Résultats et discussion
Pour mieux comprendre la formation et la réparation des sites AP résultant de la réparation par excision de bases et de la dépurination/dépyrimidination spontanée in vivo, nous avons mesuré le nombre de sites AP endogènes dans l’ADN génomique extrait de divers tissus de rats adultes et de foie humain de qualité transplantation en utilisant le test ASB (3). Le nombre de sites AP endogènes variait largement entre les tissus (Fig. 1)⇓ mais pas au sein d’un même tissu. Le nombre le plus élevé de sites AP a été détecté dans le cerveau, avec 30 sites AP par 106 nucléotides, suivi par le cœur et le côlon. En revanche, le foie, les reins et les poumons des rats présentaient systématiquement le plus faible nombre de sites AP (8-9 sites AP par 106 nucléotides). Le nombre de sites AP endogènes dans le foie humain était comparable à celui du foie de rat. Ces données indiquent que les sites AP persistent à raison de 50 000 à 200 000 lésions par cellule de mammifère dans des conditions physiologiques normales. Le nombre de sites AP à l’état d’équilibre dans l’ADN génomique devrait refléter l’équilibre entre la formation et la réparation des sites AP. Les interprétations possibles du nombre plus élevé de sites AP endogènes dans le cerveau sont les suivantes : (a) un taux plus élevé de dépurination et/ou de formation de produits d’addition à l’ADN endogène, entraînant un plus grand nombre de sites AP ; (b) une activité plus élevée de l’ADN glycosylase, induisant plus de sites AP ; (c) une activité plus faible de l’endonucléase AP de type II, entraînant une accumulation de sites AP ; et (d) une efficacité moindre de la dRp-ase ou de la β-élimination, laissant des sites AP 5′-nickelés.
Sites AP endogènes dans les tissus de rat et d’homme. L’ADN a été extrait à 4°C de tissus de rats intacts et de foies humains normaux, et le nombre de sites AP a été mesuré à l’aide du test ASB. A, film radiographique typique montrant les sites AP endogènes des tissus de rat. L’ADN (y compris les échantillons d’ADN standard) a été chargé sur une membrane NC (1,5 μg par emplacement). B, données densitométriques de balayage des sites AP endogènes dans les tissus de rat et humains. Colonnes, moyennes issues de fentes dupliquées de cinq à huit échantillons individuels ; barres, écart-type.
Le processus majeur de réparation des sites AP est la voie dépendante de l’endonucléase AP de type II/β-pol (7). L’endonucléase AP de type II peut reconnaître les sites AP et inciser le squelette phosphodiester immédiatement en 5′ des lésions, laissant un groupe 3′-hydroxyle et une terminaison 5′-AP du site (5). Le 5′-dRp est ensuite libéré, et la lacune nucléotidique unique est comblée. Il a été démontré que des quantités importantes d’endonucléase AP de type II sont présentes dans le noyau des cellules de mammifères (8). Précédemment, nous avons montré que la combinaison du test ASB et de l’endonucléase AP de type II ou du NaOH induit le clivage 3′ ou 5′ des sites AP, respectivement (3). Pour comprendre l’activité de l’endonucléase AP et de la dRp-ase in vivo, nous avons encore optimisé le test de clivage des sites AP. Dans cette expérience, nous avons utilisé Exo III comme l’endonucléase AP de type II pour identifier le clivage 3′ des sites AP et la putrescine pour détecter les 5′-nicks (Fig. 2)⇓. Pour caractériser ce test de clivage des sites AP, nous avons incubé de l’ADN qui avait été prétraité avec du MX pour réduire le nombre de sites AP à 3,8 ± 0,5 sites AP par 106 nucléotides (moyenne ± SD) avec un tampon thermique et acide. Diverses périodes d’incubation à la chaleur et à l’acide ont induit 11, 47, 115 et 320 sites AP par 106 nucléotides. Un seul traitement d’Exo III a réduit le nombre de sites AP de 4 à 10 sites AP par 106 nucléotides dans chaque échantillon d’ADN, quel que soit le nombre initial présent (Fig. 3)⇓. Cette réduction peut être due à la combinaison de l’incision enzymatique du côté 5′ par Exo III et du clivage 3′ non spécifique des sites AP pendant l’incubation avec Exo III. Ce clivage 3′ non spécifique a empêché une quantification précise du nombre de sites AP 3′-nickés dans l’ADN avec ce test. En revanche, le traitement à la putrescine n’a montré aucune réduction du nombre de sites AP. Après incubation avec Exo III suivie de putrescine, le nombre de sites AP a été réduit au nombre original de sites AP dans l’ADN de thymus de veau prétraité avec MX. L’efficacité de clivage des sites AP par la combinaison d’Exo III et de putrescine était >99%.
Schéma du test de clivage des sites AP. Pour mieux comprendre les activités de l’endonucléase AP de type II, ainsi que de la dRp-ase in vivo, nous avons déterminé l’existence de clivages du côté 5′ ou 3′ des sites AP dans l’ADN génomique. La putrescine et Exo III (endonucléase AP de type II) laissent des sites AP clivés en 3′ et 5′, respectivement. Pour les sites AP intacts, sans incision des côtés 3′ et 5′ des sites AP, le test ASB peut théoriquement détecter le nombre original de sites AP après traitement par Exo III ou putrescine, car les sites AP restent sur le squelette de l’ADN après incision de chaque côté de la liaison phosphodiester adjacente au site AP. Cependant, la combinaison d’Exo III et de putrescine clive les côtés 3′ et 5′ du site AP, ce qui entraîne la libération du site AP du squelette de l’ADN. Ces sites AP libérés ne sont pas détectés par ce test. Sur la base du nombre de sites AP restant sur le squelette de l’ADN après cette réaction de clivage, le nombre de sites AP clivés en 5′ et 3′ peut être estimé. Si des sites AP clivés en 5′ sont présents dans l’ADN, le traitement unique à la putrescine peut libérer les sites AP 5′-nickés par 3′-excision des sites AP . De même, les sites AP clivés en 3′ dans l’ADN peuvent être libérés par 5′-excision en utilisant Exo III .
Assai de clivage du site AP de l’ADN de thymus de veau traité avec un tampon chaleur/acide. Pour valider l’essai de clivage de site AP, nous avons examiné les effets de l’Exo III et de la putrescine sur les sites AP intacts induits dans l’ADN de thymus de veau. Le nombre original de sites AP dans l’ADN de thymus de veau a été réduit par MX (CTD/MX). L’ADN a ensuite été incubé dans un tampon chaleur/acide pendant différentes durées afin d’introduire différents nombres de sites AP intacts (-/- ; Réf. 9). L’ADN a été incubé avec Exo III et/ou la putrescine, et le nombre de sites AP restants dans l’ADN de thymus de veau a été mesuré par le test ASB . Colonnes, moyennes des fentes dupliquées de trois échantillons individuels ; barres, écart-type. A, test de clivage des sites AP de l’ADN contenant 115 sites AP pour 106 nucléotides. B, résumé du test de clivage du site AP de l’ADN contenant différents nombres de sites AP.
Nous avons appliqué ce test à l’ADN génomique extrait de tissus de rat et d’humain pour caractériser les sites AP endogènes. Les fractions de sites AP intacts et clivés, ainsi que les lésions aldéhydiques résiduelles sont résumées dans la figure 4⇓. L’ADN des tissus de rat et d’humain a été incubé avec Exo III suivi de putrescine pour examiner si les lésions détectées étaient des sites AP réels. Après le clivage 5′ et 3′ des sites AP, 1,5 à 2,2 lésions aldéhydiques résiduelles par 106 nucléotides ont été détectées. Ces données indiquent que le test ASB mesure correctement les sites AP endogènes. Les lésions résiduelles peuvent être dues aux limitations des réactions enzymatiques dans le test de clivage des sites AP ainsi qu’à la présence de lésions aldéhydiques de base endogènes telles que le formyluracile (10). En outre, une fraction combinée de sites AP 3′-cleaved et intacts a été détectée à ∼2-3 lésions par 106 nucléotides dans différents tissus, ce qui représente ∼1/3-1/10 du nombre total de sites AP endogènes. Pour examiner le nombre de sites AP clivés en 5′, nous avons incubé l’ADN avec de la putrescine. La réduction des sites AP par la putrescine (le nombre original de sites AP moins le nombre de sites AP restants après incubation avec la putrescine) représentait le nombre de sites AP 5′ clivés. Contrairement à l’ADN de thymus de veau prétraité avec un tampon chaleur/acide, l’ADN génomique traité par la putrescine présentait un nombre nettement réduit de sites AP. Ces données indiquent qu’environ deux tiers ou plus des sites AP endogènes sont déjà clivés du côté 5′ des sites AP in vivo.
Résumé du test de clivage des sites AP de l’ADN de tissus de rat et d’humain. Le nombre initial de sites AP tel que décrit dans la légende de la figure 1B⇓ était composé de sites 5′-cleaved, 3′-cleaved, de sites AP intacts et de lésions aldéhydiques résiduelles. Le nombre de sites AP 5′-cleaved a été calculé comme le nombre original de sites AP moins le nombre de sites AP restants après le traitement avec la putrescine seule. La fraction combinée de sites AP 3′ clivés et intacts correspondait à la différence entre le traitement par la putrescine et le traitement combiné par Exo III et la putrescine. Les sites AP résiduels montraient le nombre de lésions aldéhydiques non clivées.
Après le clivage 5′ des sites AP par l’endonucléase AP de type II, les sites AP incisés doivent ensuite être libérés du squelette de l’ADN via l’excision des résidus 5′-dRp. Ce processus de libération est éventuellement réalisé par la dRp-ase via une réaction hydrolytique (11) ou une β-élimination (12) ou via une enzyme endonucléolytique qui incise en aval des fragments 5′-dRp (13). Il a été démontré que la β-pol de Xenopus et humaine libère 5′-dRp par β-élimination (14). En utilisant la taille du patch de réparation soit dans les cellules β-pol-nulles ou -proficientes, il a été démontré qu’une seule voie de réparation des lacunes était prédominante dans les cellules β-pol-proficientes mais pas dans les cellules β-pol-nulles (15). De plus, l’interaction entre l’endonucléase AP humaine et le β-pol accélère la libération des résidus 5′-dRp in vitro (16). Cependant, l’efficacité de réparation des fragments 5′-dRp n’a pas été bien caractérisée dans les cellules ou in vivo. En utilisant des extraits exempts de cellules de levure, on a découvert que le traitement des fragments 5′-dRp était une étape limitant le taux de réparation par excision de bases de l’ADN contenant de l’uracile (17). De plus, l’efficacité catalytique du β-pol pour éliminer le 5′-dRp a été examinée (18). De manière intéressante, la Kcat de l’activité 5′- dRp-ase du β-pol était ∼100 fois plus faible que la Kcat de l’endonucléase AP. Cette étude démontre une nette persistance des sites 5′-incisés par AP dans les tissus de rat et d’homme. Ces données suggèrent que l’incision par l’endonucléase AP et la libération ultérieure de résidus 5′-dRp peuvent ne pas être efficacement liées à un niveau basal in vivo et que le processus de réparation de 5′-dRp peut être l’une des étapes limitant le taux de réparation par excision de bases.
Dans l’étude précédente (3), nous avons démontré que la dépurination spontanée se produisait à 1,5 site AP par 106 nucléotides par jour dans des conditions physiologiques. Pour vérifier si les adduits d’ADN thermolabiles tels que les N3- et N7-alkyl purines étaient la source du nombre plus élevé de sites AP endogènes dans le cerveau, un test de dépurination a été réalisé dans l’ADN du cerveau et du foie. Cependant, aucune différence n’a été observée entre le cerveau et le foie (données non présentées). Par conséquent, l’état stable des sites AP endogènes ne peut pas être dû à des lésions de bases labiles. L’une des lésions endogènes de l’ADN les plus importantes et les plus abondantes est la lésion oxydative des bases de l’ADN. Il a été signalé que l’état d’équilibre de la 5-hydroxycytosine dans le cerveau du rat est ∼2 fois plus élevé que celui du foie du rat (19). Ces bases pyrimidiques oxydées sont réparées par la terminaison III, laissant des sites AP sur le squelette de l’ADN. Pour examiner si le stress oxydatif pouvait être lié au nombre de sites AP à l’état d’équilibre dans l’ADN, les sites sensibles à l’End III ont été quantifiés en utilisant la combinaison du test ASB et de l’End III d’E. coli. Le nombre de sites sensibles à l’End III était trois fois plus élevé dans le cerveau (14 lésions par 106 nucléotides) par rapport aux autres tissus (4-5 lésions par 106 nucléotides). Récemment, l’homologue humain du gène End III (hNTH1) a été cloné et caractérisé (20). L’expression de l’ARNm de ce gène varie entre les organes selon un schéma qui correspond au nombre de sites AP endogènes (20). La plupart des ADN glycosylases impliquées dans la réparation des bases oxydées possèdent une activité AP lyase, qui clive le côté 3′ des sites AP. Par conséquent, les sites 5′ AP endogènes ne seraient pas issus des clivages des bases oxydées par ces ADN glycosylases. Une expérience préliminaire a montré que le peroxyde d’hydrogène avec FeSO4 induisait directement des sites AP clivés en 5′ dans l’ADN du thymus de veau sans aucune enzyme (données non montrées). Ces études suggèrent que le stress oxydatif pourrait être l’un des facteurs responsables de l’état stable des sites AP avec clivage 5′.
Nous nous attendions initialement à trouver un faible nombre de sites AP endogènes dans l’ADN génomique en raison de leur toxicité et de leur mutagénicité. Cependant, cette étude montre que l’état stable des sites AP est de ∼1 lésion par 105 nucléotides dans l’ADN génomique. Bien que les sites AP soient constamment réparés, la fraction de sites AP qui échappe à la réparation est susceptible de contribuer aux mutations, aux aberrations chromosomiques et aux erreurs de transcription qui peuvent être associées aux maladies spontanées liées à l’âge telles que le cancer et les troubles dégénératifs.