Abstract
Une bibliothèque de six nouvelles phénylhydrazones a été synthétisée et évaluée pour leur activité antimicrobienne et modulatrice de la résistance in vitro contre un panel d’espèces Gram-positives, Gram-négatives et fongiques. Les composés ont été produits avec de bons rendements de 60 à 92 % p/p et caractérisés par des techniques de point de fusion, de spectroscopie UV-visible, d’infrarouge et de résonance magnétique nucléaire (1H, 13C et DEPT-Q). La spectroscopie de masse a été utilisée pour confirmer l’identité de l’un des composés les plus actifs, le 5 . Les phénylhydrazones ont montré une activité contre les six microorganismes sélectionnés avec des valeurs de concentration minimale inhibitrice (CMI) des composés les plus actifs, 1 et 5, de 138 µM (Klebsiella pneumoniae) et 165 µM (Streptococcus pneumoniae), respectivement. Le composé 1 a en outre démontré une activité modulatrice de résistance élevée à 1,078 µM contre Streptococcus pneumoniae et Klebsiella pneumoniae.
1. Introduction
Le monde au cours des dernières décennies est à court d’antibiotiques efficaces en raison de la prévalence accrue des organismes multirésistants . Cela a conduit à une augmentation des infections résistantes exigeant des scientifiques d’explorer sans relâche la possibilité de synthétiser des analogues de composés actifs ou de plomb comme de nouveaux antimicrobiens pour freiner ces infections et les maladies qui en résultent. Au fil des siècles, les maladies infectieuses sont devenues une menace majeure pour l’existence de l’humanité, car elles continuent d’avoir un impact négatif important sur la société. Les agents pathogènes tels que les bactéries, les virus, les champignons et les parasites continuent d’apparaître et sont en recrudescence, surtout au XXIe siècle, malgré plusieurs tentatives pour les enrayer. Les maladies infectieuses sont responsables de la mort d’environ 17 millions de personnes par an, avec l’émergence d’au moins trente nouvelles maladies. Le monde lutte actuellement contre la pandémie COVID-19 causée par le corona virus qui a déjà fait plus de 25 000 morts dans le monde en trois mois (OMS, 2020). Ces maladies menacent la santé de millions de personnes d’autant plus qu’il n’existe aucun remède ou vaccin. La tendance à l’augmentation des infections microbiennes est en grande partie due à l’éternelle question de la résistance aux antimicrobiens, qui est de plus en plus fréquente. Les principales causes de la résistance aux antimicrobiens comprennent la chimiothérapie prolongée et le non-respect du régime posologique. La résistance croissante aux antibiotiques a conduit à la tendance croissante des agents pathogènes comme le Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (MRSA), le Mycobacterium tuberculosis multirésistant (MDR-TB) et l’Escherichia coli multirésistant (MDR-Escherichia coli). En outre, les agents pathogènes ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa et Enterobacter species) sont les plus préoccupants dans le traitement des infections nosocomiales. Leur présence dans les infections a été une situation inquiétante dans le secteur de la santé, car la plupart d’entre elles sont résistantes à de nombreux antibiotiques, et la compréhension du mécanisme de résistance de ces souches est utile pour le développement de nouveaux agents antimicrobiens .
L’Organisation mondiale de la santé a clairement indiqué que la tendance à l’augmentation des maladies infectieuses se poursuivrait en raison d’un certain nombre de facteurs, notamment l’exode rural, l’augmentation de la population mondiale, l’adaptation microbienne et le changement climatique . Ces facteurs favoriseraient l’émergence et la propagation des agents pathogènes, de sorte que les parties prenantes, y compris les chimistes médicinaux, sont continuellement invitées à concevoir des stratégies pour découvrir de nouveaux agents chimiothérapeutiques afin de surmonter la menace de la résistance aux antimicrobiens. L’activité modulatrice de résistance d’un composé est la capacité du composé à avoir une influence de contrôle sur les normes déjà connues, surtout de manière positive. En raison de la résistance croissante des micro-organismes aux antibiotiques, des agents provenant de sources naturelles ou synthétiques semblent moduler l’activité de certains agents antimicrobiens standard tels que l’amoxicilline (a), la ciprofloxacine (b) et le fluconazole (c) (Figure 1).
(a)
(b)
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Les activités modulatrices de résistance des produits (naturels et synthétiques) sur les antibiotiques standards ont gagné en intérêt scientifique ces dernières années. Cela vise à maximiser la puissance antimicrobienne avec des avancées majeures dans la réduction de la résistance microbienne et donc conduire à la découverte de médicaments potentiels. Les hydrazones constituent une classe importante de ces agents synthétiques ayant un effet prometteur sur la modulation de la résistance. Les hydrazones et leurs analogues possèdent la fonctionnalité azométhine, un groupe important de composés ayant un large spectre d’activités biologiques. Les hydrazones ont été choisies en raison de leur large éventail d’activités pharmacologiques telles que les activités anticonvulsivantes, anti-inflammatoires, antimicrobiennes, antiprotozoaires et anticancéreuses. Elles jouent un rôle crucial non seulement en biologie mais aussi dans les domaines de la photochimie, de la chimie analytique et de la chimie inorganique. Les hydrazones sont liées aux cétones et aux aldéhydes par la substitution de l’oxygène par une fraction fonctionnelle -NNH2. Grâce à des protocoles de synthèse variés et à des études détaillées sur la relation structure-activité (SAR), différents dérivés d’hydrazone ont été développés et découverts comme étant pharmacologiquement actifs sur diverses cibles. Certains dérivés d’hydrazone d’isonicotinoyl se sont avérés posséder une activité antituberculeuse. De plus, le dérivé hydrazone de l’acide benzoïque -hydrazide de l’acide 4-hydroxybenzoïque (nifuroxazide) s’est révélé actif contre les vers intestinaux, et le dérivé -hydrazide de l’acide 4-fluorobenzoïque a montré une activité antibactérienne contre Staphylococcus aureus ATCC 29213 à 3,13 μg/mL et la souche sensible Mycobacterium tuberculosis H37RV également à 3,13 μg/mL . Des hydrazones récemment synthétisées, dont le nifuroxazide, se sont révélées actives contre la souche H37RV de Mycobacterium tuberculosis à une concentration minimale inhibitrice comprise entre 0,78 et 6,25 μg/ml. Un nouvel agent, la 3, 5-dibenzoylvanilline hydrazone, et des complexes de métaux de transition se sont avérés présenter une activité antibactérienne impressionnante .
Donc dans cette étude, six nouveaux dérivés de phénylhydrazone ont été synthétisés avec succès par une réaction de condensation nucléophile, avec leurs activités antimicrobiennes et leurs effets de modulation de la résistance étudiés.
2. Matériaux et méthodes
2.1. Synthèse : Matériaux et méthodes généraux
Un ballon à fond rond (100 mL) équipé d’une barre d’agitation magnétique a été chargé avec de la 2,4-dinitrophénylhydrazine (1 éq.) dans du méthanol (10 mL) maintenu dans un bain de glace. La suspension résultante a été agitée et refroidie à 0°C avant d’ajouter goutte à goutte du H2SO4 concentré (98% v/v, 2 mL), ce qui a donné une solution jaune pâle. Après refroidissement à température ambiante, un dérivé d’aldéhyde ou de cétone (1,04 éq.) dans du méthanol (5 mL) a été ajouté et le mélange a été agité jusqu’à ce qu’il y ait une formation progressive de précipité qui a été laissé pendant 24 heures. L’évolution des réactions chimiques a été suivie par chromatographie sur couche mince (CCM) de façon intermittente en utilisant des plaques d’aluminium recouvertes de gel de silice (60 GF254). Les plaques ont été visualisées sous lumière UV à 254 nm et 366 nm, ce qui a été suivi par une pulvérisation d’anisaldéhyde pour la confirmation de l’identité des points. Le produit brut a été filtré par aspiration et recristallisé dans de l’éthanol absolu chaud (96 % v/v). Le produit solide a été obtenu par filtration par aspiration, séché et stocké à température ambiante.
Les structures des composés synthétisés ont été établies par la détermination du point de fusion, la spectroscopie de masse, la RMN 1D (proton et carbone-13) et la spectroscopie RMN 2D (DEPT-Q) avec l’appui des techniques de spectroscopie infrarouge (IR) et ultraviolet-visible (UV-Vis) .
2.1.1. 1-(2,4-Dinitrophényl)-2-(diphénylméthylène) Hydrazine
2, 4-Dinitrophénylhydrazine (0,50 g, 2,74 mmol, 1 éq.) en présence de benzophénone (0,53 g, 1,04 éq., 2,64 mmol) a donné le produit brut qui a été purifié par recristallisation à partir d’éthanol chaud pour obtenir le produit (0,84 g, 85%) comme un solide orange clair. (Pet. ether 70% : EtOAc 30%) : 0.90. Mpt : 141-143°C ; UV-V est (MeOH) : 382 nm. Infrarouge (pur) υmax cm-1 : 3382 (OH), 3286 (NH), 1586 (C = CH), 848, 614 (ArH). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) : 11,24 (1H, H-C1, s, NH), 9,09-9,10 (1H, H-C3, s, ArH), 8,41 (1H, H-C5, d, J = 2,4, ArH), 8,37-8,38 (1H, H-C6, m, ArH), 7.66-7,72 (5H, H-C4′, H-C5′, H-C6′, H-C5′, H-C3′, m, ArH), 7,35 (3H, H-C6″, H-C5″, H-C4″, m, ArH), 7,57 (2H, H-C5′, H-C3′, m, ArH) ppm. RMN 13C (400 MHz ; CDCl3) 155,7, 145,1, 136,5, 131,9, 130,5, 130,4, 130,1, 129,9, 128,6, 128,2, 127,9, 123,4, 116,6 ppm.
2.1.2. 1-Benzylidène-2-(2,4-dinitrophényl) Hydrazine
2, 4-Dinitrophénylhydrazine (0,90 g, 4,53 mmol, 1 éq.) en présence de benzaldéhyde (0,50 g, 1,04 éq., 4,71 mmol) a donné le produit brut qui a été purifié par recristallisation à partir d’éthanol chaud pour obtenir le produit (1,01 g, 78%) sous forme de solide jaune. (Pet. ether 70% : EtOAc 30%) : 0.83. Mpt : 178-180°C ; UV-V est (MeOH) : 224 nm et 378 nm. Infrarouge (pur) υmax cm-1 : 3337 (OH), 3283 (NH), 3100 (C = CH), 1618, 1584 (ArC = C). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11,24 (1H, H-C1, s, NH), 9,09 (1H, H-C3, s, ArH), 8,30-8,31 (1H, H-C1′, s, N = CH), 8,05 (1H, H-C5, m, ArH), 8.02 (1H, H-C6, m, ArH), 7,41-7,69 (2H, H-C2′, H-C6′, m, ArH), 7,40 (1H, H-C4′, m, ArH), 7,39 (2H, H-C3′, H-C5′, m, ArH). RMN 13C (400 MHz, CDCl3) 147,9, 145,8, 144,9, 144,7, 131,0, 130,0, 129,0, 127,6, 123,5, 116,8 ppm.
2.1.3. 3-(2-2-(4-Dinitrophényl) Hydrazono) Méthylphénol
2, 4-Dinitrophénylhydrazine (0,78 g, 3,93 mmol, 1 éq.) en présence de m-hydroxybenzaldéhyde (0,50 g, 1,04 éq, 4,09 mmol) a donné le produit brut qui a été purifié par recristallisation dans de l’éthanol chaud pour obtenir le produit (0,76 g, 64%) sous forme de solide rouge foncé. (Pet. Ether 70% : EtOAc 30%) : 0.74. Mpt : 277-280°C. UV-Vis (MeOH) : 392 nm. Infrarouge (pur) υmax cm-1 : 3420 (OH), 3257 (NH), 3116 (C = CH), 1607, 1584 (ArC = C). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11,56 (1H, H-C1, s, NH), 10,04 (1H, H-C2′, s, ArOH), 8,88 (1H, H-C3, s, ArH), 8,86 (1H, H-C7, s, N = CH), 8,35-8,37 (1H H-C5, d, J = 8.0, ArH), 8,08-8,34 (1H, H-C6), d, J = 12,0, ArH), 8,05 (1H, H-C5′, m, ArH), 7,66 (1H, H-C1′, s, ArH), 7,14 (1H, H-C4′, m, ArH), 6,87-6,89 (1H (H-C3′, m, ArH). RMN 13C (400 MHz, CDCl3) 160,5, 150,5, 144,9, 137,1, 130,2, 129,8, 129,5, 125,2, 123,6, 117,1, 116,4 ppm.
2.1.4. 4-(2-(2,4-Dinitrophényl) Hydrazono) Methyl)-2-méthoxyphénol
2, 4-Dinitrophénylhydrazine (0,78 g, 3,93 mmol, 1 éq.) en présence de 4-hydroxy-3-méthoxybenzaldéhyde (vanilline) (0,50 g, 1,04 éq, 4,09 mmol) a donné le produit brut qui a été purifié par recristallisation dans de l’éthanol chaud pour obtenir le produit (0,91 g, 70%) sous forme de solide rouge vif. (Pet. ether 70% : EtOAc 30%) : 0.66. Mpt : 270-273°C. UV-Vis (MeOH) : 218 nm et 394 nm. Infrarouge (pur) υmax cm-1 : 3363 (OH), 3274 (NH), 3111 (C = CH), 1605 (ArC = C), 699 (ArH). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11,58 (1H, s, NH), 10,11 (1H, H-C4′, s, ArOH), 9,94 (1H, H-C3, s, ArH), 8,87 (1H, H-C5, s, ArH), 8,86 (1H, H-C7, s, N = CH), 8,35 (1H, H-C6, d, J = 4.0, ArH), 7.97 (1H, H-C2′, d, J = 4.0, ArH), 7.66-7.76 (1H, H-C6′, d, J = 8.0, ArH), 6.38-6.35 (1H, H-C5′, d, J = 12.0, ArH), (3H, H-C4′, Ar-OCH3). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 150,7, 150,2, 148,6, 144,9, 137,1, 130,2, 125,6, 123,6, 123,1, 117,2, 116,1, 110,3, 56,2 ppm.
2.1.5. (Z)-2-(2, 4-Dinitrophényl) Hydrazono) Méthyl Phénol
2, 4-Dinitrophénylhydrazine (0,78 g, 3,93 mmol, 1 éq.) en présence de salicylaldéhyde (0,50 g, 4,09 mmol, 1,04 éq.) a donné le produit brut qui a été purifié par recristallisation à partir d’éthanol chaud pour obtenir le produit (1,09 g, 92%) sous forme de solide orange vif. (Pet. ether 70% : EtOAc 30%) : 0.84. Mpt : 176-180°C ; UV-Vis (MeOH) : 386 nm. Infrarouge (pur) υmax (cm-1) : 3334 (OH), 3267 (NH), 3059 (C = CH), 1583 (ArC = C), 759 (ArH) 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11,25 (1H, H-C3′, s, ArOH), 9,98 (1H (C1), s, NH), 9,11 (1H H-C3, s, ArH), 8,34-8.36 (1H, H-C1′, s, N = CH), 8.33 (1H, H-C5, d, J = 4.0, ArH), 7.61-7.58 (1H, H-C6, d, J = 4.0, ArH), 7.31 (1H, H-C6′, m, ArH), 7,25 (1H, H-C4′, m, ArH), 7,24 (1H, H-C7, m, ArH), 6,95 (1H, H-C5′, m, ArH) ppm. 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 157,9, 151,3, 132,9, 131,4, 130,6, 123,7, 120,3, 117,2, 116,9, 115,3 ppm. HRMS (ESI) : m/z calculé pour + C13H10N4O5 : 302.2400, trouvé : 301.0000.
2.1.6. 4-(2-(2, 4-Dinitrophenylhydrazono) Methyl) Benzène-1, 3-diol
2, 4-Dinitrophenylhydrazine (0,69 g, 3,48 mmol, 1 éq.) en présence de 2, 4-dihydroxy benzaldéhyde (0,50 g, 1,04 éq, 3,62 mmol) a donné le produit brut qui a été purifié par recristallisation dans de l’éthanol chaud pour obtenir le produit (0,66 g, 2,07 mmol, 60%) sous forme de solide rouge foncé. (Pet. ether 70% : EtOAc 30%) : 0.51. Mpt : 270-274°C ; UV-Vis (MeOH) : 403 nm. Infrarouge (pur) υmax (cm-1) : 3364 (OH), 3094 (C = CH), 1612, 1584 (ArC = C) 592 (ArH). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 11,58 (1H, H-C3′, s, ArOH), 10,11 (1H, H-C1, s, NH), 9,94 (1H, H-C5′, s, ArOH), 8,87 (1H, H-C3, s, ArH), 8,86 (1H, s, N = CH), 8.33 (1H, H-C4′, s, ArH), 8.36 (1H, H-C5, d, J = 12.0, ArH), 7.95-7.97 (1H, H-C6, d, J = 8.0, ArH), 7.54 (1H, H-C7, m, ArH), 6.38 (1H, H-C6′, d, J = 8.0, ArH) ppm. 13C NMR (400 MHz, DMSO-d6) 161,8, 159,1, 148,2, 144,6, 136,7, 130,1, 129,3, 128,8, 123,6, 116,9, 112,0, 108,7, 102,1 ppm.
2.2. Évaluation antimicrobienne des composés
2.2.1. Source des organismes à tester
Des cultures pures de Staphylococcus aureus (SA) (ATCC 25923), Escherichia coli (EC) (ATCC 25922) et Pseudomonas aeruginosa (PA) (ATCC 27853) ont été obtenues auprès de la division de microbiologie du département de pharmacie, de la faculté de pharmacie et des sciences pharmaceutiques, de l’université des sciences et technologies Kwame Nkrumah (KNUST), à Kumasi. Cependant, Klebsiella pneumoniae (KP), Candida albicans (CA) et Streptococcus pneumoniae (SP) étaient des souches cliniques obtenues auprès de l’hôpital universitaire Komfo Anokye, Kumasi, et cultivées dans le département de pharmacie, KNUST.
2.2.2. Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI)
La méthode de dilution des microbilles a été employée pour déterminer les concentrations minimales inhibitrices (CMI) des dérivés de l’hydrazone et des médicaments de référence, la ciprofloxacine et le fluconazole. Des plaques de microtitration à 96 puits ont été remplies de 125 µL de bouillon nutritif double force, et différentes concentrations de dérivés d’hydrazone ont été ajoutées. Les médicaments de référence dans la gamme 12.5 µL/mL à 40 µL/mL ont été traités de manière similaire. Une aliquote de 1 × 105 cfu/mL d’organismes à tester a été ajoutée à chaque puits. La plaque témoin a été remplie de bouillon nutritif et d’organismes à tester uniquement. Les plaques de test et de contrôle ont été incubées à 37°C (24 heures pour les bactéries et 48 heures pour les champignons), après quoi 20 µL de 1,25 mg/ml de bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2, 5-diphényltétrazolium (MTT) ont été introduits dans chaque puits. Des observations ont été faites après 20 minutes pour une coloration violette, qui indique la croissance. Les concentrations minimales des dérivés de l’hydrazone et des médicaments de référence qui n’ont pas montré de changement de couleur dans les puits ont été considérées comme les valeurs CMI . Les déterminations ont été effectuées en réplicats.
2.2.3. Études de modulation résistante
Pour les études de modulation, les plaques 96 puits ont été remplies de 125 µL de bouillon nutritif double force, et le même volume de 40 µL de phénylhydrazones a été ajouté. Différentes concentrations dans les plages de 50 µL/ml à 7,812 µL/ml et de 15,625 µL/ml à 7,812 µL/ml de ciprofloxacine et de fluconazole ont été ajoutées, respectivement. 25 µL contenant 1 × 105 cfu d’organismes à tester ont été ajoutés à chaque puits, et les plaques ont été incubées à 37°C (pendant 24 et 48 heures pour les bactéries et les champignons, respectivement), après quoi 20 µL de MTT ont été ajoutés à chaque puits. L’apparition d’un changement de couleur des puits nuageux au violet a été enregistrée et comparée aux CMI des médicaments de référence uniquement… Les déterminations ont été effectuées en réplicats.
3. Résultats et discussion
3.1. Analyse structurale des phénylhydrazones
La voie de synthèse employée pour la synthèse des composés a été suivie par la réaction de condensation standard entre les aldéhydes ou les cétones et les hydrazines, en tenant compte de la disponibilité commerciale des blocs de construction (Schéma 1). Une approche de déconnexion rétrosynthétique nous a permis d’identifier divers aldéhydes et une cétone comme intermédiaires clés pour la synthèse des composés souhaités. Le processus implique une attaque nucléophile aromatique déterminante de la 2, 4-dinitrophénylhydrazine sur le carbonyle dans une solution acidifiée. Ceci a été suivi par la déshydratation de l’intermédiaire réactif pour donner le produit final, le dérivé 2, 4-dinitrophénylhydrazone.
Les données des procédures de synthèse sont incluses dans la section expérimentale et interprétées selon la séquence : intervalle de point de fusion (Mpt.) en degré Celsius (°C), longueur d’onde d’absorption maximale du spectre ultraviolet-visible, spectre infrarouge, 1H NMR , 13C NMR, et HRMS comme outil de confirmation pour SA5 (composé 5) (un des composés les plus actifs).
3.1.1. Spectroscopie UV-Vis
Les spectres des six composés ont été déterminés dans les longueurs d’onde ultraviolettes et visibles (200-800 nm) comme outil de confirmation pour BP1 dans les informations supplémentaires en utilisant le méthanol comme blanc. Les bandes d’absorption à 203 nm et 403 nm, qui ont été obtenues dans les spectres électroniques des phénylhydrazones synthétisées, peuvent être attribuées à des transitions, qui sont apportées par les divers substituants auxochromes sur les phénylhydrazones. Les phénylhydrazones sont connues pour être absorbées à différentes longueurs d’onde dans la gamme UV-visible.
Par exemple, le composé BP1, lorsqu’il est dissous dans du méthanol et scanné dans la région UV-visible, a montré une absorption à 203 nm, 314 nm et 382 nm qui pourrait être attribuée à une conjugaison étendue dans les phénylhydrazones après le couplage de la benzophénone et de la 2,4-dinitrophénylhydrazine. Cependant, le composé BP1 a montré une absorption maximale à 382 nm, ce qui pourrait être attribué à une augmentation de la conjugaison. De même, les composés BA2, MHB3, VL4, SA5 et DHB6 ont montré une absorption maximale à 378 nm, 392 nm, 394 nm, 386 nm et 403 nm, respectivement, comme observé dans les informations complémentaires.
La conjugaison étendue peut être attribuée à la présence de chromophores dans les phénylhydrazones qui incluent BP1 (deux chromophores de cycle aromatique), MHB3 (auxochrome méta-hydroxy), VL4 (un auxochrome hydroxy et méthoxy), SA5 (auxochrome ortho hydroxy), et DHB6 (deux auxochromes hydroxy). Cela suggère que les hydrazones avec auxochromes et chromophore supplémentaire ont eu une conjugaison étendue conduisant à un décalage vers la droite (décalage bathochromique).
3.1.2. Spectroscopie infrarouge
Le spectre infrarouge donne une idée des groupes fonctionnels dans un composé. A partir du spectre infrarouge du composé 5 en tant qu’échantillon, la présence d’une large bande s’étirant à partir d’environ 3300 cm-1 et inclinée dans la région CH aliphatique d’environ 3000 cm-1 indique la présence d’un groupe fonctionnel hydroxy, dans ce cas celui d’un phénol comme observé dans les informations complémentaires.
Il a également été observé à partir du spectre IR (informations complémentaires) que les composés comme MHB3, VL4, SA5, et DHB6 ont montré un pic fort et net de leur bande d’étirement C = C dans la région de 1138-1620 cm-1 par rapport à BP1 et BA2 qui n’ont pas la fonction hydroxy comme indiqué dans le tableau 1. La présence du C = N, qui est formé à partir de la réaction de condensation entre l’hydrazine et les carbonyles, a été recouverte par les carbones aromatiques hybridés sp2 (C = C) dans le benzène qui vibrent à 1138-1640 cm-1 selon les attachements de substituants. Comme les fréquences vibratoires des C = N se situent entre 1580-1600 cm-1, leurs bandes ne peuvent pas être clairement distinguées en présence de leurs homologues aromatiques C = C, comme le montrent les données expérimentales.
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3.1.3. Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN)
Des déterminations RMN ont été effectuées pour les six phénylhydrazones synthétisées en utilisant une technique RMN unidimensionnelle (1D) (1H et 13C) et une technique RMN bidimensionnelle, l’amélioration sans distorsion par transfert de polarisation pour les carbones quaternaires (DEPT-Q). Ces données sont attribuées à chaque composé dans la section expérimentale. Les structures ont été confirmées par les données spectrales de 1H NMR, 13C NMR et DEPT-Q, comme indiqué dans les informations supplémentaires pour les composés BP1, BA2, MHB3, VL4, SA5 et DHB6, respectivement. En ce qui concerne le DHB6 (composé 6), (figure 2, tableau 1), et d’après la RMN du proton (informations supplémentaires), un déplacement chimique montrant une résonance loin vers le bas signifie la présence du proton hydroxy avec un signal singulet. Il résonne plus loin dans le champ que le proton de l’amine secondaire en raison de l’effet d’écrantage accru de l’oxygène électronégatif. Ce déplacement chimique était légèrement plus élevé que celui du groupe hydroxyle (9,94 ppm) car le premier est plus proche de l’environnement chimique de l’atome d’azote électronégatif dans la liaison imine. Par conséquent, le premier signal singulet du groupe hydroxyle à 11,54 ppm a été suivi d’un signal singulet du proton de l’amine secondaire à 10,11 en raison de l’électronégativité du groupe azote avant l’autre signal du groupe hydroxyle. Le proton aromatique pris en sandwich entre deux groupes nitro électronégatifs était le signal suivant résonnant en bas du champ à 8,86 ppm. Il était suivi par le proton proche du groupe amino tertiaire. Le groupe amino tertiaire attaché au proton de l’imine a provoqué le désenrobage et la résonance en bas du champ des protons de l’imine à 8,86 ppm avec un signal singulet. Le proton solitaire le plus proche du groupe nitro en position para était le signal suivant avec un pic doublet à 7,95-7,97 ppm. L’autre proton solitaire le plus proche du groupe amino secondaire moins électronégatif a également donné un signal doublet à 7,64-7,66 ppm. Les deux autres protons solitaires (l’un entre le diol et l’autre en ortho de la liaison imine) ont donné un signal multiplet à 7,52-7,54 ppm, tandis que le proton le plus proche du groupe para hydroxy et à deux liaisons carbone du groupe imine a donné un signal doublet à 6.38 ppm.
DEPT-Q est utilisé pour la différenciation des carbones primaires, secondaires, tertiaires et quaternaires. En DEPT-Q, les signaux méthyle (CH3) et méthine (CH) apparaissent en haut dans la phase positive, tandis que les signaux méthylène (CH2) et quaternaire apparaissent en bas dans la phase négative. Le spectre DEPT-Q du DHB6 (informations supplémentaires) révèle la présence de signaux de carbone ascendants représentant seulement six carbones de méthine dans ce cas, survenant à 161.8, 159.1, 148.2, 136.7, 130.1, et 112.0 confirmant les carbones de méthine aromatique et sept carbones quaternaires survenant à 148.2, 130.1, 129.2, 123.6, 116.9, 108.7, et 102.9. Le DEPT-Q pour les autres composés peut être trouvé dans les informations supplémentaires.
3.1.4. Spectroscopie de masse
La spectroscopie de masse est utilisée pour la détermination des poids moléculaires précis et la fragmentation des composés en utilisant des techniques d’ionisation . Le composé SA5 phénylhydrazone était l’un des composés les plus actifs après l’évaluation antimicrobienne. D’après le spectre de masse de l’ionisation par électronébulisation (ESI), le pic d’ion moléculaire en mode négatif était de 301,0000 (M-H+), soit la masse réelle avec une marge de tolérance de 0,24 (0,41 %) par rapport à la masse théorique de 302,2400. Ceci a confirmé la masse moléculaire du composé SA5.
La spectroscopie de masse a été utilisée pour confirmer la masse moléculaire d’un des composés les plus actifs et n’a donc pas été appliquée aux autres.
4. Évaluation antimicrobienne
4.1. Concentrations minimales inhibitrices (CMI)
La concentration minimale inhibitrice (CMI) est la plus faible concentration d’un agent antimicrobien qui inhiberait la croissance visible de l’agent pathogène après 24 h (bactéries) et 48 h (champignons) d’incubation . Les CMI des phénylhydrazones et de deux antibiotiques standard (ciprofloxacine et fluconazole) ont été évaluées par le test de dilution des microbilles contre un panel de six micro-organismes pathogènes : Gram-négatifs , Gram-positifs , et C. albicans (champignon, souche clinique).
Tous les composés ont montré une faible activité antimicrobienne contre les organismes testés aux concentrations d’essai comme observé dans le tableau 2. BP1 a montré l’activité antimicrobienne la plus élevée parmi les six composés contre les organismes de test sélectionnés. BA2, cependant, a eu la plus faible activité antimicrobienne avec une CMI de 699 µM contre l’ensemble des organismes testés. MHB3 avait une CMI de 562 µM contre C. albicans et 662 µM et plus contre le reste des organismes testés. VL4 a enregistré une CMI de 602 µM contre tous les organismes testés sauf S. pneumoniae (CMI = 300 µM). Les CMI de SA5 contre S. pneumoniae et K. pneumoniae étaient de 165 µM et 331 µM, respectivement, tandis que pour S. aureus, E. coli, P. aeruginosa et C. albicans, il avait une CMI plus élevée de 662 µM. Le DHB6 a montré une activité contre S. pneumoniae, K. pneumoniae et C. albicans avec des CMI de 314 µM, tandis que pour S. aureus, E. coli et P. aeruginosa, il avait des CMI de 628 µM et plus. Le médicament antibactérien de référence utilisé était la ciprofloxacine, et les CMI enregistrées étaient de 2,36 µM contre P. aeruginosa, S. pneumoniae et K. pneumoniae, tandis que 4,72 µM ont été enregistrées contre S. aureus et E. coli. Le médicament antifongique de référence utilisé était le fluconazole, et la CMI obtenue était de 327 µM contre C. albicans. La CMI des phénylhydrazones contre les deux organismes Gram-négatifs était comprise entre 552 µM et 699 µM, alors que la norme ciprofloxacine était à 4,72 et 2,36 µM, respectivement (tableau 2).
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BP1 , BA2 , MHB3 , VL4 , SA5 , DHB6 ; antibiotiques standard : CPR et FLZ . Nd . Tous les tests ont été réalisés en triplicata (n = 3).
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4.2. Activité de modulation de la résistance
La tendance des phénylhydrazones aux sous-MICs à améliorer les activités de certains antibiotiques commerciaux contre des souches résistantes connues a été étudiée par le test de modulation de la résistance. D’après les tableaux 2 et 3, BP1 (composé 1) avec une sous-CMI de 50 µM contre S. pneumoniae a abaissé la CMI de la ciprofloxacine de 2,36 à 1.078 µM, ce qui représente une réduction de 54,32 % de la CMI de la ciprofloxacine. BP1 a également amélioré la performance de la ciprofloxacine à une CMI inférieure à 50 µM contre K. pneumoniae de 2,36 µM à 1,078 µM, ce qui représente une réduction de 54,32 % de la CMI de l’antibiotique. De nouveau, BP1 a modulé l’activité du fluconazole contre C. albicans de 327 à 2,156 µM représentant une réduction de 99,34% de la CMI du fluconazole. De même, BA2 a amélioré l’activité de la ciprofloxacine contre S. pneumoniae et a réduit la CMI de la ciprofloxacine de 2,36 à 1,36 µM, soit une réduction de 42,37 %. En outre, BA2 a également modulé l’activité du fluconazole à une CMI inférieure à 50 µM contre C. albicans et a provoqué une réduction de sa CMI de 327 à 1,23 µM, ce qui indique une réduction de 99,6% de la CMI.
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MHB3 a modulé l’activité de la ciprofloxacine contre S. pneumoniae et Klebsiella pneumoniae provoquant une réduction de la CMI des antibiotiques de 2,36 à 1,29 µM. Cette diminution de la CMI a indiqué une réduction de 45,33%. MHB3 a également montré la modulation de l’activité du fluconazole à une CMI inférieure à 50 µM contre Candida albicans et a abaissé la CMI de 327 µM à 5,109, indiquant une réduction maximale de 98,43 %. Le VL4 a amélioré la performance de la ciprofloxacine à une CMI inférieure à 50 µM contre S. pneumoniae et K. pneumoniae. La CMI de l’antibiotique a diminué de 2,36 à 1,176 µM. dans les deux cas. Cette diminution de la CMI représente une réduction de 50,17 %. Le VL4 a encore modulé la performance du fluconazole à une CMI inférieure à 50 µM contre C. albicans et a abaissé la CMI de 327 µM à 1,176 µM, ce qui a montré une réduction maximale de 99,64 %.
En outre, le composé 5 (SA5) a modulé l’activité de la ciprofloxacine à une CMI inférieure à 50 µM contre S. pneumoniae et K. pneumoniae. La CMI a été abaissée de 2,36 à 1,29 µM dans les deux cas, ce qui a entraîné une réduction de 45,34 %. SA5 a de nouveau modulé la performance du fluconazole à une CMI inférieure à 50 µM contre C. albicans et a supprimé sa CMI de 327 à 1,29 µM, indiquant une bonne réduction de 99,61 %. Le DHB6 (composé 6) a également modulé l’activité de la ciprofloxacine à une CMI inférieure à 50 µM contre S. pneumoniae et K. pneumoniae et a abaissé sa CMI de 2,36 à 1,23 µM dans les deux cas, ce qui représente une réduction de 47,88 % de la CMI. Le DHB6 a également modulé l’activité du fluconazole à une CMI inférieure à 50 µM contre C. albicans et a abaissé sa CMI de 327 µM à 1,23 µM, ce qui représente une réduction de 99,62 % de la CMI. SA5 et BP1 ont été meilleurs que les quatre autres phénylhydrazones dans l’activité de modulation de la résistance avec la ciprofloxacine qui avait une CMI de 2,58 µM contre P.aeruginosa, suivie par BP1 (17,2 µM). Par conséquent, la présence d’un groupe ortho hydroxy dans SA5 et d’un groupe cétone aromatique pourrait être essentielle pour l’activité modulatrice de résistance en combinaison avec la ciprofloxacine contre P.aeruginosa et E. coli Gram-négatifs. En outre, la présence d’un groupe méta-hydroxy (MHB3), d’un groupe hydroxy et méthoxy (VL4) et l’absence d’un substituant sur la partie benzaldéhyde de BA2 ont également amélioré l’activité et pourraient être envisagés pour le développement de futurs médicaments. K. pneumoniae, l’autre homologue Gram négatif qui cause des infections graves, était plus sensible aux phénylhydrazones de 138 à 699 µM. En combinant des concentrations subinhibitrices de phénylhydrazones avec de la ciprofloxacine, la barrière de résistance de K. pneumoniae a été réduite, ce qui a permis d’obtenir une CMI beaucoup plus faible de 1,078 contre 5,46 µM, une tendance plus impressionnante que celle de P. aeruginosa et E.coli.
Les phénylhydrazones ont eu une activité similaire contre les organismes à Gram positif allant de 87,3 à 699 µM ce qui est également évident des propriétés résistantes de Staphylococcus aureus et Streptococcus pneumoniae.
5. Conclusion
Une bibliothèque de six nouvelles phénylhydrazones a été synthétisée et caractérisée avec succès : 1-(2, 4-dinitrophényl)-2-(diphénylméthylène) hydrazine , 1-benzylidène-2-(2, 4-dinitrophényl) hydrazine , 3-(2-2-(4-dinitrophényl) hydrazono) méthylphénol, 4-(2-(2, 4-dinitrophényl) hydrazono) méthyl)-2-méthoxyphénol , (Z)-2-(2, 4-dinitrophényl) hydrazono) méthylphénol , et 4-(2-(2, 4-dinitrophénylhydrazono) méthyl) benzène-1, 3-diol.
Dans le cadre de la conception et de l’optimisation de futurs médicaments, les phénylhydrazones peuvent être considérées comme des backbones structurels en raison de leur faisabilité synthétique et de leur bon rendement. Les composés ont montré une faible propriété antimicrobienne mais ont démontré une forte action modulatrice résistante lorsqu’ils sont combinés avec les médicaments standards. Les activités des standards se sont améliorées de manière significative avec une bonne réduction des valeurs CMI.
Abréviations
| MRSA: | Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline |
| ATCC : | American type culture collection |
| NTCC: | Collection nationale de cultures types |
| MTT : | Bromure de (4, 5-Diméthylthiazol-2-yl)-2, 5-diphényltétrazolium |
| MIC: | Concentration minimale inhibitrice |
| TLC : | Chromatographie sur couche mince |
| Cfu: | Unités formant des colonies |
| Eq.: | Equivalent |
| DEPT-Q: | Augmentation sans distorsion du transfert de polarisation pour les carbones quaternaires |
| HRSMS: | Spectre de masse à haute résolution. |
Données disponibles
Les données de la recherche sont disponibles dans les archives du département de chimie pharmaceutique, de la faculté de pharmacie, de l’Université des sciences et technologies Kwame Nkrumah.
Conflits d’intérêts
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts concernant la publication de cet article.
Contributions des auteurs
A.A., A.B., I.A., Y.D.B., C.D.K.A. et B.K.H. ont conçu le travail de recherche et préparé le manuscrit. C.D. K.A., A.B. et A.A. ont conçu et réalisé la synthèse des composés. C.D.K.A., A.A. et I.A. ont élaboré le cadre conceptuel et préparé le manuscrit. C.D.K.A. et B.K.H. ont interprété les résultats spectraux et ont procédé à l’élucidation de la structure. Y.D.B. et A.A. ont réalisé l’essai antimicrobien in vitro et ont fourni ses données expérimentales et l’interprétation des résultats.
Remerciements
Les auteurs sont très reconnaissants à tout le personnel et les techniciens du département de chimie pharmaceutique, Faculté de pharmacie, KNUST, Kumasi, Ghana, pour leur soutien. Les auteurs remercient grandement M. Francis Amankwah du département de pharmacie (section microbiologie), KNUST, pour le soutien technique.
Matériaux supplémentaires
Le fichier supplémentaire contient tous les spectres. (Matériaux supplémentaires)