Abstract
En uræmisk patient udviklede hypercalcæmi efter tuberkuloseinfektion, og hans ioniserede calciumniveauer korrelerede med 1,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25(OH)2D3)-niveauer. Vi udførte yderligere undersøgelser for at bestemme, om monocytter er alternative steder for 1,25(OH)2D3-konvertering ud over nyretubulære celler. Ved hjælp af et ex vivo bioassay fandt vi i denne undersøgelse, at 1-α hydroxylase (CYP27B1) aktivitet i monocytter er signifikant højere hos patienter med aktiv tuberkulose (TB) end hos dem med hyppig TB-kontakt. Når monocytter fra patienter med aktiv TB blev restimuleret med antigen, der stammer fra Mycobacterium tuberculosis, blev der imidlertid observeret mindre 1,25(OH)2D3. I modsætning hertil var niveauet af 1,25(OH)2D3 uændret hos dem med hyppig TB-kontakt. Vi konkluderer, at monocytter kan være en alternativ kilde til 1-α hydroxylase, der kan omdanne 25-hydroxyvitamin D3 til den mere aktive 1,25(OH)2D3.
1. Indledning
Tuberkulose har plaget verden siden forhistorisk tid. Ifølge en nylig rapport bukker en million patienter årligt under for tuberkulose og relaterede comorbiditeter . I de seneste årtier er der blevet gjort en enorm indsats for at forstå sygdommens patofysiologiske proces. Dyremodeller og undersøgelser på mennesker har banet vejen for en afklaring af individuelle immunreaktioner på Mycobacterium tuberculosis (MTB) . Disse undersøgelser beviser, at D-vitamin spiller en vigtig rolle i menneskers modstandsdygtighed over for tuberkulose. D-vitamin er blevet brugt til at bekæmpe tuberkulose i mere end 200 år. Torskeleverolie og calciferol, som er vigtige kilder til D-vitamin, er blevet brugt siden det 17. århundrede til at behandle patienter med tuberkulose . I normal fysiologi blev 7-dehydrocholesterol, der er lagret i huden, efter solskinsudsættelse omdannet til prævitamin D3 efterfulgt af termisk isomerisering til vitamin D3 . Dernæst hydroxyleres vitamin D3 i leveren til 25-hydroxyvitamin D3 (25(OH)D3). Derefter hydroxyleres 25(OH)D3 yderligere til den mest aktive form af vitamin D3, 1,25(OH)2D3, af 1- hydroxylase (CYP27B1) . Nyretubulære epithelceller er en vigtig kilde til 1- hydroxylase og spiller en afgørende rolle i bestemmelsen af koncentrationen af 1,25(OH)2D3 i serum . Tilstedeværelsen af CYP27B1 i extrarenale væv har været anerkendt i årtier . Virkningen af extrarenal CYP27B1 på serumkoncentrationen af 1,25(OH)2D3 er endnu ikke fastlagt.
Vi stødte på en 34-årig patient med uræmi, som havde modtaget regelmæssig hæmodialyse i 2 år. Patienten oplevede muskelsvaghed med træthed i 2 dage, før han opsøgte en familielæge. Blodkemi afslørede forhøjede ioniserede calciumniveauer (5,44 mg/dL). På trods af hypercalcæmien blev patientens symptomer lettet ved konventionel behandling. Fire måneder senere oplevede patienten en progressiv muskelsvaghed ledsaget af feber. På skadestuen blev der igen konstateret forhøjede ioniserede calciumniveauer (6,88 mg/dL). Desuden afslørede et EKG en unormal hjerterytme og et kort QT-interval med udvidet T-bølge. En røntgenundersøgelse af brystet viste en pulmonal infiltration i højre øvre lob, som senere blev konstateret som lungetuberkulose. Patienten modtog derefter 9 måneders antituberkulosebehandling. Fire måneder efter behandlingen blev patientens ioniserede calciumniveau normaliseret (5,2 mg/dL), og symptomerne forsvandt fuldstændigt. For at belyse patogenesen for denne patients hypercalcæmi målte vi 1,25(OH)2D3-niveauerne ud over de ioniserede calciumniveauer. Som vist i figur 1 var niveauerne af 1,25(OH)2D3 stærkt korreleret med niveauerne af ioniseret calcium.
Ændringer i koncentrationerne af ioniseret calcium og 1,25(OH)2D3 i serumet hos en patient med aktiv TB og uræmi.
Ud over renal CYP27B1-ekspression anses makrofager og monocytter for at være vigtige ekstrarenale steder for CYP27B1-ekspression. I denne undersøgelse evaluerede vi monocytternes rolle i metabolismen af vitamin D3 ved hjælp af et ex vivo bioassay. Desuden stimulerede vi monocytter med antigen afledt af MTB for at få yderligere indsigt i, hvordan monocytter modulerer vitamin D3-metabolismen som reaktion på bakteriel udfordring.
2. Materialer og metoder
2.1. Emnepopulation
Denne undersøgelse blev udført på Kaohsiung Medical University. Deltagerne blev stratificeret i to grupper: (1) aktiv TB og (2) hyppig TB-kontakt. De med aktiv lungetuberkulose bekræftet ved en sputumkultur og en brystfilm blev tildelt den aktive TB-gruppe (). Hyppige TB-kontakter () omfattede følgende: (1) medicinsk personale, der havde arbejdet på TB-centret i mindst 10 år og aldrig havde været smittet, og (2) TB-patienters familiemedlemmer, klinikere og sygeplejersker, der havde langvarig kontakt med TB-patienter og aldrig havde været smittet. Alle hyppige tuberkulosekontakter var blevet vaccineret med BCG og gennemgik en årlig røntgenundersøgelse af brystet; når brystfilmene var unormale, blev der foretaget en Mantoux-test. Vi udelukkede personer med diabetes, malignitet eller andre sygdomme, der kunne forårsage immundefekt. De to grupper var matchet med hensyn til køn og alder (tabel 1).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sygdomsvarighed blev defineret som intervallet fra diagnose til blodprøvetagning. Duration af eksponering blev defineret som intervallet fra påbegyndt arbejde i et tuberkulosecenter til blodprøvetagning. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.2. Cellepræparering
Perifere mononukleære blodceller (PBMC’er) blev isoleret fra heparinbehandlet blod indsamlet fra de 2 grupper af donorer ved hjælp af en standard Ficoll-Paque-gradient (Pharmacia, Uppsala, Sverige). PBMC’er ( celler/mL) blev resuspenderet i RPMI 1640-medium suppleret med L-glutamin og 10 % føtal kalveserum. Efter inkubation i 1 time i en 75 cm2 kolbe i et befugtet 37°C, 5% CO2-inkuberingsapparat blev mediet indeholdende ikke-adhærente celler dekanteret i et konisk rør, og kolben blev skyllet to gange med serumfrit medium for at fjerne eventuelle resterende ikke-adhærente celler. Vedhæftende monocytter blev fjernet ved forsigtig skrabning med en plastcelleskraber. Cellerne blev overført til et konisk rør, centrifugeret for at fjerne vaskeopløsningen og resuspenderet til celler/mL i suppleret medium. Den adhærente cellepopulation indeholdt mere end 85 % CD14+ celler.
2.3. Antigen
MTB isoleret fra patienter med tuberkulose blev resuspenderet i fosfatbufferet saltvand og varmedræbt i et vandbad ved 70 °C i 70 minutter. Bakterierne blev derefter soniceret ved hjælp af en New Highway sonicator (Farmingdale, NY, USA). Proteinkoncentrationen af bakteriehomogenatet blev bestemt ved hjælp af Pierce BCA-proteinanalysesættet (IL, USA) og opbevaret ved -20 °C.
2.4. Cytofluorometrisk analyse
Den cytometriske analyse blev udført ved hjælp af et FACS-cytometer (Becton Dickinson). I alt blev cellerne inkuberet med hvert monoklonalt antistof i mættende mængder i 50 μL farvningsbuffer (Hank’s afbalanceret saltopløsning: 1 % BSA og 0,1 % natriumazid) i 1 time ved stuetemperatur og derefter vasket tre gange med PBS. Cellerne blev forberedt til analyse ved suspension i 500 μL af 1 % paraformaldehyd i PBS. Monocytpopulationen blev gated til analyse på grundlag af et side-scatter- og forward-scatter-punktplot. Der blev anvendt i alt 5 000 gated celler til hver analyse. Gated celler blev yderligere analyseret ved fluorescensfarvning ved hjælp af fluorescein-isothiocyanat- (FITC-) konjugeret anti-CD14 (Ancell).
2.5. Kvantificering af 1,25(OH)2D3
Rensede monocytter blev dyrket med en tæthed på celler/mL i 100 μL i hver brønd i en 96-hullers vævskulturplade med 200 nM 25(OH)D3 opløst i en slutkoncentration på 1 % ethanol. Efter 3 timers inkubation blev der tilsat 1 mL acetonitril for at stoppe reaktionen. Cellerne og mediet blev høstet og blandet med et lige stort volumen methanol for at fjerne lipider. Mængden af 1,25(OH)2D3 blev bestemt ved hjælp af 1,25-dihydroxyvitamin D 125I RIA-kittet (INCSTAR, Stillwater, MN, USA). Kort fortalt blev 2 mL vand og 5 mL methanol/vand (70 : 30) tilsat til en C18OH-patron for at fjerne salte, polære lipider og pigmenter under vakuum. Derefter blev der tilsat 5 mL hexan/methylenklorid (90 : 10) til C18OH-patronen for at fjerne 25(OH)D3, og der blev tilsat 5 mL hexan/isopropanol (99 : 1) for at fjerne 24,25(OH)2D3/25,25(OH)2D3. Hver C18OH-patron var tæt monteret i en silica-patron. Efter tilsætning af hexan/isopropanol (92 : 8) under vakuum blev C18OH-patronen fjernet. Endelig blev renset 1,25(OH)2D3 elueret fra silica-kassetten i 5 mL hexan/isopropanol (80 : 20). Niveauerne af 1,25(OH)2D3 blev kvantificeret ved kompetitiv radioimmunoassay (RIA) ved hjælp af 125I-mærkede anti-1,25(OH)2D3- og anti-1,25(OH)2D3-antistoffer.
2.6. Behandling med MTB-antigener
Monocytter ( celler/mL) blev inkuberet med 10 μg/mL MTB og 200 ng/mL 25(OH)D3. Efter 3 timers inkubation blev der tilsat 1 mL acetonitril for at stoppe reaktionen. Det resulterende 1,25(OH)2D3 blev oprenset fra cellerne og mediet og kvantificeret ved RIA. Resten af proceduren var den samme som ved den foregående analyse.
2.7. Statistisk analyse
Alle data blev analyseret ved hjælp af Student’s -test.
3. Resultater
3.1. Ioniseret calcium og 1,25-dihydroxyvitamin D3-koncentrationer hos en patient med aktiv TB og uræmi
Serum ioniseret calcium og 1,25(OH)2D3 blev bestemt på forskellige tidspunkter fra det første besøg til et år efter afslutningen af antituberkulosebehandlingen. Som det fremgår af figur 1, korrelerede niveauerne af ioniseret calcium med koncentrationen af 1,25(OH)2D3 (figur 1).
3.2. Undersøgelsespopulation
Twenty-five personer blev rekrutteret til gruppen med hyppig tuberkulosekontakt og 25 patienter til gruppen med aktiv tuberkulose. Den gennemsnitlige alder og kønsforholdet var ikke signifikant forskelligt mellem grupperne. Datasættets karakteristika er præsenteret i tabel 1.
3.3. 1,25(OH)2D3-kvantificering
Monocytter blev dyrket med 25(OH)D3 i 3 timer. Derefter blev 1,25(OH)2D3 oprenset fra cellerne og mediet og målt med RIA. Som vist i figur 2 var mængden af 1,25(OH)2D3 i den aktive TB-gruppe pg/mL (gennemsnit ± SD), hvilket var signifikant højere end i gruppen med hyppig TB-kontakt () () (). Når monocytter samtidig blev inkuberet med MTB og 25(OH)D3 i 3 timer, faldt mængden af 1,25(OH)2D3 i den aktive TB-gruppe signifikant sammenlignet med den uden MTB ( og , henholdsvis) () (se figur 3) (se figur 3). Der var ingen forskel mellem monocytter med eller uden eksponering for MTB i gruppen med hyppig TB-kontakt ( og , resp.).
Kvantificering af 1,25(OH)2D3 hos patienter med aktiv TB og hyppige TB-kontaktpersoner. RIA-måling af 1,25(OH)2D3 oprenset fra monocytsuspensioner, der er dyrket med 25(OH)D3 i 3 timer. Mængden af 1,25(OH)2D3 i gruppen med aktiv TB var signifikant højere end i gruppen med hyppig TB-kontakt. Hver kolonne repræsenterer gennemsnittet af 1,25(OH)2D3-kvantificering. Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelsen. *.
Kvantificering af 1,25(OH)2D3 hos patienter med aktiv TB og hyppige TB-kontakter med eller uden M. tuberculosis (MTB)-antigen. Monocytter blev pulseret med 25(OH)D3 med eller uden MTB. Mængden af 1,25(OH)2D3 med MTB-eksponering faldt signifikant sammenlignet med mængden uden MTB i den aktive TB-gruppe. Hver kolonne repræsenterer gennemsnittet af 1,25(OH)2D3-kvantificering. Fejlstænger repræsenterer standardafvigelsen. *.
4. Diskussion
Vi observerede, at 1,25(OH)2D3-niveauerne korrelerede med ioniseret calciumniveauerne hos en uræmisk patient med lungetuberkulose. Ved aktiv lungetuberkulose var serumniveauerne af 1,25(OH)2D3 hos denne patient høje, hvilket igen inducerede høje niveauer af ioniseret calcium. Efter behandling faldt både 1,25(OH)2D3- og ioniseret calciumniveauerne. Teoretisk set er den renale CYP27B1-aktivitet triviel hos en uræmisk patient. Der observeres ofte lave serum 1,25(OH)2D3-niveauer hos uræmiske patienter . I overensstemmelse med det, der er observeret hos mennesker, er der også observeret lave 1,25(OH)2D3-niveauer i en anefrisk musemodel . En ekstrarenal kilde til CYP27B1 er imidlertid blevet beskrevet i mere end 6 årtier. Harrell og Fisher var blandt de første til at finde extrarenal syntese af 1,25(OH)2D3 under patologiske forhold . Disse forfattere etablerede en sammenhæng mellem dysreguleret calciumhomeostase og sarkoidose. Det blev senere påvist, at vævsmakrofager var en ekstrarenal kilde til produktion af 1,25(OH)2D3 i disse patientgrupper . Et stigende antal væv blev fundet at udtrykke CYP27B1 af forskellige undersøgelsesgrupper, såsom hudmelanocytter, vævsmakrofager og restceller fra placenta . Overraskende nok er det ikke alle celler, der udtrykker CYP27B1, der besidder enzymatisk aktivitet . For at klarlægge potentialet for cirkulerende monocytter til at bidrage til høje 1,25(OH)2D3-niveauer anvendte vi et ex vivo bioassay med 25(OH)D3 som substrat til at bestemme CYP27B1’s aktivitet. Vores resultater viser, at CYP27B1-aktiviteten i monocytter fra patienter med aktiv TB er betydeligt højere end i monocytter fra personer med hyppig TB-kontakt. Cirkulerende monocytter bidrager til omdannelsen af 25(OH)D3 til det mere aktive 1,25(OH)2D3. Det er interessant, at vitamin D3 traditionelt blev anset for at være en endokrin faktor; 1,25(OH)2D3, der produceres lokalt (i nyretubuli), transporteres med blodet for at påvirke andre væv eller organer, f.eks. knogler. I de seneste årtier er det imidlertid blevet påvist, at D3-vitamin spiller andre roller end endokrine funktioner. Det 1,25(OH)2D3, der produceres af inflammatoriske celler, kan stimulere D-vitaminreceptorekspression i både naboceller og i de inflammatoriske celler selv. Ved at binde sig til D-vitaminreceptoren og retinoidreceptoren kan ligand-receptorkomplekset binde sig til promotorer af mange inflammatoriske gener . På grund af disse virkninger blev D3-vitamin anset for at have både parakrine og autokrine funktioner. I modsætning til D3-vitaminets endokrine funktion som kalciumregulator får dets parakrine og autokrine funktioner inflammatoriske celler til at producere antibakterielle peptider og forstærke autofagiprocessen . Da 1,25(OH)2D3 produceres lokalt og ikke transporteres til målområder for regulering af calciumhomeostase, påvirker produktionen heraf ikke serumkalciumniveauet. Interessant nok fandt vi i denne undersøgelse, at 1,25(OH)2D3 produceret af monocytter var et særtilfælde. Selv om 1,25(OH)2D3 produceret af monocytter kan virke lokalt, bliver disse celler transporteret af blodet til væv i hele kroppen. Det 1,25(OH)2D3, der produceres af monocytter, opfører sig også som en endokrin faktor. Monocytter er muligvis de eneste celler i vores krop, der kan orkestrere de endokrine, parakrine og autokrine funktioner af vitamin D3. Et interessant spørgsmål er, hvad monocytkildens relative bidrag af 1,25(OH)2D3 til det samlede 1,25(OH)2D3-niveau er. Dusso et al. observerede, at den maksimale produktion af 1,25(OH)2D3 fra monocytter er ubetydelig (i fmole/time/mikrogram DNA) sammenlignet med 1,25(OH)2D3-koncentrationen i normale (i pmol/mL) . Men dataene er fra et ex vivo-forsøg, og vi ved ikke, hvor mange monocytter i kroppen der stimuleres til at producere 1,25(OH)2D3. Vi spekulerer på, at det relative bidrag fra monocytkilden af 1,25(OH)2D3 til det samlede 1,25(OH)2D3-niveau er lille under de fleste omstændigheder. Selv hos patienter med granulomatøs sygdom er det kun få af dem, der har kliniske symptomer på hypercalcæmi som følge af et højt niveau af 1,25(OH)2D3. Vores indikatortilfælde er et af dem.
Vi fandt også, at når monocytter fra patienter med aktiv TB dyrkes med MTB-antigen, er 1,25(OH)2D3-konverteringen signifikant lavere, end når der ikke er tilsat antigen. I gruppen med hyppig TB-kontakt var der ingen forskel mellem at være med eller uden MTB-antigen. Der er to mulige forklaringer på denne observation. For det første kan primede monocytter fra patienter med aktiv TB inducere mere 24(OH)hydroxylase (CPY24)-aktivitet end deres modstykker, som aktivt hydroxylerer 1,25(OH)2D3 til calcitronsyre, når de stimuleres yderligere med MTB-antigen. D3-vitamin inducerer ikke kun inflammatoriske genprodukter, men også ekspressionen af CPY24 . CPY24 er et vigtigt katabolisk enzym af vitamin D3. CYP27B1- og CYP24-aktiviteterne moduleres på en diametralt modsatrettet måde for at kontrollere serumniveauerne af 1,25(OH)2D3 . På grund af denne samordnede virkning observeres hypercalcæmi sjældent hos patienterne. Gruppen med hyppig TB-kontakt udviste en endnu bedre samordnet virkning, hvilket er grunden til, at der ikke var nogen ændring i 1,25(OH)2D3-konverteringen efter stimulering med MTB-antigen. En anden forklaring er, at CPY27B1-aktiviteten er udtømt, når monocytter restimuleres med MTB-antigen.
mRNA-ekspression blev ikke bestemt i denne undersøgelse af følgende årsager. For det første var der behov for et stort antal monocytter fra deltagere til ex vivo bioassayet. Hvis vi havde udført både kvantitativ mRNA-ekspression og ex vivo-bioassayet, ville vi have været nødt til at indsamle mere end 30 mL blod fra hver deltager. Indsamlingen af denne mængde blod blev afvist af vores etiske komité. For det andet kan nogle væv, som tidligere nævnt, udtrykke CYP27B1 uden påviselig enzymatisk aktivitet. mRNA-niveauer er ikke altid korreleret med enzymatisk aktivitet. På trods af CYP27B1-ekspression i nogle væv blev der ikke påvist enzymatisk aktivitet. I fremtidige undersøgelser bør niveauerne af CYP27B1 og CYP24 og metabolitterne af vitamin D3, såsom calcitronsyre og 24,25(OH)2D3, kvantificeres for at klarlægge vitamin D3-metabolismen i den patofysiologiske proces ved tuberkulose.
5. Konklusion
Sammenfattende korrelerede calciumniveauerne med 1,25(OH)2D3-niveauerne hos en uræmisk patient, der var inficeret med tuberkulose. Desuden fandt vi, at CYP27B1-aktiviteten i monocytter er højere blandt patienter med aktiv tuberkulose end dem med hyppig tuberkulosekontakt.
Etisk godkendelse
Dette undersøgelsesprojekt blev godkendt af Institutional Review Board of Kaohsiung Medical University Hospital. Godkendelsesnummeret er KMUH-IRB-20130103.
Interessekonflikter
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter i forbindelse med denne artikel.
Autors bidrag
Yi-Ching Tung og Wen-Chan Tsai udførte eksperimenterne og skrev artiklen. Tsan-Teng Ou og Wen-Chan Tsai udformede undersøgelsen og indsamlede prøverne. Alle forfattere læste og godkendte den endelige artikel.