Preuve d’une sélection positive agissant au locus du gène humain du récepteur de la dopamine D4

Résultats et discussion

Des ensembles d’amorces ont été choisis pour amplifier les quatre exons du gène DRD4 hautement riche en GC (1) ainsi que la région promotrice adjacente et les jonctions d’épissage (Fig. 1). Le reséquençage initial de l’ensemble du promoteur et de la région codante du gène DRD4 de 20 probands TDAH (données non présentées) a permis de découvrir un certain nombre de polymorphismes signalés précédemment. Ces polymorphismes comprenaient deux polymorphismes d’insertion/délétion, l’un dans la région du promoteur (4,3 kb en amont du VNTR ; réf. 18 et 19) et l’autre dans l’exon 1 (2,7 kb en amont du VNTR ; réf. 20 ; voir Fig. 1). En outre, un certain nombre de nouveaux SNP codants ont été découverts dans le VNTR de l’exon 3 (2), ainsi que deux SNP non signalés auparavant dans l’intron 3, distants de 20 nt et ≈350 pb en aval du centre du VNTR (Fig. 1). Compte tenu du niveau élevé de polymorphisme VNTR identifié dans cet échantillon initial, un reséquençage PCR plus étendu de 600 allèles VNTR de l’exon 3, obtenus à partir d’un échantillon de population mondial (réf. 3 et 17 ; tableau 1 ; Fig. 2), a été réalisé. Cet échantillon contenait des individus représentant la plupart des grandes origines géographiques (voir Méthodes). La majorité des individus étaient hétérozygotes, et les deux produits PCR alléliques ont pu être séparés par électrophorèse sur gel avant le séquençage, fournissant des haplotypes non ambigus. Au total, nous avons criblé plus de 450 000 pb d’ADN génomique et 2 968 répétitions de 48 pb.

Dans les 600 chromosomes séquencés, 56 haplotypes différents ont été trouvés (tableau 1). Ces haplotypes étaient composés de 35 motifs variants distincts de 48 pb (figure 2), dont 19 ont été rapportés précédemment (désignés α-ξ dans la figure 2 ; réf. 2). Nous proposons que ces motifs variants 48-bp de DRD4 reçoivent des numéros comme indiqué plutôt que les lettres utilisées précédemment (2), car il n’y a pas assez de caractères dans l’alphabet grec. Nous proposons que les variants de l’exon 3 de DRD4 soient désignés dans le format indiqué, c’est-à-dire que l’allèle 4R le plus commun soit désigné 4R(1-2-3-4), etc.

Nous avons intentionnellement sur-échantillonné les allèles non-4R d’environ 2 fois, car peu de variation de séquence a été découverte dans l’allèle 4R commun (tableau 1) même s’il représente 65% de la fréquence de la population mondiale (3, 17). La plupart des haplotypes de cet échantillon (85,7 %) ont été trouvés à des fréquences inférieures à 1 % (tableau 1). Si l’on examine la diversité nucléotidique parmi les variants définis par leur numéro VNTR, les allèles communs 2R, 4R et 7R présentent la plus faible diversité, avec 78,2, 95,2 et 88,9 % des allèles respectivement représentés par les haplotypes 2R(1-4), 4R(1-2-3-4) et 7R(1-2-6-5-2-5-4) les plus communs (tableau 1). En revanche, bien que les allèles 3R, 5R, 6R et 8R soient plus rares, ils présentent proportionnellement plus de variantes (tableau 1). Ce schéma inhabituel de diversité des allèles n’est manifestement pas un simple effet de longueur, c’est-à-dire que les allèles les plus longs présentent une plus grande diversité. De nombreux haplotypes rares spécifiques à une population ont été observés. Par exemple, l’haplotype 2R(30-4) trouvé uniquement dans l’échantillon Surui (Amérique du Sud) et l’haplotype 5R(1-3-2-3-4) trouvé uniquement dans l’échantillon chinois Han (Asie) (tableau 1 et figure 2).

Le modèle de variation nucléotidique observé dans les haplotypes VNTR n’est pas aléatoire (figure 2). La plupart des variants de la séquence d’ADN modifient la séquence d’acides aminés, parfois de manière assez spectaculaire (c’est-à-dire de Gln à Pro ; Fig. 2). Bien que beaucoup de ces variants soient des événements mutationnels liés (ci-dessous), on peut tenir compte de ces relations en calculant Ka/Ks (le rapport du nombre de remplacements d’acides aminés par site divisé par l’estimation du nombre de changements synonymes). Les valeurs de Ka/Ks supérieures à 1 sont généralement considérées comme un indicateur rigoureux de sélection positive au niveau du segment d’ADN observé (22, 23). Pour une séquence répétée en tandem, de nombreuses relations supposées peuvent être déduites, et donc différents rapports Ka/Ks peuvent être calculés. Cependant, pour toutes les relations supposées des variantes de DRD4, Ka/Ks > 1. Par exemple, en supposant que les motifs 1-6 variants les plus abondants (Fig. 2) ont tous une origine commune et que la diversité a été générée par mutation et recombinaison (ci-dessous), on obtient une valeur Ka/Ks de 3. L’extension de cette analyse pour inclure la divergence entre espèces (une méthode puissante pour améliorer ces calculs) n’est pas possible en raison de la génération rapide de novo de la variation dans ce VNTR dans les lignées de primates (28).

Les approches standard pour définir les relations évolutives entre ces haplotypes ne sont pas applicables en raison de la nature répétitive de la séquence d’ADN (23). Cependant, sur la base des séquences d’ADN observées et de leurs variations nucléotidiques, il est facile de proposer une origine simple pour la majorité de ces haplotypes (Fig. 3 ; Tableau 1). Les événements de recombinaison/mutation en une étape entre les allèles les plus courants peuvent expliquer la quasi-totalité de la variation observée des allèles 2R-6R. La Fig. 3 est un schéma simplifié des événements de recombinaison les plus courants proposés. Bien que la séquence nucléotidique inférée d’un DRD4 ancestral ne puisse être déterminée, tous les allèles d’une espèce particulière de primate semblent être dérivés d’un ancêtre commun relativement récent (28). L’allèle 4R le plus répandu est proposé comme l’allèle progéniteur humain, sur la base (i) des données de séquence limitées rapportées pour les allèles 4R de DRD4 chez les primates (28), (ii) du plus faible niveau de DL pour les polymorphismes entourant cet allèle (comme discuté ci-dessous), et (iii) de la disposition des motifs de séquence des allèles non 4R. Une recombinaison inégale entre deux allèles 4R(1-2-3-4) produirait les allèles communs 2R-6R observés (Fig. 3). La position du croisement détermine la séquence résultante. Par exemple, les allèles 3R(1-7-4) et 3R(1-2-4) les plus courants ne diffèrent que par la position du croisement, soit à l’intérieur, soit après la deuxième répétition (Fig. 3 ; Tableau 1). Ainsi, la fréquence élevée connue de recombinaison inégale entre les répétitions en tandem (29) peut expliquer la majeure partie de la diversité observée du gène DRD4.

En plus des croisements inégaux, des mutations ponctuelles uniques sont évidentes dans cet échantillon de population (tableau 1 et figure 2). Par exemple, à une exception près, tous les allèles 2R du monde entier ont la séquence 2R(1-4) (tableau 1). Les 12 allèles 2R reséquencés à partir de l’ADN Surui (Amérique du Sud) se sont avérés contenir une seule mutation ponctuelle, l’allèle 2R(30-4) (Tableau 1 et Fig. 2). Cette mutation, un changement de C en T dans la première répétition, ne modifie pas la séquence d’acides aminés et a probablement une origine récente (moins de 10 000-20 000 ans) (24).

En revanche, la formation des allèles 7R et supérieurs observés ne peut pas être expliquée par de simples événements de recombinaison/mutation en une étape à partir de l’haplotype 4R(1-2-3-4) (Fig. 3). La génération d’un allèle 7R à partir de l’allèle 4R le plus répandu nécessiterait au moins une recombinaison et six mutations. Même en tenant compte d’événements de conversion génétique plus compliqués, de multiples étapes à faible probabilité sont nécessaires pour convertir un allèle 4R en un allèle 7R (Fig. 3). Par exemple, le motif central à cinq variantes que l’on trouve dans l’haplotype commun 7R(1-2-6-5-2-5-4) pourrait être produit par une recombinaison entre deux allèles 4R. La recombinaison entre le motif terminal à quatre variantes d’un allèle 4R et le motif initial à une variante du second allèle 4R donnerait un haplotype 7R(1-2-3-5-2-3-4) (Fig. 2). Trois mutations supplémentaires de chacun des deux motifs à trois variables de cet haplotype 7R putatif sont alors nécessaires pour produire l’haplotype 7R(1-2-6-5-2-5-4) actuel. Quatre de ces six changements nucléotidiques sont non synonymes et modifient la séquence d’acides aminés (Ser en Gly, Gln en Pro, Ala en Pro, et Ser en Gly ; Fig. 2). Bien que la conversion génique plutôt que la mutation puisse être proposée comme mécanisme pour « insérer » ces changements nucléotidiques dans un hypothétique allèle 7R(1-2-3-5-2-3-4), deux événements improbables, dont l’un impliquant la conversion génique de l’allèle 7R-7R, seraient nécessaires (Figs. 2 et 3).

Aucun de ces haplotypes 7R « intermédiaires » putatifs n’a été observé dans cet échantillon de population mondial. Notre échantillon comprenait 47 allèles 7R séquencés à partir d’individus d’origine africaine censés contenir les populations présentant la plus grande diversité génétique et le plus grand âge (24). Il est donc peu probable que des haplotypes 7R intermédiaires existent à une fréquence élevée. Nous n’avons cependant pas l’intention de proposer une origine spécifique de l’allèle 7R de DRD4. Nous souhaitons plutôt souligner que, sur la base de l’analyse de la séquence d’ADN, l’allèle 7R de DRD4 semble bien distinct des allèles 2R-6R courants. Il est impossible de déterminer si l’origine de l’allèle DRD4 7R a été un événement unique, hautement improbable, ou une série d’événements improbables (Fig. 3).

Quoi qu’il en soit du mécanisme d’origine de l’allèle DRD4 7R, il est clairement capable de participer à des événements de recombinaison avec les autres allèles. La plupart des rares haplotypes 7R observés semblent être des événements de recombinaison, principalement avec l’allèle commun 4R(1-2-3-4) (tableau 1). Par exemple, l’haplotype 7R(1-2-6-5-2-3-4) semble être une recombinaison entre un allèle 4R(1-2-3-4) et un allèle 7R(1-2-6-5-2-5-4) (tableau 1 et figure 2). Cette origine a été confirmée par l’analyse des SNP situés en dehors de la région de recombinaison (voir ci-dessous). De plus, l’origine de certains des rares allèles 5R et 6R et de tous les allèles 8R et supérieurs peut être expliquée par des recombinaisons impliquant un allèle 7R, car ils contiennent le motif à six variantes unique à l’allèle 7R (Fig. 2 et Tableau 1). Cependant, bon nombre de ces allèles 8R et plus semblent avoir des origines plus compliquées d’après l’analyse des séquences d’ADN (tableau 1 et figure 2).

Ce modèle (figure 3) explique l’anomalie apparente dans la diversité observée des haplotypes notée ci-dessus (tableau 1), où l’allèle 4R le plus abondant (et ancien, voir ci-dessous) présente la plus faible diversité nucléotidique. Si la recombinaison est le générateur prédominant de la diversité, alors la majorité des événements de recombinaison 4R-4R devraient avoir une séquence nucléotidique inchangée. De tels événements ne peuvent être déduits que par la recombinaison de marqueurs extérieurs. Ce n’est que lorsque la recombinaison hors registre se produit que de nouveaux variants de séquence (et de longueur) nucléotidique sont générés (Fig. 3). Le schéma observé de la diversité des haplotypes est cohérent avec un système à prédominance  » 2 allèles  » (4R et 7R), la plupart des variants plus rares étant générés par recombinaison à partir de ces deux haplotypes (Fig. 3).

La nature inhabituelle de l’organisation de la séquence de l’allèle 7R de DRD4, suggérant qu’il est apparu comme un événement mutationnel rare, nous a conduit à déterminer si des différences de DL existent entre les allèles 4R et 7R. L’haplotype de deux SNP introniques adjacents (G/A-G/C ; Fig. 1) a pu être déterminé directement, car ils étaient présents sur le même produit PCR utilisé pour amplifier le 48-bpVNTR. Un fort DL a été trouvé entre la paire de SNP A-C et l’allèle 7R (Fig. 3). Quatre-vingt-dix-sept pour cent des allèles 7R étaient associés à la paire de SNP A-C (66 sur 68 examinés). Les deux allèles 7R associés aux SNP G-G étaient des haplotypes recombinants 7R-4R tels que déterminés à l’origine par l’analyse de la séquence d’ADN (ci-dessus). En revanche, les paires de SNP G-G et A-C sont toutes deux associées aux allèles 4R de DRD4 (487 allèles examinés). Cependant, la paire G-G est la plus fréquente, représentant 86,1% de l’échantillon africain mais jusqu’à 98,6% de notre échantillon asiatique.

Tous les allèles 7R africains étaient associés aux haplotypes A-C, alors que seulement 13,9% des allèles 4R africains étaient associés à l’haplotype A-C. L’analyse de la séquence d’ADN de plusieurs échantillons de chimpanzés et de bonobos (données non présentées) indique que la paire de SNP G-G est probablement la séquence ancestrale (Fig. 3). Il semble donc que l’allèle original 7R de DRD4 soit apparu sur ce fond de SNP A-C plus rare. Un échantillon de 73 allèles 2R, 3R, 5R et 6R a montré une association approximativement égale avec les SNP G-G et A-C, ce qui est cohérent avec leur origine recombinatoire proposée à partir des allèles 4R et 7R (Fig. 3). De manière intéressante, les 26 échantillons asiatiques d’allèles 2R examinés ont tous montré une association avec les SNP A-C, ce qui suggère leur origine à partir de recombinaisons impliquant des allèles 7R (Fig. 3).

Des résultats similaires ont été obtenus pour des polymorphismes d’insertion/délétion de promoteur et d’exon 1 plus éloignés (Fig. 1). Dans ce cas, l’association a été déduite indirectement des données obtenues pour nos études de population antérieures (3, 17) et de l’analyse PCR d’un sous-ensemble des individus utilisés dans cette étude. Pour 40 échantillons où l’ADN parental était également disponible et pouvait être génotypé pour ces marqueurs, la phase a pu être inférée directement. Une forte association a été observée entre le polymorphisme long (dupliqué) du promoteur L1 (Fig. 1) et l’allèle 7R (Fig. 3), 90,8 % des allèles 7R étant associés à L1 (607 allèles analysés). En revanche, le polymorphisme L1 est couplé à seulement 61,9 % des allèles 4R (2 102 allèles analysés). Bien que des variations spécifiques aux populations aient été observées (par exemple, plus de couplage L1-4R dans les populations chinoises que dans les populations africaines), peu de liaison globale L1-4R a été détectée (Fig. 3). Le polymorphisme L2 plus proche dans l’exon 1 (Fig. 1) était associé à 93,4 % des allèles 7R et à 86,4 % des allèles 4R, une différence relative similaire à celle observée pour l’association L1-7R et L1-4R. Le polymorphisme L2/S2 se trouve toutefois dans une région codante, et des contraintes sélectives peuvent également influencer la fréquence des allèles (30).

Les méthodes standard d’estimation du temps de coalescence pour ces allèles ne sont pas applicables, étant donné la nature répétitive de la région et la fréquence de recombinaison élevée. Cependant, les calculs de l’âge des allèles basés sur la fréquence relativement élevée de la population mondiale des allèles DRD4 4R et 7R suggèrent que ces allèles sont anciens (>300 000 ans ; réf. 25 et 26 ; voir Méthodes). D’autre part, les calculs de l’âge des allèles basés sur la variabilité intra-allélique observée (réf. 26 et 27 ; voir Méthodes) suggèrent que l’allèle 7R est 5 à 10 fois plus  » jeune  » (30 000 à 50 000 ans). Des écarts aussi importants entre les âges des allèles calculés par ces deux méthodes sont généralement considérés comme la preuve que la sélection a augmenté la fréquence de l’allèle à des niveaux plus élevés que ceux prévus par la dérive génétique aléatoire (26). Les valeurs absolues de ces estimations sont grandement affectées par les hypothèses utilisées dans leurs calculs, par exemple la fréquence de recombinaison supposée (26). Nous avons utilisé des estimations prudentes de la fréquence de recombinaison basées sur la moyenne observée pour les 20 mégabases terminales de 11p (31). Compte tenu de la forte recombinaison observée à ce locus (tableau 1 et figure 3), il est probable que l’âge réel de l’allèle 7R soit encore plus jeune, et des analyses de DL supplémentaires permettront d’affiner ces estimations. La conclusion importante, cependant, est que, quels que soient les paramètres supposés, les différences d’âge relatif des allèles 4R et 7R calculées à partir de la variabilité intra-allélique restent importantes, alors que leur fréquence de population suggère qu’ils sont tous deux anciens.

L’hypothèse la plus simple pour expliquer (i) le biais observé dans les changements de nucléotides (Ka/Ks), (ii) l’organisation inhabituelle de la séquence de l’allèle 7R de DRD4, et (iii) le fort DL entourant cet allèle est que l’allèle 7R est apparu comme un (ou des) événement(s) mutationnel(s) rare(s) qui a néanmoins augmenté jusqu’à une fréquence élevée par sélection positive. Les allèles avantageux prennent généralement beaucoup de temps pour atteindre une fréquence de 0,1, puis augmentent rapidement pour atteindre des fréquences élevées (>0,9). Bien qu’il soit possible que nous observions l’expansion récente d’un allèle 7R très avantageux, nous suggérons qu’il est plus probable que ce système DRD4 à deux allèles (Fig. 3) soit un exemple de sélection équilibrée. Une telle sélection pourrait être plus répandue dans le génome humain qu’on ne le pense généralement (24). Un modèle de sélection équilibrée propose que les allèles 4R et 7R soient maintenus à des fréquences élevées dans les populations humaines. Divers mécanismes pourraient être proposés pour cette sélection équilibrée, allant de l’avantage hétérozygote à la sélection dépendant de la fréquence (24). Selon la théorie des jeux évolutifs (32), le gain évolutif d’un type particulier de personnalité dépend de la distribution existante des types de personnalité. Par exemple, une forte agressivité peut conduire à une fitness élevée si presque tout le monde est doux, mais peut entraîner une fitness faible lorsqu’elle est très courante, car les individus agressifs subiraient les pénalités de conflits fréquents. On pourrait s’attendre à ce que ce type de sélection dépendant de la fréquence s’applique à de nombreux types de variations psychologiques, y compris celles associées à ce récepteur de neurotransmetteur particulier (4-9).

Les explications alternatives à la sélection positive proposée, telles que les goulots d’étranglement aléatoires récents, l’expansion de la population, et/ou le mélange de populations (24) sont moins susceptibles de rendre compte des résultats observés. Des goulots d’étranglement se sont certainement produits au cours de la migration et de l’évolution de l’homme (33-35) et ont sans aucun doute influencé la fréquence actuelle de l’allèle DRD4 dans le monde. De nombreuses études de population sur d’autres gènes (24, 33, 35) ont montré qu’un rétrécissement de la diversité des allèles  » hors Afrique  » (et une augmentation du DL) a probablement eu lieu. Dans la présente étude, une plus grande diversité (et un DL plus faible) a été trouvée pour les allèles 4R de DRD4 africains par rapport au reste de notre échantillon de population, ce qui est cohérent avec l’hypothèse hors d’Afrique (24). Bien que l’on puisse soutenir que la fréquence de l’allèle 7R a été augmentée par hasard pendant l’expansion hors d’Afrique, cette théorie n’explique pas le manque inhabituel de diversité des allèles 7R africains. L’haplotype le plus courant L1L2-7R(1-2-6-5-2-5-4)-A-C (Fig. 3) se trouve à des fréquences comparables à celles trouvées dans le monde entier (>85%). Il est difficile d’imaginer quel type de goulot d’étranglement pourrait produire de tels résultats, c’est-à-dire un fort DL mondial pour un seul allèle (DRD4 7R), mais peu de DL pour les autres allèles. Un modèle cohérent avec les résultats observés est l’hypothèse d’un  » jardin d’Eden faible  » (24), dans lequel l’allèle DRD4 4R serait supposé être ancien et présent dans les populations indigènes, tandis que l’allèle 7R a été répandu par l’expansion hors (et dans) l’Afrique. Dans une hypothèse de jardin d’Eden aussi faible, la sélection positive pour l’allèle DRD4 7R doit encore être proposée.

Bien que nous suggérions qu’une origine mutationnelle récente et une sélection positive expliquent le mieux les données de l’allèle DRD4 7R, une autre possibilité ne peut être exclue. Compte tenu des événements de recombinaison/mutation hautement improbables nécessaires pour générer l’allèle 7R à partir de l’allèle 4R, une possibilité qui mérite d’être considérée est l’importation de cet allèle à partir d’une lignée d’hominidés étroitement apparentée. On ne peut que spéculer sur cette lignée, mais les populations néandertaliennes étaient présentes à peu près au moment où l’allèle 7R est apparu. Selon ce modèle, le temps de coalescence des allèles 4R et 7R serait donc ancien, l’importation n’ayant eu lieu que récemment, comme le montre le DL. Évidemment, des travaux expérimentaux supplémentaires peuvent clarifier ces spéculations.

Pour le locus DRD4, il est peu probable que la sélection pour un gène adjacent puisse expliquer la sélection proposée, étant donné la séquence d’ADN distincte et inhabituelle de l’allèle 7R de DRD4 lui-même. Si l’allèle DRD4 7R est apparu il y a ≈40 000 ans, on peut se demander ce qui se passait à ce moment-là dans l’histoire de l’humanité. Il est tentant de spéculer que l’expansion majeure des humains qui s’est produite à cette époque, l’apparition d’une technologie radicalement nouvelle (le paléolithique supérieur) et/ou le développement de l’agriculture (24), pourraient être liés à l’augmentation de la fréquence de l’allèle DRD4 7R. Peut-être que des individus présentant des traits de personnalité tels que la recherche de nouveauté, la persévérance, etc. ont été à l’origine de l’expansion (et du remplacement partiel). La spéculation selon laquelle la migration pourrait expliquer la distribution actuelle de l’allèle 7R a été proposée (34). En plus de cette sélection phénotypique, la sélection sexuelle pourrait également opérer. Selon la définition initiale de Darwin (36),  » tout avantage que certains individus ont sur d’autres du même sexe et de la même espèce uniquement en ce qui concerne la reproduction  » entraînera une augmentation de la descendance. Si les individus porteurs de l’allèle DRD4 7R présentent des traits de personnalité/cognitifs qui leur confèrent un avantage (partenaires sexuels multiples, probabilité plus élevée de sélection du partenaire, etc.), la fréquence de cet allèle augmentera rapidement en fonction du milieu culturel. Les différences culturelles peuvent peut-être expliquer une partie des différences observées dans la fréquence de l’allèle DRD4 7R (3). De toute évidence, la détermination de la nature exacte de la sélection DRD4 et de sa base biochimique et comportementale attend de nouvelles expériences. Des expériences récentes indiquant que les personnes atteintes de TDAH et possédant cet allèle DRD4 7R inhabituel obtiennent des résultats normaux aux tests neuropsychologiques critiques d’attention par rapport à d’autres probands de TDAH (6) indiquent mais un des nombreux domaines d’investigation future.

On peut se demander pourquoi un allèle qui semble avoir subi une forte sélection positive dans les populations humaines est néanmoins maintenant représenté de manière disproportionnée chez les personnes diagnostiquées avec le TDAH. L’hypothèse de la variante commune/du trouble commun (16) propose que la variation génétique commune est liée à la maladie commune soit parce que la maladie est le produit d’un nouvel environnement (de sorte que les génotypes associés au trouble n’ont pas été éliminés dans le passé), soit parce que le trouble a de faibles effets sur la condition physique (parce qu’il se manifeste tardivement). Pour les troubles à apparition précoce (tels que l’autisme, le TDAH, etc.), nous suggérons d’envisager la possibilité que les allèles prédisposants fassent en fait l’objet d’une sélection positive et n’entraînent des effets délétères que lorsqu’ils sont associés à d’autres facteurs environnementaux/génétiques. Dans ce contexte, il est possible que les contraintes sélectives antérieures n’opèrent plus sur ce gène. Il est également possible de spéculer, cependant, que les traits mêmes qui peuvent être sélectionnés chez les individus possédant un allèle DRD4 7R peuvent prédisposer à des comportements qui sont jugés inappropriés dans le cadre typique de la classe et donc diagnostiqués comme TDAH.