A klonogén próbát számos tanulmányban használták a klonogén növekedés és annak citotoxikus in vitro stimulusok, köztük sugárzás, kemoterápiás gyógyszerek és/vagy molekulárisan célzott szerek általi megszüntetésének számszerűsítésére. A túlélési frakciók meghatározásának jelenlegi standard eljárása azon a feltételezésen alapul, hogy a kezelt sejtkultúrákban a klonogén növekedés normalizálható a kezeletlen kontrollokhoz egy sejtvonal-specifikus, állandó PE-vel való osztás révén.
Most azonban megmutatjuk, hogy ez nem általánosan alkalmazható. Ezzel szemben adataink egyértelműen jelzik, hogy a tenyésztőedénybe vetett sejtek száma és a kapott telepek száma közötti korreláció korántsem mindig lineáris. A kooperatív viselkedésű sejtvonalak esetében a klonogén túlélési adatok PE-alapú elemzése nagy vagy óriási assay-intrinsic hibákkal járó eredményeket eredményezett. Még akkor is, ha az elemzéshez csak ésszerű számú telepeket tartalmazó tenyészcsészéket (C = 5-100) használtak, a nagyfokú sejtkooperációval rendelkező sejtvonalak esetében a klonogén túlélési frakciók egy adott dózisnál jóval több mint egy nagyságrenddel különböztek. Megjegyzendő, hogy gyakorlatilag bármilyen túlélési görbe (meredek vagy lapos, mérsékelten vagy erősen görbült, lineáris, kvadratikus vagy szabálytalan) levezethető az adott adathalmazból számított eredmények ezen tartományából – ez a megfigyelés különösen fontos lehet a sugárbiológusok számára.
Az adataink összességében azt mutatják, hogy a klonogén túlélési adatok hagyományos PE-alapú elemzése nem megfelelően működik, amint egy kísérleten belül egy vagy több feltétel mellett megjelenik a sejtek együttműködése, és a kinyert túlélési eredmények nem kielégítően nagy tartományban fognak eltérni. Konkrétan, az eredmények erősen torzítottak lesznek, ha csak egy vagy néhány hasonló sejtsűrűségű sejtet ültetnek be. Ez a gyakorlat a vizsgálatban rejlő hibákat generál, amelyek a választott sejtsűrűség közvetlen következményei, és ezért nem alkalmasak statisztikai hibaelemzésekre. A kooperatívan növesztett sejtvonalak esetében megfigyeléseink részben magyarázatot adhatnak a kezelési válaszadatokra vonatkozó, a vizsgálatok, a kutatók és a laboratóriumok közötti eltérésekre. Az A549 kolóniaképződési vizsgálat adatainak metaanalízise tovább erősíti ezt a hipotézist: Egy 156 különböző vizsgálatból álló panelen belül Nuryadi és munkatársai az SF4 értékekről számoltak be erre a specifikus sejtvonalra vonatkozóan, amelyek 5 és 90% között mozogtak, az SF4 interkvartilis tartománya pedig több mint 25% volt . Bár különféle más paraméterek minden bizonnyal befolyásolhatják a kezelésre adott válaszadatokat, adatainkból arra következtetünk, hogy a sejtek együttműködése a vizsgálatok közötti változékonyságot magyarázó fő tényező. Mivel a klonogén túlélési frakciók kis eltérései is arra ösztönözhetik a kutatókat, hogy új tudományos hipotéziseket tételezzenek fel és vizsgáljanak, amelyek végül hamis pontosságon alapulhatnak, új elemzési megközelítést dolgoztunk ki, amely kevésbé érzékeny a sejtsűrűség hatására – különösen, de nem csak a kooperatívan növekvő sejtvonalak esetében. Ez a módszer figyelembe veszi a beültetett sejtszámok és a kolóniaszámok közötti nem lineáris összefüggéseket, amelyeket a beültetett sejtszámok széles skáláját tartalmazó tenyészcsészék pontozásával kapunk minden kezelési körülményre vonatkozóan.
Matematikailag megközelítésünk a különböző besugárzási dózisoknál a kolóniaszámok illesztett értékének hatványozott regresszióját és interpolációját használja. Ugyanarra az adathalmazra alkalmazva, amelyet a PE-alapú számításokhoz használtunk, egyértelműen stabilabb, sejtsűrűségtől független eredményeket szolgáltatott. A figyelmes olvasók észrevehették, hogy az itt bemutatott módszer szerint végzett túlélési hányad számítások kizárólag az a együtthatóra és a b exponensre támaszkodnak, amelyeket a teljesítményregresszióval nyertek ki. Bár ez nyilvánvalóan kompenzálja a sejtek együttműködésének hatásait, magában hordoz egy másik hibaminőséget, amely a regresszió pontatlanságából ered, és amely nem hasonlítható össze kvantitatív módon a PE-alapú túlélési hányad-számítások hasonló hibaminőségével. Ennek megfelelően ezt a hibát minimalizálni kell gondos kísérlettervezéssel, elegendő számú független ismétléssel. Továbbá a túlélési frakciószámításokat csak az R regressziós együttható által jelzett megfelelő teljesítményű teljesítményregressziós eredményekkel szabad elvégezni.
Matematikai megközelítésünk alapvetően a PE-alapú klonogén túlélési számításokat helyettesíti a következő kérdéssel:
Hányszor több sejtet kell egy kezelt tenyészcsészébe vetni ahhoz, hogy a kontrollcsészében lévővel azonos számú kolónia keletkezzen?
A b exponensnek ebben a tekintetben különös jelentősége van. Megmutatja, hogy a beültetett sejtek száma és a megszámlált telepek száma közötti korreláció lineáris-e (b ≈ 1) vagy sem. A BT20 és SKLU1 sejtek esetében kapott magas b-értékek azt jelzik, hogy a sejtek in vitro növekedése lelassul (vagy teljesen megszűnik), ha az egy sejtre jutó táptalaj térfogatát növeljük – akár nagy vizsgálati térfogat alkalmazásával, akár a beültetett sejtek számának csökkentésével. Hangsúlyozni kell, hogy a b-értékek semmiképpen sem specifikusak egy adott sejtvonalra, hanem inkább a választott sejttenyésztő közeg, számos vizsgálati inkubációs paraméter és a kísérleti eljárás következményei, beleértve gyakorlatilag minden olyan szempontot, amely befolyásolhatja az egysejtűként ültetett, extrém stresszhelyzetben lévő sejtek klónikus kinövését, mint például a közeg összetétele, tápanyagokkal és növekedési faktorokkal való kiegészítés, a sejtek elkülönítésére használt módszerek, műanyag edények stb. Például a közel konfluens BT20 sejtekből származó kondicionált közeg használata erősen csökkentette a BT20 egyedi sejtek kooperatív viselkedését, míg ez az eljárás nem volt hatással a nem kooperatívan növekvő MDA-MB231 sejtek klonogén növekedésére. Továbbá a kooperatív BT20 sejtek megduplázódási ideje függött mind a vizsgálat inkubációs idejétől, mind a kútban lévő sejtsűrűségtől, így magától értetődő biológiai magyarázatot adva a PE-alapú számításokkal kapott pontatlan klonogén túlélési frakciókra: Egy proliferáló sejtklaszter növekedési sebessége egyszerűen túl lassú lehet ahhoz, hogy a vizsgálat inkubációs idején belül elérje a kolóniánként 50 sejtes küszöbértéket. Ennélfogva egy pl. 35 lassan proliferáló sejtből álló klaszter látszólagos “nem-klonalitása” a leállítási időpontban csupán a vizsgálat inkubációs idejének elkerülhetetlen következménye, amelyet – legalábbis bizonyos mértékig – önkényesen választanak meg. Ebben az összefüggésben emellett elemeztük az inkubációs idő hatását a kapott klonogén túlélési frakciókra, és megfigyeltük, hogy nem elegendő a leállítási időpontot pusztán a kontrollcsészék vizsgálatával meghatározni, ahogyan azt mások javasolták : Az inkubációs időszak idő előtti befejezése rendkívül alacsony túlélési frakciókhoz vezethet az agresszívebb kezelést kapott lemezeken, ahol a sejtnövekedés folytatása előtti károsodásjavítás további időt igényel.
Fontos, hogy adataink teljes mértékben összhangban vannak az 1940-es és 1950-es évek úttörő sejtkultúra-kutatóinak korszakalkotó eredményeivel, és egyszerűen egy olyan jelenséget tükröznek, amelyet akkoriban széleskörűen vizsgáltak. Puck és munkatársai 1956-ban elsőként publikálták a besugárzott egyes sejtek túlélési görbéjét. Ennek az alapvető eredménynek a legnagyobb tudományos kihívását azonban az emlőssejtkultúra egy akkor még megoldatlan problémája jelentette: A sejtvonalak in vitro növekedése leállt, amint a sejteket alacsony sűrűségben telepítették. E probléma megoldására tett kísérletet 1948-ban Sanford és munkatársai, akiknek sikerült egysejtes fibroblaszt telepeket tenyészteniük kis kapillárisokban, ahol a sejtekből származó faktorok diffúziója a közegbe erősen csökkent, így elegendő autokrin növekedési stimulációt tettek lehetővé . Megállapították a táptalaj tenyésztett sejtek általi előkondicionálásának fontosságát, és arra a következtetésre jutottak, hogy a nagy sűrűségű sejttenyészet végtelen növekedéséhez elegendő sejttenyésztő táptalaj valójában “messze nem optimális egyetlen sejt növekedéséhez”. Ezzel összhangban Earle és munkatársai leírták, hogy az adott sejttípus nagyon alacsony sűrűségű ültetése sejthalált eredményezett , és ez a munka képezte az alapját az emlőssejtek in vitro klonogén növekedéséről szóló első publikációnak, amelyet Puck és Marcus írt 1955-ben . Az egysejtűek növekedését elősegítő kondicionált táptalaj szükségessége által inspirálva, egy HeLa egysejtes és egy azonos típusú, erősen besugárzott feeder sejtekből álló rétegből álló ko-kultúrás rendszert használtak. A korábbi vizsgálatokkal összhangban arra a következtetésre jutottak, hogy az egysejtes növekedés gátlása nagy vizsgálati térfogatokban egy “rövid életű, diffúzióra képes tényező elvesztése” miatt következett be. Későbbi publikációkban, például a besugárzott emlőssejtek első túlélési görbéjét tartalmazó publikációban Puck és munkatársai gyakran mellőzték a feeder rétegek használatát, mivel fejlett tenyésztési technikákat fejlesztettek ki, amelyek lehetővé tették az egysejtes növekedést 100%-os PE-vel, a feeder sejtekkel történő növekedési faktor kiegészítés nélkül . Kijelentették, hogy a gondos mosási és tripszinizálási protokollok alapvető fontosságúak ebben a tekintetben, és megalkották a “kooperatív akció” kifejezést annak leírására, hogy a tenyésztőedényben lévő sejtek genotípusuk és fiziológiai állapotuk tekintetében is különbözhetnek egymástól . Eredményeink összefoglalják ezeket a megfigyeléseket: Egy 50 rákos sejtvonal panelen belül megfigyeltük, hogy az egyes sejtek szuboptimális növekedése a modern, standardizált, FCS-vel kiegészített táptalajban még mindig nagyon gyakori jelenség, amint az abból a megállapításból levezethető, hogy a sejtvonalak több mint fele kooperatív növekedési viselkedést mutatott. Ennélfogva, ha egy adott sejtvonal esetében szuboptimális PE-t találunk, a klonogén vizsgálat valószínűleg egyszerre mutatja ki az adott kezelés hatását és a sejtek együttműködésének hatását. Nem tartozott e vizsgálat tárgykörébe olyan specifikus növekedést támogató tényezők azonosítása, amelyek befolyásolhatják az elemzett sejtvonalak PE-jét. Feltételezzük azonban, hogy egy adott sejtvonal egyes sejtjei számára szuboptimális növekedési feltételeket eredményezhetnek nagyon különböző paraméterek, például a klasszikus növekedési faktorok és/vagy hormonok (pl. epidermális növekedési faktor vagy ösztrogén) alacsony koncentrációja, de különböző alacsony és nagy molekulatömegű metabolitok is, amelyek iránt az egyes sejtek legalább egy része auxotrófiát mutat. Ezenkívül az egyes sejtek tápanyag-utánpótlását egy tenyészedényben valószínűleg befolyásolják a környező közeg és a műanyag edények fizikai-kémiai paraméterei, beleértve a megfelelő auxotrófiás faktorok fehérjekötődésének vagy a műanyag felületre való adszorpciójának mértékét. Elméletileg ezt a problémát olyan intézkedésekkel lehetne kezelni, amelyek helyreállítják a maximális PE-t alacsony sűrűségű körülmények között, így az S és a C között (újra) lineáris korreláció jön létre (b = 1). Puck ajánlása a feeder sejtek, kondicionált médiumok és/vagy az egyes sejtek lágy agarba való beágyazása elegendő lehet ennek eléréséhez a kiválasztott sejtvonalak esetében, és ennek megfelelően növelheti a PE-alapú számítások robusztusságát. Nyilvánvaló azonban, hogy több mint kihívást jelenthet a vizsgálati feltételek finomítása és standardizálása, hogy az egyes sejtek túlélési és növekedési rátája optimális legyen minden egyes, érdeklődésre számot tartó sejttípus esetében . Úgy döntöttünk, hogy elfogadjuk az egyes sejtek növekedésére vonatkozó szuboptimális vizsgálati feltételeket, és ehelyett olyan számítási módszert fejlesztettünk ki a klonogén túlélési adatok elemzésére, amely figyelembe veszi ezt a jól leírt jelenséget. Nyilvánvaló, hogy a teljesítményregressziót és interpolációt alkalmazó megközelítésünk meghaladta az 1950-es évek technikai lehetőségeit, amikor a túlélési adatokat szemmel illesztették . A következő évtizedek során azonban valahogy a sejtek együttműködésének jelentősége kikerült a figyelem középpontjából. Bár az idők során néhány beszámolót jelentettek a kolóniaképződési vizsgálatok nemlinearitásáról, a PE-alapú elemzések korlátozott teljesítményével nem foglalkoztak .
Érdekes, hogy ezek a tanulmányok bizonyos sejttípusok esetében bizonyos körülmények között a kolóniák számának nem lineáris növekedéséről számoltak be a beültetett sejtek számának növekedésével. Ezzel összhangban a mi panelünkben szereplő néhány sejtvonal esetében is valamivel 1,0 alatti b-értékeket kaptunk. Három különböző forgatókönyv magyarázhatja ezt a megfigyelést, amelyek közül kettő módszertani artefaktumokra vezethető vissza: Először is, a kissé 1,0 alatti b-értékek olyan kutak számlálásából adódhatnak, amelyekben nagyszámú nagyra nőtt telep van, és ahol a kutató figyelmen kívül hagyja a kis telepeket (lásd az 1a. ábrán “nd”-vel jelölt kutakat). Másodszor, a nagy sejtszámú edények sejtnövekedése a tápanyagkoncentráció gyors csökkenése miatt már a korai fázisban gátolva lehet, ami elpusztult telepeket eredményezhet. Egy harmadik – és biológiailag kevésbé intuitív – lehetőség a sejtnövekedés kompetitív viselkedése, például a növekedést gátló faktorok kiválasztása miatt. Fontos, hogy e jelenségek bármelyikét figyelembe veszi a regressziós és interpolációs megközelítés, mivel figyelembe veszi a linearitástól való eltérést, amelyet a b-érték tükröz.
Mellett figyelemre méltó, hogy a különböző sejtvonalak b-értékei a kezeletlen és a besugárzott körülményekhez képest nem azonosak. Az esetek többségében a besugárzott sejtek b-értékei általában magasabbak, mint a kezeletlen kontrollok megfelelő b-értékei, ami arra utal, hogy a sejtek együttműködése besugárzás hatására megnő. Következésképpen a C = 5 és 100 telep között kapott túlélési frakció értékek tartománya szélesebb, mint közel azonos b-értékek esetén (lásd HCC1806 és A549 sejtvonalak). Ez azt jelenti, hogy technikailag nem lehetséges pontosabb túlélési értékek kinyerése a klonogén vizsgálati eljárással – kivéve, ha egy fix telepszámot (C) választottak ki az elemzéshez. Továbbá a kezelt sejtek rendkívül magas b-értékeivel rendelkező sejtvonalak különösen érdekesek lehetnek a terápiarezisztencia-vizsgálatok szempontjából. Például egy bizonyos sejttípus által szekretált, sugárzás által indukált túlélési faktor(ok) azonosíthatók a megfelelően magas b-értéknek köszönhetően.
Összefoglalva, adataink azt mutatják, hogy a kolóniaképződési kísérletekből származó adatokat gondosan elemezni kell, és figyelembe kell venni a sejtek együttműködésének alábecsült hatását a túlélési frakció számításaira. Ez nagymértékben növelheti a klónképződési kísérlet megbízhatóságát – és az arra épülő hipotézisek rugalmasságát.