Tetramisole (Sigma T1512, une solution mère de 10 mg/mL dans H2O diluée à environ 100 μg/mL dans les sels d’œufs) l’ajout est facultatif ; ce médicament paralyse les vers et facilite la coupe. Coupez immédiatement : s’ils sont trop contractés, les vers ne libéreront pas beaucoup d’œufs. Utilisez une nouvelle lame de scalpel chaque jour, car elles se corrodent rapidement. Un excès de tétramisole entraînera la formation d’un précipité dans la solution de NaOCl.
Pour un rendement maximal, on peut libérer plus d’œufs en traitant les vers coupés pendant environ 1 min avec un volume égal de la solution de NaOCl ajoutée directement à la goutte de coupe. Dès que les œufs sont libérés, ajoutez le même volume d’EGM que le NaOCl utilisé pour éviter d’autres dommages aux œufs. Ce traitement tuera les stades pronucléaires et endommagera les embryons unicellulaires. Le traitement au NaOCl pendant 3 minutes est toujours nécessaire avant le traitement à la chitinase pour une digestion uniforme. Pour les œufs plus jeunes que le stade deux cellules, dont la coquille est encore un peu perméable, ajoutez un volume égal d’EGM dès que les vers sont coupés. Après cela, beaucoup peuvent survivre au traitement de 3 minutes au NaOCl et à la chitinase, et certains seront encore au stade d’une cellule après le traitement à la chitinase et le retrait de l’enveloppe vitelline si vous travaillez rapidement.
Des pipettes de transfert satisfaisantes sont fabriquées à partir de capillaires SMI micropipettor de 5 à 30-μL (Fisher 21-380-9C) ou de capillaires World Precision Instruments de 4 pouces (1B100F-4), par double traction au-dessus d’une très petite flamme. Pour ce faire, il faut d’abord chauffer et tirer doucement pour obtenir une section centrale fine, puis refroidir brièvement, et enfin réchauffer plus doucement tout en maintenant le capillaire sous tension pour la traction finale. La traction idéale permet d’obtenir une pipette avec une tige distincte et une section étroite et progressivement effilée d’environ 1,5 cm. Un petit brûleur à gaz peut être fabriqué en montant une grande aiguille de seringue dans un bouchon de liège, avec un collier à vis sur le tube pour régler le débit de gaz. On peut également fabriquer des pipettes de taille constante en les tirant sur un extracteur automatique. Avant utilisation, brisez le capillaire jusqu’à l’extrémité souhaitée, environ 100-150 μm (trois ou quatre fois le diamètre de l’œuf) en le pinçant entre l’ongle du pouce et le bout du doigt ou en utilisant une lame de rasoir sous un microscope à dissection. Un microscope Microforge peut aider à réaliser des pipettes cohérentes, bien qu’il ne soit pas nécessaire. Gardez le diamètre de la pipette petit pour minimiser le transfert de liquide. Si des œufs collent à l’intérieur de la pipette, vous pouvez en récupérer un grand nombre en les rinçant avec la solution de NaOCl ou l’EGM au fur et à mesure. Attendez-vous à changer fréquemment de pipettes, et faites-en tirer un bon stock avant une session de travail.
Si la digestion par chitinase ne fonctionne pas dans les 8 min, elle ne fonctionnera probablement pas du tout. Les problèmes les plus courants sont l’hypochlorite ou l’état physiologique des vers (la ponte du premier jour semble donner des œufs plus durs). L’hypochlorite doit être un lot non périmé, et il devient généralement mauvais un mois environ avant la date de péremption. Conservez le stock au réfrigérateur dans une bouteille sombre et ventilée, remplie jusqu’à la limite supérieure. Mélangez un tube de 3 ml juste avant de commencer et gardez-le sur la glace ; il fonctionnera pendant environ 3 h et devra ensuite être remplacé.
Après le traitement enzymatique et surtout après la perméabilisation, les embryons sont assez collants et s’agglutinent ; cela peut être minimisé en pipettant un ou seulement quelques-uns à la fois. Les petits amas peuvent être brisés en expulsant de la pipette avec un peu de force à plusieurs reprises.
Les pipettes de perméabilisation sont tirées à la main de la même manière que les pipettes de transfert, en utilisant des capillaires d’injection Kwik-fil (1B100F-4 de World Precision Instruments). Le fil intérieur peut aider à couper l’enveloppe vitelline. Le tirage idéal donne un long cône graduel dans la section fine afin qu’elle puisse être coupée au diamètre désiré. Les pipettes sont coupées avec une lame de scalpel fraîche sur du Parafilm sous le microscope de dissection. Un adaptateur pour la pipette buccale peut être fabriqué avec un tube Tygon de petit calibre enfilé sur une aiguille de seringue fixée à un tube buccal. Remplissez l’embout de la pipette avec de l’EGM jusqu’à l’alésage le plus large et testez sur le premier lot d’embryons chitinisés ; recoupez l’embout de la pipette s’il est trop petit. La taille idéale varie en fonction de l’âge de l’embryon que vous essayez d’obtenir ; les stades très précoces sont plus fragiles et nécessitent un alésage légèrement plus large ; les embryons de plus de huit cellules se compriment avec moins de dommages et sortiront souvent des pipettes plus grandes avec l’enveloppe vitelline intacte. De tels embryons non perméabilisés continueront à se développer jusqu’au stade de l’éclosion.
Utiliser une seringue sur la pipette à bouche pour remplir et nettoyer les pipettes de perméabilisation ; la perméabilisation proprement dite se fait par la pression d’air de la bouche. Les pipettes peuvent rester à l’air pendant plusieurs heures sans se dessécher, car l’alésage est si petit, mais en séchant, elles finiront par se boucher. Conservez les pipettes (une bonne pipette vaut la peine d’être gardée et durera plusieurs semaines) en rinçant l’embout plusieurs fois avec de l’eau distillée et en suspendant l’embout de la pipette dans un tube d’eau distillée stérile ou de HCl 0,1 M, en utilisant un « drapeau » en ruban adhésif sur la pipette pour qu’elle ne s’enfonce pas complètement.
Si la pipette est bonne, il ne faut que quelques minutes pour perméabiliser un lot d’embryons en les aspirant individuellement dans la pipette et en les expulsant doucement. Ils sortiront plus ou moins comprimés selon le diamètre intérieur de la pipette, mais s’arrondiront à nouveau en quelques minutes. S’il y a beaucoup de lyse avec la perméabilisation, soit la digestion était incomplète, soit le trou de la pipette était trop petit. Comme les membranes cellulaires sont assez labiles pendant 4-5 minutes après le début de la cytokinèse, les embryons dévitellinés pendant et juste après le clivage peuvent se lyser ou les blastomères peuvent fusionner, subissant ensuite un clivage tétrapolaire anormal. Si c’est critique, vérifier pendant une expérience et éliminer de tels embryons.
Un cil très fin (un outil traditionnel de microscopie électronique) monté sur un cure-dent avec de la colle est l’outil le plus satisfaisant pour une séparation manuelle rapide des blastomères ; une aiguille en verre fonctionne également, mais se casse facilement. Les cils peuvent être nettoyés avec de l’alcool et un tissu. Les blastomères se lysent s’ils sont séparés juste après une division ; 5-10 min après le clivage est le meilleur moment pour des manipulations réussies, à moins que vous ayez besoin de séparations plus précoces. Les séparations AB/P1 sont les plus faciles. Les embryons à quatre cellules peuvent également être séparés. Alternativement, pour obtenir des blastomères P2 et EMS, P1 peut être séparé après la première division et EMS/P2 après la seconde. Les blastomères de la lignée P peuvent être reconnus par leur taille relative et leur disposition linéaire. Avec un faible rendement, MS, E, P3 et C peuvent être séparés des quatre descendants d’un blastomère P1 initial isolé. Les identifications cellulaires faites sur la base de la taille des cellules peuvent être confirmées en examinant les périodes distinctes du cycle cellulaire.