR régió felülete túlnyomórészt negatív töltésű, különösen azon a helyen, ahol a karboxi-terminális domén valószínűleg kölcsönhatásba lép vele, a foszforilált karboxi-terminális domén ekkor taszításra kerülne a PHR régió felületéről, ami a kriptokróm konformációjának megváltozását eredményezné. Ez a konformációváltozás lehetővé tenné számára, hogy kölcsönhatásba lépjen más jelzőfehérjékkel és továbbítsa a fényjelet (4a. ábra). Alternatív megoldásként a kriptokróm egy másik molekulája, amely a FAD-hozzáférési üreghez kötődik, szintén biztosíthatja a produktív ATP-kriptokróm kölcsönhatáshoz szükséges hiányzó tulajdonságokat. Valóban, mind a CRY2-CRY2 kölcsönhatás, mind a CRY1-CRY2 kölcsönhatás kimutatható Arabidopsisban (D. Shalitin, X. Yu és C.L., publikálatlan megfigyelések). A kriptokrómok homo- vagy hetero-oligomerjének kialakulása mechanizmust biztosítana az intermolekuláris foszfotranszferhez, ami megváltoztathatja a kriptokrómok szerkezetét (4b, c ábra).