I.U.B. : 3.1.27.5
C.A.S..: 9001-99-4
Réaction enzymatique (l’image s’ouvrira dans une nouvelle fenêtre)
La ribonucléase pancréatique (RNase) est une endoribonucléase. Elle catalyse le clivage de la liaison phosphodiester entre le 5′-ribose d’un nucléotide et le groupe phosphate attaché au 3′-ribose d’un nucléotide pyrimidine adjacent. Ce clivage forme un phosphate 2′,3′-cyclique, qui est ensuite hydrolysé en phosphate de 3′-nucléoside correspondant.
La RNase se trouve en plus grande quantité dans la pancréase des ruminants (Barnard 1969). Le composant majeur de l’enzyme cristalline est la RNase A ; un composant mineur est la RNase B. La RNase B est la forme glycosylée de la RNase A (Beintema et al. 1976).
Histoire:
Le travail de Jones en 1920 est généralement cité comme le « début » de la ribonucléase pancréatique (Richards et Wycoff 1971). La RNase a été isolée par Dubos et Thompson en 1938 et cristallisée par Kunitz en 1940.
En 1947, Worthington a été la première entreprise à fabriquer de la RNase cristalline hautement purifiée. Au début des années 1950, la société Armour a préparé une enzyme cristalline brute et l’a proposée à un prix très abordable. Au cours des années 1960 et 1970, la RNase A a été l’un des sujets d’étude favoris, principalement parce qu’elle est remarquablement thermostable et présente à une concentration élevée dans une source accessible, le pancréas bovin. Ces études ont conduit à l’élucidation de la structure cristalline (Anfinsen 1959, Groves 1966, et Scheraga 1967), à la détermination de la séquence d’acides aminés (Smyth et al. 1963), à l’identification du mécanisme catalytique (Beers 1960), et à la clarification des voies de repliement (Hantgan et al. 1974). La RNase A a été la première enzyme et la troisième protéine pour laquelle une séquence correcte d’acides aminés a été déterminée (Raines 1998).
Quatre prix Nobel ont été décernés pour des travaux associés aux études sur la RNase (Anfinsen, Moore, Stein et Merrifield). La vaste littérature et les nombreuses études ont fait de la RNase l’enzyme la plus étudiée du 20ème siècle (Raines 1998).
Des travaux récents continuent d’étudier la synthèse et la maturation de la RNase dans le réticulum endoplasmique des cellules vivantes (Geiger et al. 2010). De nombreux travaux sont également encore consacrés à l’étude du repliement et de l’agrégation de la RNase (Benito et al. 2008, Iwaoka et al. 2008, et Arai et al. 2010). Le rôle de l’enzyme dans le développement du cancer et la régulation des gènes est étudié (Shlyakhovenko 2009), et elle est en cours de développement dans des agents chimiothérapeutiques contre le cancer (Chao et al. 2010).
Spécificité :
La RNase A est spécifique des liaisons nucléosidiques pyrimidiques (Volkin et Cohn 1953). On pense que la réaction se déroule en deux étapes. Dans la première étape, la liaison 3′,5′-phosphodiester est clivée, tout en générant un intermédiaire phosphodiester 2′,3′-cyclique. Dans la seconde étape, le phosphodiester cyclique est hydrolysé en un groupe 3′-monophosphate. La première étape n’est pas spécifique de la base azotée du substrat, mais la deuxième étape est absolument spécifique des nucléotides pyrimidiques avec des phosphates 2′,3′-cycliques terminaux. La RNase B a la même spécificité que la RNase A envers le cytidylate cyclique et l’ARN de levure (Plummer et Hirs 1963). La RNase A montre une préférence pour les substrats de grande taille (Nogués et al. 1995).
L’enzyme se clive sur les résidus cytidine deux fois plus vite que sur les résidus uridyle (Richards et Wyckoff 1971). Thr45 s’est avéré être le plus important pour la médiation de la spécificité pyrimidine, à la fois en formant des liaisons hydrogène avec les bases pyrimidines et en excluant stériquement les bases purines (del Cardayré et Raines 1994). La chaîne latérale de l’Asp83 est importante pour stabiliser l’état de transition pendant le clivage des substrats contenant de l’uridine ; ce résidu n’a aucun effet sur la cinétique du clivage de la cytidine (del Cardayré et Raines 1995).
Composition:
La forme de la protéine ressemble à un rein, avec les résidus du site actif posés dans la fente (Richardson 1981, et Raines 1998). La structure secondaire contient de longs feuillets bêta antiparallèles à quatre brins et trois courtes hélices alpha (Raines 1998). La RNase A contient quatre liaisons disulfure, qui sont essentielles à la stabilité de l’enzyme native. Deux de ces liaisons disulfure se trouvent entre une hélice alpha et un feuillet bêta et contribuent davantage à la stabilité thermique que les deux autres (Klink et al. 2000). La RNase B est une glycoprotéine contenant à Asn34 un seul oligosaccharide composé de six résidus de mannose et de deux résidus de N-acétylglucosamine (Tarentino et al. 1970).
Caractéristiques moléculaires :
La RNase A est une petite protéine, l’enzyme mature ne possédant que 124 résidus d’acides aminés, sans aucun glucide attaché. La RNase A contient 19 des 20 acides aminés, manquant seulement le tryptophane (Nogués et al. 1995, et Raines 1998). La structure tridimensionnelle de la RNase A est entièrement codée par sa séquence d’acides aminés (White et Anfinsen 1959, et Raines 1998). Les huit gènes humains de type RNase A sont situés sur le chromosome 14. Chacun code une séquence signal sécrétoire et contient une triade catalytique invariante de deux histidines et une lysine avec un motif conservé (CKXXNTF) (Marshall et al. 2008).
Les séquences d’acides aminés de nombreux homologues de la RNase A ont été identifiées, faisant de la RNase A un système modèle pour l’évolution moléculaire des vertébrés (Dyer et Rosenberg 2006). A partir des séquences et de leur distribution sur une gamme d’espèces, il a été établi que la RNase A est une protéine moderne qui évolue rapidement (Doolittle 1992, et Raines 1998).
Numéro d’accession de la protéine : P61823
Classification CATH (v. 3.2.0):
- Classe : Alpha-Beta
- Architecture : Rouleau
- Topologie : Protéine P-30
Poids moléculaire :
- RNase A : 13,7 kDa (Hirs et al. 1956b)
- RNase B : 14,700 ± 0,3 (Plummer et Hirs 1963)
Phase optimale : RNase A : 7,0-7,5 (Brown et Todd 1955)
Point isoélectrique :
- RNase A : 9,3 (Ui 1971)
Coefficient d’extinction :
- RNase A et B : 8 640 cm-1M-1 (Théorique)
- RNase A : E 1%, 280 = 7,3 (Worthington RNase A)
- RNase B : E 1%, 280 = 5.77 (Théorique, RNase B)
Résidus du site actif :
- Histidine (H12, H119)
- Lysine (K41)
Activateurs :
- Chlorure de sodium (Weickmann et al. 1981)
- Sulfate (Moosavi-Movahedi et al. 2006)
Inhibiteurs:
- Ions de métaux lourds
- Inhibiteur de la ribonucléase (RI), une protéine de 50 kDa qui constitue ≤ 0.01 % des protéines du cytosol des cellules de mammifères (Takahashi 1967)
- Complexes uridine-vanadate (Lindquist et al. 1973)
Applications :
- Élimination de l’ARN pendant l’isolement de l’ADN
- Analyse de la séquence de l’ARN
- Tests de protection contre les ARNases
- Quantification ou cartographie de l’ARN
- Purification de l’ADN plasmidique
- Isolation de l’ADN génomique
- Marqueur de poids moléculaire
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