Eredmények
A Ritka Szteroidbetegségek Nemzetközi Konzorciumának 36 genetikailag igazolt AME-betegének demográfiai és klinikai fenotípusáról számolunk be. A betegek többsége ománi (36-ból 22) és perzsa (36-ból 6) származású volt, 75%-uk vérszerinti házasságokból származott, főként Ománon belül (1B. ábra és S1. táblázat). Az AME diagnózisának medián életkora 4,6 év volt (tartomány: 0,1-15), és a kohorsz mindkét nem esetében egyenlően oszlott meg. A betegek többsége (86%) koraszülöttként jött a világra, 76%-uk pedig a terhességi korához képest kicsiben született. Az 1A. ábra mutatja, hogy kohorszunkban hat miszense, egy inszerciós, két deléciós és három frameshift mutáció, valamint két indel volt. Az AME patofiziológiája alapján várható volt, hogy az artériás középnyomás minden alany esetében a 90. percentilis fölé emelkedett (1C. ábra). Az átlagos szérum káliumszint a diagnózis felállításakor alacsony volt, 2,72 mmol/l (tartomány: 1,5-4,1 mmol/l), míg a szérum bikarbonát szintje magas, 29,5 mmol/l (tartomány: 20-38 mmol/l) (1. ábra D és E). A szérum aldoszteronszintje várhatóan alacsony volt (1. ábra F), két betegnél tisztázatlan okok miatt emelkedett volt. Emellett a reninszintek is alacsonyak voltak, kivéve két betegnél (10,4 és 14 ng/ml/h), akik terápiában részesültek (S1. táblázat). A 29 betegből álló alcsoportban az átlagos (THF + alloTHF)/THE arány, amely a kortizol és a kortizon fő vizeletmetabolitjait képviseli, 19-nél (tartomány: 3-55, normál: 1,0) szignifikánsan emelkedett volt (1G ábra). Figyelemre méltó, hogy 36 betegből 27-nél (75%) nefrokalcinózis is jelentkezett. A nefrokalcinózis krónikus, hosszú ideje fennálló hipokalémiából eredhet, ahogyan azt például a Bartter III típusú szindrómában megfigyelték (14).
Hogy megértsük, hogy a HSD11B2-hiány klinikai fenotípusa előre jelezhető-e egy adott HSD11B2-mutáció által kiváltott enzimszerkezeti változások vizsgálatával, in silico analízist végeztünk három ösztrogén HSD17B1 segítségével, amelyek 284 aminosavra vonatkozóan 27%-os szekvenciahasonlóságot mutattak a HSD11B2-vel (S1A ábra). A humán HSD11B2 modell egy jellegzetes konzervált NAD-kötő Rossmann-féle hajtásmotívumot mutatott (S1B ábra) egy szomszédos szubsztrátkötő hellyel (S1 C és D ábra). A HSD11B2 monomer és dimer formáinak 500 ns-os MD-szimulációi stabilan hajtogatott fehérjét tartalmazó stabil modellt jeleztek (S1 E-H ábra). Az Internal Coordinate Modeling (ICM) szoftvert (www.molsoft.com) (18) használtuk az AME betegeknél talált miszense mutációk vagy a kísérletileg létrehozott mutációk ΔΔG-jének meghatározására. Minden mutáció (2A ábra) a ΔΔG értékek növekedését mutatta, ami a fehérje stabilitásának és funkciójának elvesztésére utal (2B ábra).
A HSD11B2 dimer interfészét érintő zavaró mutációk. (A) A meglévő HSD17B1 kristályszerkezetek felhasználásával konstruált humán HSD11B2 dimermodell: 1IOL (17β-ösztradiollal együtt kristályosított), amely a legteljesebb szerkezet volt, hiányzó maradékok nélkül; 1JTV (1,5 Å), amelyet tesztoszteronnal együtt kristályosítottunk, és nagyobb felbontást mutatott, mint az 1IOL (2,3 Å); és 1FDV, amelyet a koenzim NAD-dal együtt kristályosítottunk. Az összes ismert mutált maradék helyzete fel van tüntetve. (B) ∆∆G értékek súlyos (piros) vagy enyhe (fekete) HSD11B2 mutációk esetén. (C) A dimer határfelületen két R186-E190 ionpár alakul ki a szomszédos alegységek kétszeresen fordított szimmetriája között. A monomer (D) esetében egy intrahelikális ionpár alakul ki, amely hasonló a HSD17B1 sablonokban kialakuló R112 és E120 sóhídhoz. (E) Az egyik alegységre térképezett mutációk (kék) térbeli pozíciói. A két alegység megkülönböztethetően színezett (barna és kék). A NAD+ (sárga) és a kortizol (zöld) pálcikaként van ábrázolva. Az ionpáros kölcsönhatás a dimer határfelületen stabil az 500 ns szimuláció során (F). A monomer konformációs változásai miatt azonban némi fluktuáció figyelhető meg az intrahelikális kölcsönhatásban (G). (H) Az R186 ionpáros kölcsönhatást létesít a szomszédos alegységből származó E190-zel. Az R186C mutáció az ionpáros kölcsönhatás elvesztését eredményezi. A monomerben az R186 és az E190 között kialakult intrahelikális ionpár szintén elveszik. (I) Az A237V mutáció fokozza a hidrofobicitást a határfelületen. (J) A D244 egy intrasubegységen belüli ionpár kölcsönhatást képez az R336-tal, valamint hidrogénkötéseket a szomszédos alegység R360-ával. A mutánsban az aszparagin poláris, töltés nélküli oldallánca nem képes szerkezeti stabilitást biztosítani. (K) Az L251S mutációban az OH-csoport hidrogénkötést létesít a szomszédos alegység R361-ével, így fokozza a kölcsönhatást a dimer határfelületen. (L) A D176N és a T200 között kialakuló hidrogénkötés fokozza az inaktív dimer állapotot.
AHSD11B2 inaktív állapotában homodimerként létezik (13). Négy maradék – nevezetesen az R186, E190, A237 és R336 – a dimer interfészen helyezkedik el, és ezért zavarhatja a dimerképződést (2C ábra). Az R186 és E190 maradékok az α4 hélix dimer interfészén helyezkednek el. A szomszédos alegység kétszeresen fordított szimmetriája következtében egy alegységközi ionpár kölcsönhatás (R186-E190) jön létre (2D ábra), hasonlóan a HSD17B1-ben lévő R112-E120 ionpárhoz (15⇓-17). Fontos, hogy ez a kölcsönhatás stabilnak bizonyult, és az 500 ns-os MD-szimulációk során végig fennmaradt (2. ábra E-G). Továbbá a kölcsönhatás stabilizálja az α4 hélixet, és fenntartja a koenzim-kötőhely körüli rugalmasságot. Így az R186C mutáció az interszubegységes ionpár elvesztését eredményezi, és az egyensúlyt egy aktív monomer enzim kialakulása felé tolja (2H ábra). Emellett megakadályozza az intrahelikális ionpár kölcsönhatás kialakulását, és így lehetővé teszi a koenzimkötő hely körüli szerkezeti elemek destabilizálódását.
Ez a dimer interfészen több más bomlasztó mutáció is található, amelyek az A237, D244, L251 és D176 maradékokat érintik. Az A237-es maradékot mindkét HSD11B2 alegységből származó L241 és V239 veszi körül. Val-ra mutációja növeli ennek a klaszternek a hidrofobicitását és erősíti az enzim inaktív dimer állapotát (2I. ábra). A D244 maradék nemcsak egy alegységen belüli sóhidat hoz létre az R336-tal, amely összetartja az α5 hélixet és a β7 lapokat, hanem hidrogénkötéses kölcsönhatásokat is létrehoz a szomszédos alegység R360-ával (2J. ábra). Asn-re mutációja csökkenti az R360 kölcsönhatás erősségét, ami az R366-tal való sóhíd elvesztéséhez vezet; ez viszont rontja a fehérje stabilitását. Hasonlóképpen, a hidrofób L251 oldallánc mutációja Ser hidroxilcsoportra növeli a polaritást és hidrogénkötést képez az R361 pozitív töltésű oldallánccsoportjaival; ez fokozza a dimer kötődést (2K ábra). Végül a D176 Asn-ra történő mutációja hidrogénkötést hoz létre az aszparagin és a T200 között, így fokozza az inaktív dimer állapotot (2L ábra).
A HSD11B2 szubsztrát- vagy koenzim (NAD+) kötő zsebet alkotó maradékok mutációi in vitro vizsgálatokban kimutatták, hogy megszüntetik az enzimaktivitást (19) és súlyos AME-t okoznak. Az Y226 például a szubsztrátkötő zsebben található (3A ábra). Az aromás fenol oldallánc hidrofób kölcsönhatásokat képez a szubsztrát aromás gyűrűjével. Az Y226N mutáció ezt a maradékot egy nem aromás maradékkal helyettesíti, ami a hidrofób kötés elvesztését eredményezi, ami zavarja a szubsztrátkötést (3A ábra). Továbbá ez a mutáció az oldalláncot hidrofóbról hidrofilre változtatja, ami kedvezőtlen egy hidrofób szubsztrát kötődése szempontjából. Az A221V mutáció a rövid oldalláncot egy kissé terjedelmesebb Val oldallánccal helyettesíti, így a zseb térfogatának csökkentésével zavarja a szubsztrátkötést, míg az A221G mutáció csökkenti a hidrofóbságot és rugalmasságot hoz a merev kötőzseb körül (3B. ábra).
Interferencia a koenzim vagy a szubsztrát HSD11B2-hez való kötődésében. (A) A 226-os pozícióban lévő tirozin alkotja a szubsztrátkötő hely falát és hidrofobicitást kölcsönöz. Az N226 mutációja a hidrofób kötés elvesztését eredményezi, ami kedvezőtlenné teszi a szubsztrátkötést. (B) Az A221V mutáció csökkenti a szubsztrátkötő zseb térfogatát, míg az A221G növeli a kötőhely körüli rugalmasságot. (C) Az L179R mutációban a pozitív töltésű guanidinium oldallánc hidrogénkötéseket létesít a T184 és E172 méretláncokkal, ezáltal csökkentve a NAD+-kötőhely körüli rugalmasságot. (D) Az Y232 hidroxi-fenil oldallánca hidrogénkötéseket létesít a ribózcukor hidroxilcsoportjával és az N171 oldalláncával. Ezek a hidrogénkötések nélkülözhetetlenek, mivel a fenilalanin, szerin vagy cisztein mutációi nem tolerálhatók. A fenilalanin mutáció eltávolítja a hidroxilcsoportot és a hidrogénkötés elvesztéséhez vezet, míg a szerin mutáció rövidebb oldallánccal az OH-csoport NAD+-tól való nagyobb távolságát eredményezi, és ismét megakadályozza a hatékony hidrogénkötést; mindkét mutáció inaktív enzimet eredményez. (E) A G89D mutációban az aszparaginsav karboxil oldallánca súlyos sztérikus ütközéseket okoz a NAD-ban lévő adenozin ribózcukor-részével, és befolyásolja a koenzimkötést. (F) A K236R mutációban lévő terjedelmesebb oldallánc csökkenti a koenzimkötő zseb méretét, ami kedvezőtlenné teszi azt az optimális NAD+-kötés szempontjából.
Modellünk szerint a kortizolban a poláris 17-OH csoport egy hidrofób régióba van behúzva, amelyet Y226, P227 és L229 vesz körül. Ez a hidroxilcsoport hiányzik a kortizonból, ami fokozott hidrofób kölcsönhatásokat és ∼10-szer nagyobb kötési affinitást eredményez a HSD11B2-hez a kortizolhoz képest (S2A ábra). A vese mellett a HSD11B2 a placentában is kifejeződik. Bár a mineralokortikoid-receptor ebben a szövetben nem expresszálódik, a HSD11B2 inaktiválja a kortizolt, hogy megszüntesse annak növekedést gátló és proapoptotikus hatását az embrionális fejlődés során. A terhesség alatt az anyai keringésben lévő magas progeszteronszint kötődhet a HSD11B2 aktivitásához és módosíthatja azt. Ez a progeszteron-kötődést megzavaró esetleges funkcióvesztéses mutációknak a születési súlyra gyakorolt hatásaiban nyilvánulhat meg. Például az A221V mutáció súlyosan befolyásolja a progeszteron kötődését, jobban, mint a kortizolét, mivel a Val és a progeszteronban lévő kiálló metilcsoportok között sztérikus ütközések vannak (S2B ábra). Nagyon érdekes módon azt találtuk, hogy az A221V mutációval rendelkező két beteg a terhességi korhoz képest kicsi volt (S1. táblázat). Hasonlóképpen, az A221G mutáció közvetve befolyásolja a progeszteron kötődést a kötőhely szerkezetének megváltoztatásával. Hasonlóképpen, az Y226N mutáció károsabb a progeszteron kötődésére, mivel csökkenti a progeszteron váza és a tirozin hidroxifenilgyűrűje közötti hidrofób kölcsönhatásokat (S2B ábra). Ezzel szemben a P227 közvetett szerkezeti támogatást nyújt a kötőhelynek, és a Leu-ra történő mutáció hasonló hatással van mind a kortizol, mind a progeszteron esetében (S2B ábra).
Négy olyan mutáció van, amely a koenzimkötőhelyen található és azt megzavarja, így súlyosan rontja a HSD11B2 aktivitását. Az L179-es maradék oldallánca normális esetben a β4 lap és az α4 hélix közötti rövid fordulóban helyezkedik el térben (3C ábra). A V174 és L282 hidrofób oldalláncaival való kölcsönhatások lehetővé tétele révén ezek a kölcsönhatások rugalmasabbá teszik a koenzimkötő helyet. Az Arg-ra történő mutáció guanidinium oldalláncot vezet be, amely kölcsönhatásokat tesz lehetővé az E172 karboxilcsoportos oldalláncával és a T184 hidroxilcsoportos oldalláncával (3C ábra), így merevséget hoz a fordulatba, és csökkenti az optimális enzimfunkcióhoz szükséges rugalmasságot (7). A koenzimkötő zsebben elhelyezkedő Y232 egy erősen konzervált maradék a Rossmann-redő motívumban (20), ami arra utal, hogy mutációja károsan hat az enzimaktivitásra (21). Az Y232 hidroxil-fenil oldallánca fontos hidrogénkötéseket képez az N171-gyel és a NAD+ -val, a koenzimet a katalitikus funkciója szempontjából megfelelő pozícióban tartja (3D ábra). Ez a kölcsönhatás az Y232C mutációban megszakad, ami súlyos AME-t okoz. Ennek a maradéknak az enzimaktivitásban betöltött fontosságát egymástól függetlenül több mesterséges mutációval is megerősítették (21) (3D ábra). A G89D mutációban az Asp karboxil oldallánca súlyos sztérikus ütközést mutat az adenozin ribózcukor-részével, ami befolyásolja a NAD+ kötődését (3E ábra). Egy másik mesterséges mutáció, a K236R a NAD-kötés megszakadásához vezet (3F ábra). Miközben a mutáció megőrzi a NAD+-al való hidrogénkötésen keresztüli kölcsönhatás képességét, megszünteti az enzimaktivitást (21).
A HSD11B2 szerkezeti stabilitásának károsodása megbontja a tercier szerkezetét, ami az enzimaktivitás jelentős csökkenését és súlyos AME-t okoz. Az L250 maradék az α5 hélixben helyezkedik el, és oldalláncai egy szűk hidrofób zsebben ülnek, amelyet az L204, F246, W253, V255 és V257 oldalláncai vesznek körül (4A ábra). A hidrofób zseb maradványait az R208 és az E249 közötti ionpáros kölcsönhatás rögzíti. A Pro oldallánc bevezetése merevség bevezetésével megtöri az α5 hélixet. Ez a zseb túl szűk ahhoz is, hogy befogadja az Arg nagy, terjedelmes guanidinium oldalláncát (4A. ábra). A hidrofobicitás későbbi csökkenése ebben a régióban befolyásolja a szerkezeti stabilitást. Egy másik stabil intrahelikális ionpáros kölcsönhatás a D144 és az R147 között jön létre (4B ábra). Ez a kölcsönhatás lehetővé teszi, hogy az α3 hélix szorosan összecsomagolódjon a szomszédos β-lemezekkel a NAD+ kötőhely közelében. A D144V mutáció ennek a kölcsönhatásnak az elvesztését eredményezi, és destabilizálja a pakolási elrendeződést (4B ábra). A hidrofób pakolás az F185S mutációban is megbomlik, amikor a V182, C188 és M189 hidrofób maradékok által körülvett fenilalanin aromás oldalláncát egy szerin poláros oldallánccal helyettesítjük (4C ábra). Hasonlóképpen, az L363 hidrofób oldallánca, amelyet az M347, I350 és F362 vesz körül, egy helix-turn-hélixben helyezkedik el (4D. ábra). Az L363P mutáció megzavarja a hélixet és a helyi szerkezeti környezetet.
A HSD11B2 stabilitását befolyásoló mutációk. (A) Az L250 az α5 hélixen helyezkedik el, és az oldalláncot szűkített hidrofób zseb veszi körül. A terjedelmes argininre vagy prolinra történő mutáció, amely helixtorzulást vezet be, nem tolerálható. (B) A D144V mutáció a D144-R147 ionpáros kölcsönhatás elvesztését eredményezi, és destabilizálja az α3 hélix pakolási elrendezését a NAD-kötőhely közelében. (C) Az F185S mutációban a poláros oldallánc megbontja a V182, C188 és M189 által kialakított hidrofób pakolást. (D) A hidrofób L363 maradék egy helix-turn-hélixben helyezkedik el, amelyet M347, I350 és F362 vesz körül. A prolinra történő mutáció megzavarja a hélixet és a helyi szerkezeti környezetet. (E) Az A328V mutánsban a valin oldallánca sterikus ütközéseket mutat a hidrofób zsebben. (F) Az S180 hidroxilcsoportos oldallánca kölcsönhatásokat létesít a gerincoszlop atomjaival és a T184 oldalláncával. A fenilalanin oldallánc megszünteti ezeket a kölcsönhatásokat, és rugalmasságot kölcsönöz a huroknak. (G) Az R208-E249 ionpáros kölcsönhatások összetartják az α4 és α5 hélixeket. Az R208H/C mutánsok nem képesek ezt a kölcsönhatást kialakítani. (H) A D223 karboxil oldallánca hidrogénkötéseket hoz létre a Q261 és R337 oldalláncával. Az Asn-mutáció megszakítja a hidrogénkötést az R337-gyel. (I) Az R213C mutáció az arginin oldallánc és az A331 és L329 gerincatomjai között kialakuló hidrogénkötéses kölcsönhatások elvesztését eredményezi. (J) Az R337 ionpáros kölcsönhatást létesít a D223-mal és hidrogénkötést az Y339-cel is. Míg a lizin oldallánc megőrzi csökkent képességét az Y339-cel való hidrogénkötés kialakítására, a hisztidinre, ciszteinre vagy alaninra történő mutáció teljesen megszünteti az R337-D223 ionpáros kölcsönhatást. (K) Az Y338 hidroxi-fenil oldallánca hidrogénkötést létesít a D327 és A328 gerincatomjaival. Ezek a kölcsönhatások fenntartják az α7 és β7 térbeli helyzetét. A hisztidinre vagy fenilalaninra történő mutáció ezen kölcsönhatások elvesztését eredményezi, és rugalmasságot vezet be.
Ezeken túlmenően számos mutáció megzavarhatja a HSD11B2 fehérje pakolását, hogy egy terjedelmesebb maradék bevezetésével rontsa a stabilitást. Az A328 maradék hidrofób kölcsönhatást képez a V215, I260, I325 és Y338 maradékkal (4E ábra). Az alanin egy terjedelmesebb Val-maradékkal való helyettesítésével az A328V mutáció sterikus ütközéseket okoz az I260 és Y338 oldalláncával a környező β-lemezekből (4E ábra). Az S180 maradék egy hurokban helyezkedik el, és hidroxilcsoportos oldallánca kölcsönhatásba lép a T184 oldalláncával és gerinc nitrogénjével (4F ábra). Ez az oldallánc egy nagyon szűk térben helyezkedik el, és korlátozza bármely terjedelmesebb maradék befogadását, ami sztérikus ütközéseket okoz, valójában a fehérjeszerkezet megváltoztatása nélkül. Így egy terjedelmes aromás gyűrűvel rendelkező Phe oldallánc, mint az S180F mutációban, nem tolerálható ezen a pozícióban (4F ábra).
A poláris maradékok közötti többszörös hidrogénkötések és sóhidak stabilizálják a HSD11B2 enzim tercier szerkezetét. Bizonyos mutációk ezen kölcsönhatások elvesztését okozzák, ami inaktív enzimet és súlyos AME-t eredményez. Az R208 és E249 közötti sóhíd például kritikus jelentőségű (4G ábra). Ennek elvesztése, mint az R208C és R208H mutációk esetében, destabilizálja a fehérjét, és súlyos betegséget eredményez (4G ábra). Hasonlóképpen, a D223 sóhidat képez az R337-gyel (4H ábra). Ezt a sóhidat egy kevésbé erős kötéssel, hidrogénkötéssel helyettesítve a D223N mutáció a negatív töltésű maradékot egy töltés nélküli poláris maradékra változtatja, ami az in vitro aktivitás jelentős csökkenését eredményezi (22). Ez is arra utal, hogy a sóhíd döntő szerepet játszik a HSD11B2 stabilitásának és aktivitásának fenntartásában. Az R213 oldalláncai hidrogénkötéseket képeznek az A331 és L329 maradékok gerincatomjaival (4I. ábra). Ezen hidrogénkötések csökkentésével, amelyek segítenek fenntartani a fehérje tercier szerkezetét, az R213C mutáció rontja az enzim stabilitását (4I. ábra).
A 335-339-es maradékokból álló Arg/Tyr klaszter korábban szerepet játszott a fehérje stabilitásának fenntartásában, bár a pontos mechanizmus tisztázatlan maradt (23). Ezeket a maradékokat érintő mutációkat jelentettek AME-betegeknél, beleértve az R337C és Y338H mutációkat. A monomer és dimer HSD11B2 modellek szimulációi azt sugallják, hogy az R337 maradék sóhíd kölcsönhatást létesít a D223-mal és hidrogénkötést az Y339 OH-csoportjával (4J ábra). Úgy tűnik, hogy ezek a kölcsönhatások fontosak a fehérje helyes hajtogatásának és stabilitásának fenntartásában. Így a Cys-ra történő mutációja megszünteti mind a sóhidat, mind a hidrogénkötést, ami destabilizálja az enzimet és súlyos AME-t okoz. E maradék genetikailag módosított mutációi továbbá azt mutatják, hogy a polaritást és pozitív töltést fenntartó R337K 70%-kal csökkenti az enzim aktivitását, míg az R337A, amely az R337C-hez hasonlóan töltés nélküli és rövid oldalláncokkal rendelkezik, teljesen inaktiválja a HSD11B2-t (23) (4J ábra). Ugyanebben az Arg/Tyr klaszterben az Y338 His-re történő mutációja inaktiválja az enzimet, és súlyos AME-t okoz. Modellünk szerint ez a Tyr-maradék hidrofób kölcsönhatásokat képez az A328-assal és hidrogénkötéseket a D327-gyel (4K ábra). Mindkét kölcsönhatás segít fenntartani a fehérje stabilitását, így például a Tyr His-szel való helyettesítése inaktiválja a HSD11B2-t. Ennek oka, hogy bár az Y338H megőrzi a hidrogénkötés képességét, rövidebb oldalláncai destabilizálják az enzimet. Hasonlóképpen, a Tyr Phe-vel történő helyettesítése egy mesterséges Y338F konstrukcióban nem tolerálható. Itt a hidrofób kölcsönhatások megmaradnak, de a hidrogénkötés megszűnik (23). Végül, az Arg/Tyr klaszterben lévő R337 és Y338 szintén erősen konzervált számos fajban; így e maradékok bármilyen módosítása valószínűleg nem tolerálható (23).
Egy sor mutációról számoltak be, amelyek az AME enyhébb formáját okozzák, kevésbé súlyos klinikai és biokémiai manifesztációkkal. Az érintett mutáns konstrukciókról kimutatták, hogy in vitro fenntartják a HSD11B2 aktivitását (4, 19, 24), ami összhangban van a kevésbé súlyos klinikai fenotípussal. Szerkezetileg ezek a mutációk vagy közvetve megzavarhatják a szubsztrátkötést (mint például az egyik betegünknél a P227L mutáció), vagy megváltoztathatják a fehérje szerkezetét (mint például az R279C és az R359W mutációk), hogy mérsékeljék, de ne szüntessék meg az enzimaktivitást (5. ábra). Figyelemre méltó, hogy bár a P227 maradék nem olyan pozícióban van, amely közvetlenül kölcsönhatásba lép a szubsztráttal, az Y226 maradékkal szomszédos elhelyezkedése arra utal, hogy szerepe lehet a szubsztrátkötésben (5A. ábra). Valójában ez a maradék alkotja a “csomót” a hurok régiójában, fenntartva az aktív hely konformációját, és az Y226-ot is a megfelelő pozícióban tartja a szubsztráttal való optimális kölcsönhatáshoz. E maradék Leu-ra (P227L) történő mutációja megszakítja a csomópontot és megváltoztatja az Y226 pozícióját (5A ábra).
HSD11B2 mutációk, amelyek enyhe 2-es típusú AME-t okoznak. (A) A P227 csomót képez a hurokban és segít az Y226 helyes pozícionálásában, hogy optimálisan kölcsönhatásba lépjen a szubsztráttal. A hurok rugalmasságának növekedése a P227L mutációban az Y226 helytelen elhelyezkedését eredményezi. (B) Az R279 és az N171 közötti hidrogénkötés egy a sok közül, amelyek a β4 és β6 lapokat összetartják. Az N171 oldalláncát is úgy irányítja, hogy kölcsönhatásba lépjen a NAD+-val. A ciszteinre történő mutáció ezen kölcsönhatások elvesztését eredményezi. (C) Az R359-I350 kölcsönhatások tartják fenn a helix-turn-hélixet. Az R359W mutáció rugalmasságot hoz a régióba.
Két olyan nem konzervatív mutációt azonosítottak 2-es típusú AME-ben szenvedő betegekben, amelyekről úgy gondolták, hogy megbontják a HSD11B2 tercier szerkezetét. Az R279 hidrogénkötést képez az N171 gerincével, ami segít fenntartani és stabilizálni a helyi fehérje környezetét (5B ábra). Az R279 helyettesítése olyan maradékkal, amely nem képez hidrogénkötést, mint az R279C mutáció, a HSD11B2 aktivitásának enyhe mérséklődéséhez, de nem teljes megszűnéséhez vezet (24), ami összhangban van az enyhe klinikai fenotípussal (5B. ábra). Egy másik nem konzervatív mutáció, az R359W az oldallánc tulajdonságait töltöttről hidrofóbra változtatja. Ez megváltoztatja a fehérjeszerkezeten belüli lokális kölcsönhatást, amelyben az R359 pozitív töltésű oldallánca hidrogénkötést képez az I350 gerincoszlop karbonil oxigénjével (5C ábra). E kölcsönhatás elvesztése hozzájárul a fokozott szerkezeti rugalmassághoz, ami az enzimaktivitás csökkenését okozza. Figyelemre méltó, hogy mind az R279C, mind az R359W minimális zavarokat okoz az intramolekuláris kölcsönhatásokban, és a fehérje felszínéhez közel fordul elő.