Propriétés biochimiques et pathogènes deShewanella alga et Shewanella putrefaciens

RESULTATS

Le biotypage des isolats de Shewanella selon deux schémas distincts a fourni des résultats similaires (tableau1). La plupart des isolats cliniques (74%) appartenaient au biovar 2 de Gilardi (biotype 2 du CDC), étant négatifs au saccharose et au maltose lors de leur croissance sur la gélose SS et sur des milieux contenant des concentrations élevées de NaCl. La seule différence majeure constatée entre le schéma de classification de Gilardi (6) et celui de Weyant et al. (22) est que les isolats du biovar 3 (négatifs pour le saccharose, le maltose, la gélose SS et le NaCl) n’ont pas été regroupés par le système de biotypage des CDC. Contrairement aux isolats humains, le biovar 1 (biotype CDC 1) prédominait (67 %) parmi les souches non humaines. Ces souches produisaient typiquement de l’acide à partir de maltose et/ou de saccharose et ne se développaient pas sur une gélose à haute teneur en sel ou une gélose SS. Sur la base des propositions taxonomiques récentes de Nozue et autres (15), les souches du biovar 2 (biotype 2 du CDC) seraient identifiées comme S. alga tandis que toutes les souches du biovar 1 (biotype 1 du CDC) et 6 des 7 souches du biovar 3 seraient désignées comme S. putrefaciens ; la souche restante du biovar 3 a été identifiée par la suite comme S. alga. Cliniquement, S. alga s’est avéré prédominant (77 %), tandis que la majorité des isolats non humains (89 %) ont été confirmés comme étant S. putrefaciens (tableau 1).

Les 10 isolats de Shewanella, lorsqu’ils ont été testés sur les systèmes API 20E, API NFT, RapID NF Plus et Vitek, ont tous été identifiés comme étant des S. putrefaciens, à une exception près. Quatre des cinq isolats de S. putrefaciens ont produit des numéros de profil inacceptables sur le système API 20E (n° 0602026 et 0602006) ; la cinquième souche a généré un numéro de biotype rare pour S. putrefaciens. Toutes les souches de S. alga ont donné une excellente identification de S. putrefaciens sur l’API 20E. Le système API NFT a identifié tous les 10 isolats de Shewanella comme étant S. putrefaciens avec des identifications bonnes à excellentes, avec une exception, également une souche de S. putrefaciens (faible valeur discriminatoire, 48 h). RapID NF Plus a identifié les 10 isolats de Shewanella comme étant S. putrefaciens, avec une précision de 99,9 %. De même, toutes les souches ont été identifiées par Vitek (précision de 97 à 99 %) comme étant S. putrefaciens, bien que trois souches de S. putrefaciens aient nécessité 5 à 9 h d’incubation avant l’identification finale, contrairement aux résultats de 4 h pour les 7 autres souches. Les réactions aux hydrates de carbone (arabinose et maltose) sur les systèmes API 20E, API NFT et Vitek permettent toutefois d’attribuer correctement la plupart des souches aux taxons pertinents (S. putrefaciens etS. alga) si elles sont lues manuellement après les identifications finales comme S. putrefaciens.

La comparaison des propriétés biochimiques et enzymatiques des espèces deShewanella a révélé un certain nombre de différences (tableau 2). L’hémolyse sur la gélose au sang de mouton, telle que rapportée par Nozue et al. (15), a été détectée dans toutes les souches de S. alga mais seulement dans quelques isolats de S. putrefaciens. La plupart des souches de S. alga ont présenté ce phénotype seulement après une incubation prolongée (48 à 72 h), et la zone d’hémolyse était souvent irrégulière et difficile à détecter. D’autres activités précédemment trouvées pour aider à la séparation de S. alga et S. putrefaciens, telles que la croissance à 42°C, la croissance sur des milieux contenant des concentrations élevées de sel (6,5%), et la production d’acide à partir de l-arabinose, de saccharose et de maltose, ont été confirmées. Nous avons trouvé un nombre considérablement plus élevé de souches de S. putrefaciens qui se sont développées sur la gélose SS que ce qui avait été rapporté précédemment ; la plupart d’entre elles provenaient de sources non humaines. À l’exception du ribose, la production d’acide à partir de l’oxydation des hydrates de carbone était uniquement associée à S. putrefaciens. Les caractéristiques des sucres, cependant, varient considérablement entre ces isolats, certains étant positifs pour l’arabinose, le maltose et le saccharose, tandis que d’autres étaient positifs pour le maltose seulement ou étaient asaccharolytiques (souches du biovar 3). Plusieurs nouvelles activités enzymatiques ont été détectées parmi certains isolats de Shewanella qui, à notre connaissance, n’ont pas été rapportées précédemment. Il s’agit notamment des activités tyrosinase, alkylsulfatase, chitinase et élastase (tableau 2) ; la plupart de ces enzymes ont été trouvées dans des isolats non humains de S. putrefaciens. La plupart des souches de S. alga et de S. putrefaciens ont produit un sidérophore, tel que déterminé par les essais Chrome Azurol S. Cette activité était faible et cinq isolats de S. putrefaciens ont produit un sidérophore. Cette activité était faible, et cinq isolats (trois isolats de S. alga et deux isolats de S. putrefaciens) n’ont pas réussi à croître sur ce milieu.

Les isolats sélectionnés de Shewanella qui ont bien poussé à 35°C ont été caractérisés davantage pour l’activité enzymatique en utilisant API-ZYM (tableau 3) et pour les profils d’acides gras cellulaires avec le système MIDI. Sur les neuf substrats attaqués par une ou les deux espèces de Shewanella avec API-ZYM, des activités globales plus élevées pour sept de ces enzymes ont été associées à l’algue S.. La seule activité qui s’est avérée plus forte chez S. putrefaciens était la valine arylamidase, bien que cette activité soit extrêmement faible même chez ces souches. Les deux espèces ont produit une activité phosphatase alcaline uniformément forte. Une autre observation a été que toutes les souches de S. alga ont produit de façon constante huit de ces neuf enzymes, la seule exception étant la valine arylamidase. En revanche, S. putrefaciens était plus hétérogène, quatre des neuf enzymes détectées n’étant pas universellement présentes dans tous les isolats. L’analyse de 14 souches de Shewanella a indiqué que les acides gras prédominants étaient i-15:0, 17:1ω8c, et 16:0 ; certaines souches ont produit de grandes quantités de 16:1ω7c (9 à 18%), tandis que d’autres ont produit des quantités négligeables. Alors que la plupart des pics d’acides gras étaient assez cohérents parmi les souches de S. alga et de S. putrefaciens testées, plusieurs différences ont été notées (Tableau4). Des valeurs moyennes plus élevées d’acide pentadécanoïque et d’acide cis-9-heptadécénoïque (17:1ω8c) ont été notées pour S. alga, alors que l’inverse était vrai pour S. putrefaciens en ce qui concerne les acides hexadécanoïque et dodécanoïque. Pour l’acide hexadécanoïque, aucun chevauchement dans la gamme des acides gras totaux entre S. alga et S. putrefaciens n’a été observé ; pour l’acide pentadécanoïque et le 17:1ω8c, seul un isolat de S. putrefaciens ou de S. alga a produit une valeur qui tombait dans la gamme de l’autre. Bien qu’aucun pic unique n’ait été diagnostique, l’utilisation des quatre pics ensemble a clairement séparé les 14 souches deShewanella en deux groupes le long des lignes d’espèces.

On a constaté que les 23 souches de S. putrefacienspouvaient être réparties en trois groupes distincts sur la base de plusieurs caractéristiques phénotypiques (tableau 5). Le groupe 1, qui comprenait huit souches, dont l’ATCC 8073, produisait de l’acide à partir du maltose, du saccharose et de l’arabinose et utilisait l’acide urocanique. Les souches du groupe 1 étaient également réparties entre les isolats cliniques et non humains. Les souches du groupe 2 (n = 6), dont ATCC 8071, se distinguaient principalement des souches du groupe 1 par leur incapacité à oxyder le saccharose et le maltose. Là encore, la moitié de ces souches provenaient de matériel clinique. Les souches du groupe 3 (n = 9), toutes d’origine environnementale (région du lac Michigan), différaient considérablement des groupes 1 et 2. Leur croissance est faible ou nulle à 35°C, elles produisent de la chitinase et sont non pigmentées sur la gélose au tryptophane. Les neuf souches du groupe 3 produisaient initialement de l’α-glucosidase, mais après un nouveau test, seules trois souches étaient systématiquement positives. Le maltose a été oxydé, mais pas le saccharose ni l’arabinose. Contrairement aux groupes 1 et 2, l’acide urocanique n’a pas été utilisé comme source d’énergie.

Récemment, Vogel et ses collègues (21) ont noté des différences entre S. alga et S. putrefaciens dans leur sensibilité à certains agents antimicrobiens, notamment la pénicilline, l’ampicilline et la tétracycline. Ceci, associé au rapport liant l’activité hémolytique à S. alga et son association apparente avec la maladie humaine, suggère des différences possibles dans la pathogénicité entre ces deux espèces (Tableau 6). Nous avons donc sélectionné 10 souches (5 de chaque espèce) pour une analyse plus approfondie. Bien que nous n’ayons pas remarqué de différences majeures de sensibilité à la pénicilline, à l’ampicilline et à la tétracycline entre ces deux groupes en fonction de la catégorie de sensibilité (sensible, intermédiaire ou résistante), nous avons remarqué que les CMI moyennes pour S. alga de la pénicilline, de l’ampicilline et de la tétracycline (∼200, 56 et 5.2 μg/ml, respectivement) étaient supérieures aux CMI correspondantes pour S. putrefaciens(3, 1,3 et 1,1 μg/ml, respectivement).

Quatre des cinq souches de S. putrefaciens se sont attachées faiblement (+) à fortement (+++) (tableau 6) aux cellules HEp-2 dans les tests d’adhérence ; en revanche, aucune souche de S. alga n’a présenté des caractéristiques adhésives similaires, bien que quatre souches se soient fortement liées au fond de la lame de verre. Aucune activité invasive n’a été détectée chez les souches de Shewanella. Bien qu’une réaction hémolytique retardée ait été observée sur la gélose au sang de mouton pour les cinq souches de S. alga (tableau 2), la bêta-hémolyse n’a pas été détectée avec la technique de recouvrement de la gélose ou les essais en bouillon (tableau 6) ; les souches témoins d’E. tarda étaient positives en 1 h dans les deux tests. Pour les cinq souches de S. alga (et un isolat de S. putrefaciens), une faible réaction cytotoxique a parfois été observée lors des études d’adhésion et d’invasion. Cette réaction cytotoxique s’est manifestée par l’apparition de cellules HEp-2 présentant une morphologie cellulaire anormale, y compris des débris cellulaires (fantômes). Des différences de pathogénicité chez la souris entre ces deux espèces ont toutefois été constatées, puisque la DL50 moyenne chez les souris Swiss Webster pour S. algawas était de 1,9 × 108 UFC, alors que celle pour S. putrefaciens était de 8,4 × 108 UFC (P < 0,02).