Frontiers in Immunology

Figur 1. Integration af fund af NMDAR1 autoantistoffer (AB) i en forklaringsmodel.

Figur 2. Anbefalinger til den kliniske beslutningsproces.

Bemærk venligst, at der her ses bort fra den nye nomenklatur GluN1 for NMDAR1/NR1 af hensyn til konsistensen med det meste af den respektive gennemgåede litteratur.

NMDA-receptorer i hjerne og periferi

N-methyl-d-aspartatreceptorer (NMDAR) er glutamat-gated ionkanaler, der udtrykkes rigeligt i pattedyrs hjerne (1). De danner heteromerer af NR1-, NR2- og NR3-underenheder, idet NR1 er den eneste obligatoriske partner. NMDAR er afgørende for reguleringen af neuronal/synapsefunktion og udtrykkes også af ikke-neuronale celletyper i hjernen som astrocytter, oligodendrocytter og endotelceller (2-5). Desuden er der rapporteret om perifer ekspression, f.eks. i mave-tarmkanalen eller i immunceller (6).

Anti-NMDAR-encephalitis

Autoantistoffer af immunoglobulin G (IgG)-klassen rettet mod NMDAR1 er oprindeligt blevet forbundet med en tilstand kaldet “anti-NMDAR-encephalitis” (7-10). I 2007 beskrev Dalmau og kolleger for første gang et paraneoplastisk syndrom, baseret på 12 kvinder med æggestoksteratomer, der var bærere af IgG AB mod NMDAR NR1/2-underenhederne. Syndromet bestod på varierende vis af psykose, kognitiv tilbagegang, epileptiske anfald, dyskinesi, nedsat bevidsthed og autonom ustabilitet. Forfatterne rapporterede i mange efterfølgende publikationer, baseret på et stigende antal personer med anti-NMDAR-encephalitis, høje serum- og cerebrospinalvæske (CSF)-titere af NMDAR1-AB af IgG-klassen i denne tilstand samt ofte gunstigt respons på immunosuppressiv behandling (7-10). Som syndrom-pertinent patofysiologisk mekanisme er NMDAR1-AB-induceret fald i NMDAR-medierede strømme, som følge af øget receptorinternalisering og dermed reduceret overfladeekspression, blevet foreslået (11). I flere år er raske personer imidlertid ikke engang blevet undersøgt i et nævneværdigt antal med henblik på NMDAR1-AB-seroprevalens. Ikke desto mindre blev og bliver tilstedeværelsen af NMDAR1-AB af IgG-klassen i serum (ikke kun i CSF) hævdet at være sygdomsspecifik (7-10), hvilket har skabt en vis forvirring i litteraturen og desværre også i klinisk praksis.

Syndromer, der minder om NMDAR1-antagonisme

Da NMDAR-hypofunktion var blevet antaget at være en central mekanisme i skizofreni på grund af induktion af psykotiske symptomer ved antagonister (12, 13), opstod spørgsmålet for flere år siden, om en subpopulation af skizofrene personer kan være tidligere oversete anti-NMDAR-encephalitistilfælde. Hidtil har litteraturen – hovedsagelig baseret på små stikprøver og efter den oprindelige “sygdomsspecifikhedspåstand om NMDAR1-AB af IgG-klassen” – givet uoverensstemmende resultater (14-20). Tilsvarende blev andre patologiske tilstande, der ligeledes minder om NMDAR-antagonisme, f.eks. epilepsi eller demens, undersøgt for tilstedeværelsen af NMDAR1-AB. Der dukkede en strøm af publikationer op – mange af dem er tilfælderapporter – som beskrev forbindelser mellem NMDAR1-AB og en lang række syndromer. Endelig blev det også rapporteret, at NMDAR1-AB af andre immunoglobulin (Ig)-klasser (IgM og IgA) var forbundet med sygdomstilstande (17, 21-23). Et interessant spørgsmål, som indtil nu er forblevet helt åbent, er, om NMDAR1-AB også kan føre til “perifere fænotyper”, når man tager hensyn til ekspressionen af NMDAR i perifere organer og væv (6).

Jævn fordeling af serum NMDAR1-AB på tværs af sundhed og sygdom

Uventet udfordrede nyligt arbejde af os og andre på sammen >5,000 individer “sygdomsspecificitetspåstanden” af enhver NMDAR1-AB ved at påvise aldersafhængig op til >20% NMDAR1-AB seroprevalens, herunder IgM, IgA og IgG, i både raske og syge personer. Interessant nok blev der søgt efter NMDAR1-AB af IgE-klassen, men de blev aldrig påvist (24). Sygdomme, der er undersøgt i disse undersøgelser, omfatter neuropsykiatriske tilstande (skizofreni, affektive lidelser, Parkinsons sygdom, amyotrofisk lateralsklerose, Alzheimers sygdom, slagtilfælde, multipel sklerose og personlighedsforstyrrelser) samt generelle medicinske tilstande, f.eks. diabetes eller hypertension (24-28). Også NMDAR1-AB-titerområdet i serum og fordelingen af Ig-klasser var sammenlignelige på tværs af alle undersøgte sygdomsgrupper såvel som raske personer (24-28). Enhver 40-årig person har en ~10 % og enhver 80-årig person har en ~20 % chance for at udvise NMDAR1-AB seropositivitet (24).

Funktionalitet af NMDAR1-AB

Denne overraskende opdagelse rejste spørgsmålet om, hvorvidt disse AB alle er funktionelle. Da biochip-mosaikker og et cellebaseret assay, den kliniske standardprocedure (HEK293T-celler transficeret med NMDAR1 og sekundær AB mod human IgG, IgM eller IgA; Euroimmun, Lübeck, Tyskland), blev anvendt til alle disse NMDAR1-AB-bestemmelser (se også nedenfor), måtte der udføres yderligere assays for yderligere at konsolidere disse uventede fund ved at bevise AB-funktionalitet. Disse in vitro-assays (alle udført med sera efter ammoniumsulfatudfældning af immunoglobuliner og dialyse) afslørede lignende virkninger af NMDAR1-AB-uafhængigt af Ig-klassen på receptorinternalisering i humane IPSC-afledte neuroner såvel som i primære museneuroner. Ligeledes reducerede NMDAR1-AB af alle Ig-klasser glutamatfremkaldte strømme i NR1-1b/NR2A-udtrykkende Xenopus laevis-oocytter (26, 28, 29). In vivo-undersøgelser på mus og mennesker tyder på sammenlignelige virkninger af serum-NMDAR1-AB af alle Ig-klasser med hensyn til modulering af hjernefunktioner (se flere detaljer nedenfor).

Metoder til AB-detektion – stadig plads til forbedring

Et stadig uafklaret problem, som kræver standardisering, er de mange forskellige metoder, der anvendes til AB-bestemmelse med forskellig specificitet og følsomhed. Med hensyn til NMDAR1-AB (hvor vi har den mest solide egen erfaring) er cellebaserede assays helt sikkert den overlegne metode til påvisning af NMDAR1-AB, da epitoper eksponeres på en naturlig måde, der gør det muligt for AB at påvise dem specifikt. Men selv disse assays er forskellige, idet nogle forfattere anvender transient transficerede levende celler og accepterer deres potentielle variabilitet og problemer med batch-to-batch-variation, mens andre anvender fikserede og permeabiliserede celler, der udtrykker hele NMDAR1-underenheden, hvilket sandsynligvis muliggør en bedre standardisering (Euroimmun). Sidstnævnte test anvendes i øjeblikket i hele verden til at diagnosticere NMDAR1-AB-encephalitis. Baseret på vores egen erfaring med dette assay i forbindelse med funktionalitetsundersøgelser, der udføres parallelt (receptorinternalisering, elektrofysiologi og in vivo-undersøgelser), synes det at være den mest pålidelige metode på nuværende tidspunkt. Det anbefales dog kraftigt at anvende dette assay i kombination med sekundære AB, der er meget specifikke for de forskellige Ig-klasser (anti-human IgG, anti-human IgA og anti-human IgM), da krydsreagerende AB kan føre til forkerte konklusioner vedrørende f.eks. prævalensen af IgG AB. Anvendelse af sektioner af hjerner fra rotter, mus, mennesker eller aber til immunohistokemisk påvisning af specifikke AB kan være en nyttig tilføjelse, der kan give supplerende beviser. Derimod kan den typiske ELISA baseret på peptider ikke anbefales som detektionsmetode for NMDAR1-AB, da der kan opnås mange falsk-positive og/eller falsk-negative resultater på grund af den unaturlige (fjernet fra positionen i cellemembranen) eksponering af epitopen. Disse assays synes kun egnede til opfølgende analyser, f.eks. bestemmelse af AB-titerforløbet ved hjælp af en række prøver fra den samme donor, der tidligere klart er diagnosticeret som seropositiv ved cellebaserede og funktionelle assays.

En afgørende rolle for blod-hjernebarrieren (BBB) for syndromisk relevans

Idet undrede os over, hvorfor så mange serum-NMDAR1-AB-bærere forbliver raske, antog vi, at en kompromitteret BBB kunne være afgørende for deres patofysiologiske betydning. Det er vigtigt, at øget BBB-permeabilitet kan variere regionalt og dermed forklare individuelt varierende symptomatiske konsekvenser (30). Som en dyremodel undersøgte vi ApoE-/- mus med kendt BBB-lækage i sammenligning med wild-type kuldemateriale (31). Intravenøs injektion af rensede Ig-fraktioner fra NMDAR-AB-seropositive (IgM, IgG og IgA) mennesker førte til ændringer i spontan åbenfeltaktivitet og hypersensitiv (psykose-relateret) respons på MK-801 i det åbne felt udelukkende hos ApoE-/- mus (28). Ved at undersøge den rolle, som en kompromitteret BBB efterfølgende også spiller hos mennesker, så vi faktisk mere alvorlige neurologiske symptomer hos NMDAR1-AB-bærere (af enhver Ig-klasse) med en historie med fødselskomplikationer eller neurotraumer, betingelser med sandsynligvis kronisk utæt BBB (28). På samme måde undersøgte vi APOE4-bærere, da APOE4-haplotypen er blevet forbundet med en permeabel BBB (32, 33). Vi fik de første antydninger om, at NMDAR-AB kan forstærke vrangforestillinger om grandiositet og mani hos neuropsykiatrisk syge APOE4-bærere, som derefter med større sandsynlighed får stillet diagnosen skizoaffektiv (29). En modificerende rolle af præeksisterende cirkulerende NMDAR1-AB (igen af alle klasser) blev også set i menneskelig iskæmisk slagtilfælde. Hos patienter med intakt BBB før forekomsten af insulten var NMDAR1-AB beskyttende med hensyn til udviklingen af læsionens størrelse, mens NMDAR1-AB hos APOE4-bærere var forbundet med større insultvolumener (24). Disse resultater understreger, at ikke kun graden, men også varigheden af BBB-dysfunktion, akut versus kronisk, kan spille en central rolle i syndromformning af NMDAR1-AB.

Hjernen som immunoprecipitator af NMDAR1-AB

Cirkulerende NMDAR1-AB af alle Ig-isotyper er midlertidigt nedsat efter slagtilfælde (24). Dette fik os til at opstille den hypotese, at hjernevæv med dets tæt udtrykte NMDAR1 (tilgængeligt efter BBB-nedbrydning) kan fungere som en fælde for cirkulerende NMDAR1-AB (25). Vi behandlede først spørgsmålet om, hvorvidt NMDAR1-AB i serum ville kunne påvises i CSF. Af N = 271 midaldrende personer (diagnosticeret med multipel sklerose eller sygdomskontroller) med CSF-serumpar til rådighed var 26 NMDAR1-AB-seropositive (hvilket er i det forventede interval), men bemærkelsesværdigt nok var kun 1 CSF-positiv. I modsætning hertil var tetanus-AB (som er allestedsnærværende på grund af obligatorisk vaccination, men som ikke binder til hjernevæv) til stede i serum og CSF hos alle forsøgspersoner, med CSF-niveauer højere ved kompromitteret BBB. Oversættelsesforsøg i mus beviste hypotesen om, at hjernen fungerer som “immunoprecipitator”: samtidig injektion af NMDAR1-AB IgG og et ikke-hjernebindende “non-sense-AB” (anti-GFP IgG) resulterede i høj detekterbarhed af førstnævnte kun i hjernen (klart mere udtalt ved BBB-dysfunktion) og sidstnævnte kun i CSF (25). Disse data kan bidrage til at forklare potentielle symptomatiske konsekvenser af serum-AB rettet mod hjerneantigener. Mens lækage af BBB spiller en vigtig rolle og bør vurderes i tilfælde, hvor der er mistanke om patologisk relevans af cirkulerende NMDAR1-AB, kan negative resultater vedrørende AB-titre i CSF ikke automatisk udelukke virkninger på hjernen.

Epitoper genkendt af NMDAR1-AB

Det næste spørgsmål var, om disse tilsyneladende generelt funktionelle NMDAR1-AB ville genkende det samme epitop, og om dette potentielt kunne forklare deres høje seroprevalens. Igen uventet viste epitopkortlægning ved hjælp af syv forskellige NMDAR1-konstruktioner, at NMDAR1-AB-positive sera genkender forskellige epitoper, der er placeret i den ekstracellulære ligandbinding og det N-terminale domæne (NTD) samt i det intracellulære C-terminale og det ekstra store poredomæne. NMDAR1-AB-seropositiviteten var polyklonal/polyspecifik i halvdelen af de undersøgte sera og sandsynligvis mono- eller oligoklonalt/oligospecifikt (hovedsagelig IgG) i den anden halvdel. Generelt set var der ikke noget særligt sygdomsrelateret mønster: NMDAR1-epitoper var sammenlignelige på tværs af sygdomsgrupper (26). Udgivet arbejde om NMDAR1-AB-epitoper har været sparsomt før denne systematiske undersøgelse og havde fokuseret på IgG, der genkender NTD og NTD-G7-domænet (N368/G369), sandsynligvis fordi denne region og Ig-klasse først blev anset for at være patognomonisk for anti-NMDAR-encephalitis (8, 34). Det ser faktisk ud til, at faktorer, der prædisponerer unge kvinder til neuropsykiatriske manifestationer af NMDAR1-associeret autoimmunitet, er forbundet med NTD- eller NTD-G7-epitoper. Den accentuerede rolle af IgG i denne sammenhæng er stadig et spørgsmål om spekulation, men er sandsynligvis relateret til inflammationsinduceret klasseskift i hjernen (36).

Prædisponerende faktorer til at bære eller forstærke NMDAR1-AB

På baggrund af disse in vitro- og in vivo-fund må vi antage, at stort set alle naturligt forekommende NMDAR1-AB har patogent potentiale uanset epitop og Ig-klasse. Dette betyder imidlertid ikke, at typen af Ig-klasse ikke kan igangsætte forskellige kaskader af sekundære hændelser og derved yderligere forme det endelige vævsrespons. Men nu opstår der endnu flere spørgsmål: Hvordan kan vi forklare den sygdomsuafhængige høje seroprevalens af NMDAR1-AB, der stiger med alderen? Kender vi til nogen prædisponerende faktorer, og hvis ja, hvordan kan vi så integrere deres rolle i det samlede billede? NMDAR1-AB blev oprindeligt forbundet med onkologiske tilstande (teratomer) (7). Senere blev der set en disposition til at bære disse AB ved seropositivitet for influenza A og B, et resultat, der blev gentaget i en uafhængig prøve (25, 28). Der blev også fundet en genomdækkende signifikant genetisk markør, rs524991, som endda er relateret til NMDAR-biologi, forbundet med NMDAR1-AB (28). Hvorvidt en utæt BBB, der forårsager øget eksponering af central NMDAR1 for celler i immunsystemet, kan fremkalde dannelse af NMDAR1-AB og/eller styrke allerede eksisterende specifikke B-cellekloner, er i øjeblikket uklart og skal undersøges systematisk. En anden attraktiv idé, som endnu ikke er blevet undersøgt inden for NMDAR1-AB-feltet, er den potentielle modulerende indflydelse af mikrobiomet på boosting af NMDAR1-AB (37).

Andre hjerneantigen-dirigeret AB

Hvorfor ser vi NMDAR1-AB så rigeligt i sundhed og sygdom? Gælder dette også for andre AB rettet mod hjerneantigener? For at besvare disse spørgsmål undersøgte vi analogt 24 andre hjerneantigen-orienterede serum-AB’er, som tidligere var forbundet med patologiske tilstande. Igen til en vis overraskelse viste dette arbejde en sammenlignelig hyppighed, titre og Ig-klassefordeling hos raske og syge personer. Seroprevalensen for alle disse 24 AB var imidlertid betydeligt lavere (<2%) i modsætning til NMDAR1-AB (op til >20%) (27). Påfaldende nok var den fremherskende Ig-klasse heller ikke afhængig af sundheds- eller sygdomstilstand, men af antigenplacering, idet intracellulære epitoper prædisponerede for IgG (27). Den lige fordeling af disse 24 andre AB’er i sundhed og sygdom er mindre overraskende, når man tager i betragtning, at der er rapporteret om flere hjernedirekte AB’er i serum fra raske mennesker og fra forskellige andre pattedyrarter (38, 39) samt rigeligt i CSF fra encephalitistilfælde (40), selv om de respektive hjerneantigener ikke var specificeret. Sammenfattende synes hjerneantigenrettet AB i almindelighed og NMDAR1-AB i særdeleshed at være en del af et allerede eksisterende autoimmunrepertoire (37, 41-44), der får (patho)fysiologisk betydning under forhold med intratekal syntese eller kompromitteret BBB, f.eks. ved skade, infektion, hjernebetændelse eller genetisk prædisponering for lækage af BBB (APOE4 haplotype).

Konklusioner og anbefalinger

Alle naturligt forekommende serum NMDAR1-AB har tydeligvis patogent potentiale. Af endnu vidt uudforskede årsager er de meget hyppige (mere end andre hidtil identificerede hjernestyrede AB), og deres prævalens stiger klart med alderen. NMDAR-AB-seropositivitet alene berettiger bestemt ikke til immunosuppressiv behandling. Den syndromale relevans af serum-NMDAR1-AB afhænger af adgangen til hjernen, dvs. BBB-permeabilitet. Desuden spiller hjerneinflammation sandsynligvis en afgørende rolle for syndromets akuthed og sværhedsgrad som bidraget fra cirkulerende NMDAR1-AB og endnu mere udtalt af de respektive plasmaceller, der befinder sig i eller potentielt migrerer til hjernen under inflammatoriske forhold for at producere AB intratekalt (40). I det inflammatoriske miljø forstærkes de ved eksponering for epitopen og oplever et klasseskift til IgG (36). Fund hos personer med herpes-encephalitis kan yderligere understøtte dette synspunkt (22, 45).

En hvilken som helst underliggende encephalitis, hvad enten den er infektiøs, læsionsinduceret, genetisk eller “idiopatisk”, kan undergå en fremtrædende syndromformning ved tilstedeværelsen af NMDAR1-AB i form af “Dalmau-encephalitis” (7-10), som så kræver immunosuppressiv behandling oven i den kausale encephalitisbehandling (hvis den er tilgængelig). Det er endnu ikke afgjort, om intratekalt produceret NMDAR1-AB alene, uden nogen underliggende forudgående inflammation, kan forårsage “Dalmau-encephalitis”. I alle tilfælde, hvor der ellers er mistanke om symptomatiske følger af serum-AB rettet mod hjerneantigener i mangel af åbenlys encephalitis, bør der foretages en vurdering af BBB’s utæthed. Da albuminkvotienten (der anvendes som klinisk tilnærmelse til at diagnosticere nedbrydning af BBB) snarere indikerer forstyrrelser i blod-CSF-barrieren og måske ikke altid er patologisk i milde tilfælde af BBB-lækage (46-48), kan yderligere bestemmelse af BBB-forstyrrelser (globale eller lokale) ved hjælp af en ny metode til magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) (47), der kan etableres som supplement til rutinemæssig kontrastforstærket MRI, vise sig at være nyttig til at vurdere nødvendigheden og fordelene ved især udvidede immunosuppressive terapeutiske interventioner.

Author Contributions

Forfatteren bekræfter at være den eneste bidragyder til dette arbejde og har godkendt det til offentliggørelse.

Interessekonflikterklæring

Forfatteren erklærer, at forskningen blev udført uden kommercielle eller økonomiske forbindelser, der kunne opfattes som en potentiel interessekonflikt.

Funding

Dette arbejde blev støttet af Max Planck Society, Max Planck Förderstiftung, DFG (CNMPB), EXTRABRAIN EU-FP7, og Niedersachsen-Research Network on Neuroinfectiology (N-RENNT).