7 Liaison RAG à l’échelle du génome
Compte tenu des propriétés de liaison directe à l’ADN de RAG1, combinées à l’abondance unique des RSS présents dans les gènes des récepteurs d’antigènes, il était raisonnable de supposer que la spécificité du site de la recombinaison V(D)J est simplement appliquée par le recrutement préférentiel de RAG1 sur ses substrats d’ADN préférés. RAG2, en raison de son PHD et de son absence d’activité catalytique intrinsèque, ne devrait présenter aucune restriction fonctionnelle sur ses schémas de localisation. En conséquence, RAG2 se lie largement à travers le génome des lymphocytes, occupant une fraction majeure (~ 60%) des TSSs actifs, qui sont enrichis en H3K4me3 (Ji et al., 2010 ; Teng et al., 2015). Cependant, RAG1 se localise également sur des milliers de sites (~ 3500 dans les thymocytes et les cellules pré-B de souris) qui sont co-occupés par RAG2 et H3K4me3, englobant une partie substantielle des promoteurs et des exhausteurs hautement actifs et spécifiques à une lignée (Teng et al., 2015). Cette localisation étendue est également observée pour un mutant catalytique de RAG1 (D708A), ce qui indique que la liaison étendue de RAG1 ne reflète pas une accumulation post-cyclique (Teng et al., 2015). Les sites de liaison de RAG1 en dehors des gènes des récepteurs d’antigènes n’ont pas montré de corrélation claire avec la présence de motifs de type RSS (cryptic RSSs, ou cRSSs), ce qui indique également que les contacts spécifiques à la séquence et l’activité de clivage médiée par RAG ne peuvent pas expliquer les schémas de liaison de RAG1 dans tout le génome. Au contraire, les marqueurs d’accessibilité de la chromatine sont les meilleurs prédicteurs du recrutement de RAG1 : H3K4me3, H3K27Ac, contenu élevé en GC et contenu élevé en CpG (Teng et al., 2015).
En fait, seule une poignée d’exemples démontre un recrutement spécifique de RAG1 aux gènes des récepteurs d’antigènes via des trans-facteurs qui interagissent à la fois avec RAG1 et des motifs d’ADN spécifiques. Dans chaque cas, la spécificité du locus de l’événement de recrutement ne dépend pas du RSS en soi, mais d’un motif de liaison du facteur de transcription qui chevauche fortuitement un RSS. Le locus Tcrb de la souris illustre un cas où le recrutement ciblé de RAG1 contribue aux restrictions » au-delà de 12/23 » qui aident à maintenir l’ordre correct de la recombinaison (Dβ-Jβ avant Vβ-DJβ). Les 3′ 23-RSS flanquant Dβ1 et Dβ2 contiennent des sites de liaison conservés pour c-fos, une sous-unité du facteur de transcription AP-1 (Wang et al., 2008). D’une manière indépendante de ses propriétés d’activation transcriptionnelle, c-fos recrute préférentiellement RAG1 aux RSS 3′ Dβ, favorisant ainsi la recombinaison Dβ-Jβ (Wang et al., 2008). Dans la lignée B, le locus analogue du récepteur d’antigène est le gène Igh, où la recombinaison directe Vh-Dh est défavorisée par rapport à la recombinaison Vh-DJh. Dans ce cas, cependant, l’ordre de recombinaison semble être régulé par des changements locaux dans les marques épigénétiques qui suivent la recombinaison D-Jh, et marquent le produit DJ pour une liaison et une recombinaison RAG1 préférentielles par rapport aux segments de gènes Dh germinaux (Subrahmanyam et al., 2012). En outre, la recombinaison directe Vh-Dh est supprimée par un élément de séquence connu sous le nom d’IGCR1 qui se trouve entre les groupes de gènes D et V (Guo et al., 2011). IGCR1 contient deux sites CTCF essentiels et on pense qu’il fonctionne comme un point d’ancrage pour les boucles chromatiniennes qui séquestrent la partie DJ du locus Igh de la partie V (Guo et al., 2011 ; Lin, Guo, Su, Zhang, & Alt, 2015 ; Medvedovic et al., 2013). Le locus humain Tcrd fournit un autre exemple de dépôt de RAG1 spécifique au locus, où le recrutement de RAG1 dépendant de Runx1 à Dδ2 favorise un événement de réarrangement Dδ2-Dδ3 qui précède la recombinaison classique Dδ-Jδ (Cieslak et al., 2014). Il en résulte une inclusion spécifique à l’homme de deux segments du gène D dans les réarrangements Tcrd. Enfin, il a été suggéré que Pax5 interagisse avec RAG et facilite le recrutement de RAG sur les segments de gènes Vh (Zhang et al., 2006), bien qu’il reste à démontrer que ce mécanisme améliore l’assemblage du locus Igh endogène.
En dehors de ces exceptions, la liaison de RAG1 ne semble pas s’initier principalement à partir d’événements de recrutement spécifiques à la séquence. Même au sein des gènes Tcr et Ig, la liaison de RAG1 s’étend au-delà des limites du RSS, occupant des régions introniques qui sont enrichies en H3K4me3 mais dépourvues de RSS (Teng et al., 2015). Cela ne veut pas dire que les RSS ne jouent pas un rôle secondaire en stabilisant ou en renforçant la liaison de RAG1 après le recrutement. Les gènes Tcra et Igk sont les principaux recruteurs de la liaison RAG1 dans les thymocytes doublement positifs et les cellules pré-B, respectivement, et des pics définis d’accumulation de RAG1 sont clairement observés sur les RSS dans les centres de recombinaison (Teng et al., 2015). La densité exceptionnelle des RSS dans les gènes des récepteurs d’antigènes est probablement l’une des caractéristiques les plus importantes qui les distinguent du reste du génome.
Le génome en général, cependant, présente un recrutement de RAG1 indépendant des RSS, qui se produit probablement par des interactions non spécifiques entre RAG1 et l’ADN qui sont médiées par divers domaines dans le noyau de RAG1, y compris le NBD (Teng et al., 2015 ; Yin et al., 2009). En outre, le recrutement indirect de RAG1 à la chromatine peut se produire par le biais de son interaction avec RAG2, bien que ce dernier ne puisse pas expliquer entièrement les modèles de liaison de RAG1, qui sont partiellement maintenus en l’absence de RAG2, bien qu’avec une intensité réduite (Teng et al., 2015).
La gamme génomique des sites de liaison de RAG1, bien que plus large que prévu, s’étend encore plus en l’absence de domaines non centraux de RAG1 ou RAG2. En l’absence de la région C-terminale de RAG2 (qui comprend le PHD), RAG1 diffuse vers des sites avec des densités plus faibles de H3K4me3, plutôt que de se diriger vers les TSS les plus actifs (Teng et al., 2015). Une possibilité est que cela résulte d’un démasquage d’activités supplémentaires non spécifiques de liaison à l’ADN de RAG1, étant donné l’absence du domaine auto-inhibiteur qui se trouve dans la région C-terminale de RAG2 (Lu et al., 2015). Une autre possibilité est qu’en l’absence du domaine PHD de RAG2, le complexe RAG a moins tendance à se loger dans les régions à forte teneur en H3K4me3. Le fait que la délétion de la région C-terminale de RAG2 entraîne une régulation à la hausse des niveaux de la protéine RAG1 pourrait également avoir une incidence sur le schéma de liaison plus large de RAG1 (Teng et al., 2015). Le noyau RAG1 se lie également de manière beaucoup plus promiscuque que le RAG1 complet et, de manière intrigante, présente une intensité de liaison élevée à de nombreux sites de récepteurs non antigéniques mais une intensité réduite au locus Tcra, par rapport au RAG1 complet (Teng et al., 2015). Cela pourrait refléter des changements dans les propriétés intrinsèques de liaison à l’ADN de la protéine RAG1 tronquée, ou l’absence d’activités codées dans les terminaisons non centrales de RAG1 (telles que l’ubiquitylation d’histone médiée par RING ou l’auto-inhibition médiée par la terminaison C). La recombinase RAG tolère la variation de séquence non seulement dans ses substrats, en particulier dans l’espaceur RSS, mais aussi dans l’heptamère et le nonamère (Hesse et al, 1989 ; Lewis, Agard, Suh, & Czyzyk, 1997 ; Marculescu, Le, Simon, Jaeger, & Nadel, 2002 ; Ramsden, Baetz, & Wu, 1994 ; Zhang & Swanson, 2008). Même l’interaction RAG1-nonamère médiée par le NBD repose sur relativement peu de contacts spécifiques à la séquence (Yin et al., 2009). Les RSS qui peuplent les gènes des récepteurs d’antigènes sont divers dans leur contenu de séquence (divergeant parfois de manière significative des motifs consensus heptamères et nonamères), et la reconnaissance du substrat par RAG doit être suffisamment flexible pour permettre une diversité maximale du répertoire. En dehors des gènes des récepteurs d’antigènes, les sites de liaison de RAG1 ne montrent aucune préférence cumulative pour une signature de séquence particulière (Teng et al., 2015).
La reconnaissance flexible du substrat par RAG crée cependant un problème pour le reste du génome. Les exigences de séquence assez minimes pour un RSS fonctionnel (du moins, selon les règles que nous comprenons actuellement) permettent aux cRSS de se produire assez fréquemment dans les génomes des vertébrés (Lewis et al., 1997). Le danger des cRSS fortuits est mis en évidence par leur participation aux réarrangements génétiques dépendants de RAG qui contribuent à la lymphomagénèse (Larmonie et al., 2013). Puisque la majorité de la liaison de RAG1 à travers le génome est régie par un recrutement non spécifique à l’ADN ou à la chromatine accessible, il semblerait biologiquement prudent de limiter la disponibilité de cRSS forts à proximité des sites de liaison de RAG1 et ainsi minimiser le potentiel d’activité hors cible de RAG. En effet, les sites de liaison de RAG1 dans les lymphocytes humains et de souris sont préférentiellement dépourvus de cRSS (Teng et al., 2015), et nous proposons que cela soit dû à des pressions sélectives imposées par des réarrangements génétiques se produisant en dehors des gènes des récepteurs d’antigènes. Ainsi, le répertoire des TSS associés à RAG1 est protégé de l’activité de RAG pendant la recombinaison V(D)J. Nous spéculons que les rares cRSS qui conservent une activité et continuent à médier des réarrangements ectopiques peu fréquents ont été maintenus dans le génome en raison de leur chevauchement avec des séquences régulatrices ou fonctionnelles dans leurs loci hôtes, ou simplement n’ont pas exercé de conséquences négatives suffisamment fortes pour être sélectionnées.