Mode de vie nécrotrophe de Rhizoctonia solani AG3-PT pendant l’interaction avec sa plante hôte, la pomme de terre, révélé par l’analyse du transcriptome

Analyse du transcriptome

L’interaction interspécifique entre R. solani AG3-PT isolat Ben3 avec le cultivar de pomme de terre moyennement résistant ‘Arkula’ a été analysée au niveau du transcriptome en utilisant le séquençage de l’ARN. Afin de trouver les facteurs importants pour l’établissement de l’interaction et sa progression, nous avons utilisé trois échantillonnages différents : mycélium pur de l’isolat Ben3 de R. solani AG3-PT cultivé sans être attiré par un plant de pomme de terre en croissance (Ben3) ; germes de pomme de terre à 3 dpi des tubercules avec R. solani (précoce) et à 8 dpi (tardif). Aux deux dates d’échantillonnage de R. solani en interaction avec le germe de pomme de terre, tous les germes émergents ont été récoltés et utilisés dans l’analyse. Les lésions nécrotiques sur les pousses deviennent visibles à partir de 8 dpi. Ensuite, l’extraction de l’ARN, le séquençage de l’ARN (RNAseq) et la cartographie des lectures au génome de l’isolat Ben334 ont été effectués pour calculer les valeurs de lectures par kilobase par million de lectures cartographiées (RPKM). En général, pour les échantillons inoculés, entre 1 et 23 % de chaque ensemble de données a été mappé sur le génome préliminaire de Ben3. Pour les échantillons témoins, entre 70 et 75% de ces ensembles de données ont pu être mappés sur le génome Ben3.

Dans les trois échantillonnages, un nombre comparable de gènes a pu être détecté comme étant exprimé (tableau 1). Dans le mycélium pur, 11 206 gènes sur les 12 567 gènes identifiés sur le génome Ben3 de l’isolat AG3-PT de R. solani étaient exprimés, tandis que des lectures ont pu être cartographiées sur 10 181 et 9 939 gènes à 3 dpi et 8 dpi, respectivement. En résumé, dans tous les transcriptomes au sein de cette expérience, 11 287 gènes sur les 12 567 gènes identifiés sur le génome de R. solani AG3-PT isolat Ben3 ont été exprimés dans l’un ou l’autre des échantillons analysés.

Comme évident à partir du tableau 1, les quantités de lectures cartographiées totales diffèrent considérablement. Cela est dû au fait que dans l’échantillonnage Ben3, le transcriptome du mycélium pur de l’isolat Ben3 de R. solani AG3-PT a été séquencé, tandis que dans les échantillonnages précoces et tardifs (3 et 8 dpi), une approche RNAseq double a été utilisée pour accéder simultanément aux transcriptomes des deux organismes en interaction30. Étant donné que la taille des bibliothèques et la quantité de séquences produites à partir de chaque bibliothèque étaient comparables, dans l’échantillonnage de Ben3, presque toutes les lectures ont pu être reliées au génome de l’isolat Ben3. Dans les approches RNAseq doubles des échantillonnages à 3 et 8 dpi, seule une fraction des lectures produites a pu être cartographiée au génome Ben3, tandis que les autres ont principalement été cartographiées au génome de la pomme de terre. En raison de ces différentes quantités de lectures totales mappées au génome Ben3 de l’isolat AG3-PT de R. solani par échantillonnage, il faut considérer ce qui suit : (1) les gènes avec une faible valeur RPKM uniquement dans Ben3 ne sont pas nécessairement non exprimés lorsque le champignon défie la plante, cela pourrait être juste dû à la taille des bibliothèques ; (2) les gènes qui se trouvent exprimés dans les trois échantillonnages pourraient être attribués comme étant communément exprimés ; (3) les gènes qui ne se trouvent exprimés que dans les bibliothèques beaucoup plus petites des échantillonnages de 3 et 8 dpi peuvent être supposés comme étant spécifiques à l’interaction.

Les résultats de cartographie résumés (tableau 1) indiquaient déjà qu’il doit y avoir de nombreux gènes communément exprimés dans les trois échantillonnages. Par conséquent, un diagramme de Venn a été construit pour comparer les trois échantillonnages et visualiser le nombre calculé de gènes qu’ils ont en commun par rapport au nombre de gènes qui distingue les échantillonnages individuels (Fig. 1). Plus de 9000 gènes ont été trouvés exprimés dans les trois échantillonnages, tandis que 871 étaient exclusivement transcrits dans le mycélium sans contact avec la plante. L’expression de 29 gènes a été trouvée en commun dans les échantillons de 3 et 8 dpi, représentant des gènes uniquement exprimés en présence de la plante de pomme de terre vivante. En outre, à 3 dpi, 27 gènes étaient exclusivement exprimés, et les lectures de séquences correspondant à un petit ensemble de 21 gènes étaient exclusivement détectables à 8 dpi. Les listes de ces gènes ainsi que leurs valeurs RPKM respectives et leurs descriptions sont données dans les tableaux supplémentaires 1 – 4.

Parmi les 29 gènes qui étaient couramment exprimés en présence du plant de pomme de terre vivant, quatre gènes codent pour des protéines impliquées dans la dégradation de la paroi cellulaire végétale. Cela correspond à la stratégie de virulence d’un pathogène nécrotrophe avec la sécrétion d’enzymes dégradant la paroi cellulaire pour induire la nécrose de la cellule hôte et la fuite des nutriments21. De plus, un gène codant pour une protéine impliquée dans la dégradation des protéines soutient encore cette ligne d’attaque. De plus, deux gènes codant pour des protéines ayant des domaines de liaison à l’ADN et une fonction putative dans la régulation transcriptionnelle figurent également dans cette liste et sont susceptibles de jouer un rôle dans la régulation transcriptionnelle de l’infraction (par exemple Ben3g4553, voir Tableau 2). La majorité des 27 gènes exclusivement exprimés à 3 dpi codent pour des protéines hypothétiques auxquelles aucune fonction putative ne peut être attribuée. Parmi les 21 gènes qui ont été exclusivement exprimés aux stades ultérieurs de l’interaction (8 dpi), huit gènes codent pour des protéines impliquées dans la dégradation de la paroi cellulaire végétale et deux codent pour des protéases. Cela démontre à nouveau la stratégie typique d’un pathogène nécrotrophe.

En résumé, un premier examen des données du transcriptome des trois échantillonnages a révélé des différences distinctes et raisonnables, démontrant ainsi le potentiel de cette étude pour trouver des facteurs importants pour l’établissement de l’interaction entre R. solani AG3-PT isolée Ben 3 avec un cultivar de pomme de terre sensible et la progression ultérieure de l’interaction.

Les transcrits les plus abondants de R. solani AG3-PT dans les trois échantillonnages

L’interaction interspécifique entre R. solani AG3-PT isolée Ben 3 avec le cultivar de pomme de terre moyennement résistant ‘Arkula’ a été initialement évaluée en examinant les transcrits les plus abondants dans les trois différents échantillonnages. Dans le mycélium en croissance cultivé en culture liquide, les transcriptions de 11 206 gènes du génome de l’isolat Ben3 ont été trouvées. Au total, 698 transcrits de ces gènes ont été détectés avec des valeurs médianes RPKM de 100 et plus, 37 avec des valeurs médianes RPKM supérieures à 1 000. À la phase d’interaction précoce (3 dpi) des germes de tubercules avec le pathogène, les transcriptions de 10 181 gènes ont été détectées, 729 présentant des valeurs RPKM médianes de 100 et plus, 25 des valeurs RPKM médianes supérieures à 1 000. Un certain nombre de 9 939 gènes de R. solani AG3-PT ont été transcrits, 742 présentant des valeurs médianes de RPKM de 100 et plus, 26 valeurs médianes de RPKM supérieures à 1 000 à 8 dpi (tableaux supplémentaires 5-7). Au total, 9 679 gènes du génome de l’isolat Ben3 ont été trouvés exprimés dans les trois échantillonnages, parmi lesquels figurent les transcrits les plus abondants dans chacun des échantillonnages individuels analysés. Cinq de ces gènes les plus exprimés (Ben3g9573, Ben3g6448, Ben3g5323, Ben3g2326 et Ben3g675) codent pour des protéines hypothétiques spécifiques de R. solani dont les fonctions sont inconnues. Par conséquent, on ne s’attendait pas à ce que ces protéines jouent des rôles spécifiques pendant l’interaction avec la plante, ces protéines peuvent plutôt être importantes pour la croissance générale et le métabolisme cellulaire. Parmi les transcrits les plus abondants dans chacun des échantillons individuels, on trouve également plusieurs protéines contenant des domaines de lectine (Ben3g9146, Ben3g9350, et Ben3g8869). Un certain nombre de ces protéines contenant un domaine de lectine bêta-trèfle de type ricin ont également été signalées précédemment comme étant les plus abondantes dans l’isolat 7/3/14 de R. solani AG1-IB pendant l’interaction avec sa plante hôte, la laitue30. Bien que les rôles spécifiques de ces protéines à domaine lectine soient indéterminés, il a été proposé que les lectines de R. solani puissent avoir une fonction de protéine de stockage dans le mycélium37. En outre, deux gènes codant pour des protéines à domaine toxine de thuringiensis (Ben3g8806, et Ben3g11931) ont également été fortement transcrits dans les trois échantillons analysés. Les toxines de Bacillus thuringiensis sont des protéines bactériennes connues pour leur activité biocide contre les insectes38, mais une série d’autres organismes sont également visés39. La forte expression de ces homologues du domaine de la toxine chez R. solani indique que ces toxines peuvent avoir une importance générale pour l’isolat Ben3 de R. solani AG3-PT plutôt que de jouer un rôle spécifique dans l’interaction champignon-plante. Un gène codant pour une protéine de bouchon de pore septal (Ben3g7115) figurait également parmi les transcrits les plus abondants dans les trois échantillonnages, ce qui indique sa contribution à l’homéostasie hyphale chez les champignons basidiomycètes40. Un transcrit similaire à la protéine du bouchon du pore septal (RSOLAG1IB_6054) était également très abondant dans les transcriptions de l’isolat AG1-IB de R. solani 7/3/14 trouvées dans la zone d’interaction sans symptômes avec la laitue30. Cette protéine spécifique de R. solani fait partie du matériel de bouchage qui ferme les perforations à l’intérieur du couvercle du pore septal des cellules hyphales et empêche le transport des fluides cytoplasmiques entre les cellules voisines. De plus, un gène codant pour une protéine du domaine de l’hémopexine (Ben3g6614) figurait également parmi les gènes les plus exprimés en commun aux trois échantillonnages. Ce domaine désigne les métalloprotéinases zinc-dépendantes, qui sont largement reconnues pour jouer un rôle important dans la régulation homéostatique de l’environnement extracellulaire41, mais leurs fonctions biologiques peuvent également s’étendre au-delà de la dégradation de la matrice extracellulaire42. Puisque toutes ces protéines ont montré une abondance élevée dans R. solani AG3-PT avec et sans contact avec la plante hôte, elles peuvent être importantes pour la croissance et le métabolisme global mais ne semblent pas avoir une pertinence spécifique dans l’interaction fongique avec la plante.

L’interaction entre R. solani AG3-PT et la pomme de terre

Afin de trouver des éléments pertinents pour soutenir l’interaction de l’isolat Ben3 de R. solani AG3-PT avec le germe de pomme de terre, l’expression différentielle des gènes a été réalisée telle qu’intégrée dans la plateforme ReadXplorer (v2.2)43. Cette comparaison par paires des transcriptomes du mycélium pur de l’isolat Ben3 avec les transcriptomes de 3 dpi ou 8 dpi d’interaction avec les germes de pomme de terre a été réalisée à l’aide du programme DESeq2. Les gènes ont été considérés comme différentiellement exprimés avec une valeur P ajustée inférieure à 0,05 et un changement de pli minimum de |2| ou plus. En utilisant ces critères, 592 gènes ont pu être désignés comme différentiellement induits à 3 dpi (somme de 242 gènes exclusivement induits précocement et 350 gènes induits à 3 dpi et également à 8 dpi ; early up) tandis que 520 gènes sont différentiellement réduits à 3 dpi (somme de 412 gènes exclusivement réduits précocement et 108 gènes réduits à 3 dpi et également à 8 dpi ; early down). À 8 dpi, 688 transcrits ont été trouvés différentiellement induits (somme de 338 gènes exclusivement induits tardivement et 350 gènes induits à 8 dpi et aussi à 3 dpi ; late up) et 233 sont différentiellement réduits (somme de 125 gènes exclusivement réduits tardivement et 108 gènes réduits à 8 dpi et aussi à 3 dpi ; late down). Des diagrammes de Venn ont été construits pour comparer et visualiser les gènes différentiellement régulés à la hausse et à la baisse aux deux moments de l’interaction (Fig. 2). Les listes de ces gènes ainsi que leurs valeurs respectives de changement de pli sont données dans les tableaux supplémentaires 8-9.

Les différences d’expression trouvées avec cette analyse DESeq2 ont été validées dans des expériences utilisant la qRT-PCR. Par conséquent, un gène de contrôle approprié avec un modèle d’expression invariable doit être établi. Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (Ben3g7151, GAPDH), enzyme conjuguée à l’ubiquitine E2 (EUC63156, UBC), ubiquitine-protéine ligase E3 (Ben3g494, UBI), facteur d’élongation 2 (Ben3g3364, EF-2) et gènes de la tubuline bêta (Ben3g4099 ; TUB1) et (Ben3g5288, TUB2) ont été testés et le gène de la tubuline bêta Ben3g5288 (TUB2) s’est révélé être la référence la plus appropriée dans nos expériences. Les niveaux de transcription relatifs de trois gènes candidats présentant des profils d’expression différents ont été normalisés sur la base de l’expression de ce contrôle invariant. Les valeurs ΔΔCq ont été calculées et comparées avec l’analyse DESeq2 respective (tableau 2).

Pour tous les trois gènes candidats avec un modèle d’expression très différent, les valeurs ΔΔCq calculées étaient conformes aux valeurs de changement log2fold respectives calculées dans l’analyse DESeq2, démontrant ainsi la validation des différences d’expression.

En outre, les annotations de l’ontologie des gènes (GO) ont été effectuées afin d’attribuer des fonctions respectives aux gènes particuliers. Dans la suite de l’analyse, un accent spécifique a été mis sur les gènes significativement induits afin d’attraper préférentiellement les candidats moléculaires qui pourraient être importants pour l’initiation et l’établissement de l’interaction avec la plante.

Gènes exprimés de façon différentielle (DEG) dans l’isolat Ben3 à 3 dpi de germes de pomme de terre

Les gènes induits de façon différentielle dans l’isolat Ben3 en interaction avec les germes de pomme de terre à 3 dpi par rapport au mycélium pur de l’isolat ont été sélectionnés en supposant des fonctions dans l’initiation et le soutien du processus d’interaction avec les germes de pomme de terre. Les fonctions putatives des produits génétiques particuliers et leur distribution dans les aspects GO communs pour le processus biologique (BP), la fonction moléculaire (MF) et le composant cellulaire (CC) sont données dans la figure 3.

A 3 dpi, les gènes différentiellement induits sont principalement attribués comme étant impliqués dans les processus métaboliques des glucides et des composés azotés cellulaires et dans le transport. Près de 10 % (50 gènes) des gènes différentiellement régulés codent pour diverses activités peptidases (par exemple Ben3g2070, voir le tableau 2), tandis que 53 gènes codent pour des enzymes dégradant la paroi cellulaire, notamment plusieurs hydrolases différentes agissant sur les liaisons glycosyles, et des pectate lyases (par exemple Ben3g3530, voir le tableau 2) ou des xylanases. Afin de préciser davantage ces enzymes de dégradation de la paroi cellulaire, tous les DEG ont également été annotés selon la base de données Carbohydrate Active enZyme (CAZy) (Tableau supplémentaire 11). La sécrétion d’un large arsenal d’enzymes hydrolytiques telles que les protéases et les enzymes de dégradation de la paroi cellulaire au cours de l’interaction44,45 est nécessaire pour que les champignons phytopathogènes nécrotrophes comme R. solani puissent induire une nécrose cellulaire par la dégradation des protéines structurelles et des composants glucidiques des parois cellulaires des plantes et provoquer une fuite des nutriments9,30,46,47. Ainsi, on suppose que les enzymes de dégradation de la paroi cellulaire et plusieurs des peptidases induites fonctionnent en favorisant l’interaction de R. solani AG3-PT avec les tissus du germe de pomme de terre. Cependant, les peptidases sécrétées ont également été largement étudiées pour leur rôle d’effecteurs des bactéries gram-négatives48 et des champignons47,49. Les effecteurs des agents pathogènes sont généralement délivrés en tant que facteurs de virulence dans les cellules hôtes afin de supprimer les réponses de défense basale et de créer un environnement propice à la propagation des agents pathogènes50,51,52. Ainsi, la modification post-traductionnelle des protéines de l’hôte par traitement protéolytique est un mécanisme largement utilisé pour réguler la réponse de défense des plantes. Dans l’état actuel des connaissances, on pourrait supposer qu’une ou plusieurs de ces protéases induites ont des rôles putatifs en tant qu’effecteurs qui soutiennent l’interaction de R. solani AG3-PT sur la pomme de terre hôte. Cependant, d’autres analyses fonctionnelles des protéases individuelles sont nécessaires pour attribuer clairement leur rôle fonctionnel dans l’interaction hôte-pathogène.

Un autre grand groupe composé de 100 membres de gènes différentiellement régulés de l’interaction à 3 dpi est décrit comme codant pour des protéines hypothétiques. La plupart de ces gènes sont spécifiques de R. solani et des homologues pourraient être trouvés dans les cinq autres génomes annotés de R. solani AG3 Rhs1AP, R. solani AG2-2IIIB, R. solani AG8, et R. solani AG1-IA et AG1-IB. D’après notre analyse d’expression différentielle des gènes, on s’attend à ce que certains de ces gènes soient impliqués dans le soutien de l’interaction de R. solani AG3-PT sur le germe de pomme de terre. Il est déjà connu que les effecteurs sécrétés des pathogènes fongiques ciblent l’immunité de l’hôte en utilisant diverses stratégies, par exemple en hydrolysant un précurseur de l’acide salicylique53, ou en se liant à des facteurs de transcription, inhibant ainsi leur activité54. D’autres analyses sont nécessaires pour révéler les fonctions putatives des protéines jusqu’à présent hypothétiques pour leurs différents rôles possibles dans l’interaction de R. solani AG3-PT avec la pomme de terre.

Intéressant, le gène le plus fortement augmenté de façon différentielle (Ben3g6247) est homologue aux protéines de la famille des exportateurs de lipides-translocations (LTE), comme RTA1 de Saccharomyces. La protéine RTA1 contient sept segments membranaires potentiels55 et est considérée comme une protéine membranaire intégrale ayant une fonction dans la résistance cellulaire aux xénobiotiques56. D’autres gènes de la famille LTE peuvent coder des transporteurs ou des capteurs qui facilitent l’excrétion des intermédiaires biosynthétiques, directement ou indirectement56. Ces fonctions putatives des protéines de la famille LTE font du gène Ben3g6247 un candidat favori impliqué dans la sécrétion de composants importants pour l’attaque du pathogène.

La phase précoce de l’interaction nécrotrophe est associée à la mort cellulaire de la plante hôte et à la production de divers métabolites secondaires et à l’accumulation d’espèces réactives de l’oxygène21. Il a été démontré que les processus antioxydants et l’expression génétique respective étaient corrélés aux tissus nécrotiques dans plusieurs pathosystèmes de R. solani (germe de pomme de terre-R. solani AG3 ; hypocotyle de soja-R. solani AG4 et feuilles de soja-R. solani AG1-IA)27. Au début de l’interaction de l’hôte de la pomme de terre avec l’isolat Ben3 (3 dpi), aucune preuve solide de l’induction de processus antioxydants dans les hyphes du pathogène n’a pu être observée au niveau transcriptionnel, car il n’y a pas eu de forte augmentation de l’expression du gène de la glutathion S-transférase ou de régulation à la hausse d’autres gènes connus pour être impliqués dans le piégeage des espèces réactives de l’oxygène. Par conséquent, on pourrait postuler que dans notre système de colonisation du germe de pomme de terre avec R. solani AG3-PT, l’analyse des tissus à 3 dpi ressemble à un stade précoce de l’interaction plante-pathogène, peut-être une infection préalable des tissus du germe. Aucun symptôme visible n’a été observé à ce moment.

Gènes différentiellement exprimés dans l’isolat Ben3 à 8 dpi des germes de pomme de terre

Afin de trouver les transcriptions qui sont importantes dans un stade avancé de l’interaction, les gènes différentiellement induits entre le mycélium pur de l’isolat Ben3 et Ben3 attiré par les germes de pomme de terre à 8 dpi ont été criblés. Les annotations fonctionnelles respectives des produits des gènes et leur répartition dans les caractéristiques GO communes sont présentées dans la figure 4. À 8 dpi, les gènes différentiellement induits sont principalement attribués comme étant impliqués dans les processus métaboliques glucidiques et macromoléculaires et dans le transport. À ce stade ultérieur de l’interaction, les 152 gènes régulés à la hausse (> 22%) codent pour diverses enzymes de dégradation de la paroi cellulaire (par exemple Ben3g3530, voir tableau 2). En outre, tous les DEG ont également été annotés selon la base de données Carbohydrate Active enZyme (CAZy) (tableau supplémentaire 11). Cette expression accrue des gènes codant pour les enzymes hydrolytiques de la paroi cellulaire démontre bien l’activité pathogène croissante de l’isolat Ben3 ainsi que l’importance de la dégradation des composants de la paroi cellulaire pour accéder aux nutriments au cours de l’interaction, confirmant ainsi la stratégie de virulence décrite d’un pathogène nécrotrophe21,57. Cette tactique destructrice s’est accompagnée d’une induction de l’expression des gènes codant pour les composants intégraux des membranes. Ces 154 protéines membranaires intégrales non caractérisées et transporteurs putatifs étaient vraisemblablement impliqués dans l’absorption des nutriments et des produits de dégradation des activités hydrolases. À ce stade de l’interaction, l’importance prédominante des gènes codant pour des peptidases semble diminuer, mais 33 gènes codant pour des peptidases ont tout de même été différentiellement régulés à la hausse (par exemple Ben3g2070, voir tableau 2). Cela pourrait également s’expliquer par le fait que des pousses entières ont été récoltées, y compris les pousses ayant eu jusqu’à 8 jours d’interaction avec l’agent pathogène et les pousses émergentes ultérieures ayant eu une période d’interaction plus courte. En général, ceci est également représenté dans les 350 gènes qui étaient en commun différentiellement augmentés à 3 et 8 dpi (Fig. 2).

En outre, un autre grand groupe de DEG à 8 dpi est composé de 98 gènes à fonction inconnue. Comme ces gènes sont spécifiques de Rhizoctonia sans aucune région de similarité avec des séquences ayant des fonctions assignées, on ne peut que spéculer sur leur rôle dans le soutien de l’interaction pathogène-plante. D’autres comparaisons fonctionnelles de ces gènes et, par exemple, leur expression différentielle dans les systèmes pathogènes respectifs pourraient donner des indices sur leur fonction putative.

Dans le système expérimental décrit ici pour coloniser le germe de pomme de terre avec l’isolat Ben3 de R. solani AG3-PT, les lésions deviennent visibles pour la première fois à 8 dpi. Il a été montré dans d’autres expériences25,27 que l’interaction nécrotrophe et la mort cellulaire dans la plante hôte étaient corrélées avec l’expression génétique respective dans la plante et dans le champignon. Samsatly et ses collègues27 ont démontré, en utilisant la RT-PCR quantitative, que l’expression des gènes antioxydants codant pour la glutathione S-transférase et la catalase était significativement augmentée chez R. solani AG3 cinq jours après l’inoculation de pousses de pomme de terre détachées. Mais une telle augmentation de l’expression de ces gènes antioxydants n’a pas été trouvée dans les expériences décrites ici. Les raisons de ces différences pourraient être dues à l’inoculation avec des isolats de R. solani AG3 présentant des différences de pathogénicité. Cependant, une autre distinction est le fait que Samsatly et ses collègues27 ont réalisé des expériences avec des pousses détachées dans un système in vitro limité alors que notre dispositif expérimental reflète pleinement les conditions de l’environnement in vivo avec des pousses en croissance sur des tubercules de semences cultivés. Des recherches supplémentaires ainsi que l’analyse concomitante du transcriptome dans l’hôte de la pomme de terre permettront finalement d’accroître la compréhension d’une relation mutuelle dans l’interaction hôte-pathogène dans un environnement ressemblant à la situation naturelle.

Gènes différentiellement exprimés dans l’isolat Ben3 comparant 3 et 8 dpi de germes de pomme de terre

Pour différencier R. solani AG3-PT qui étaient principalement pertinents au point de temps précoce et ceux devenant plus importants à des stades avancés de l’interaction, les gènes différentiellement exprimés entre 3 et 8 dpi de l’interaction ont également été analysés avec DESeq2. En utilisant les critères mentionnés ci-dessus avec des valeurs P ajustées inférieures à 0,05 et un changement de pli minimum de |2| ou plus, 173 gènes ont pu être attribués comme exprimés de manière différentielle réduite entre 3 et 8 dpi, tandis que 400 gènes sont exprimés de manière différentielle accrue au point de temps ultérieur. Les listes complètes de ces gènes, ainsi que leurs valeurs moyennes de base et leurs valeurs de changement de pli respectives, sont présentées dans le tableau supplémentaire 10. Les listes des 20 gènes les plus différentiellement exprimés entre 3 et 8 dpi sont présentées dans les tableaux 3 et 4. Alors que 10 des 20 gènes les plus différentiellement réduits exprimés entre 3 et 8 dpi codent pour des protéines impliquées dans la dégradation des protéines et l’absorption et l’assimilation de l’azote (Tableau 3), la majorité des gènes différentiellement augmentés exprimés entre 3 et 8 dpi sont impliqués dans la dégradation des polysaccharides avec un accent sur les monooxygénases polysaccharidiques lytiques dépendantes du cuivre pour le clivage des chaînes de cellulose avec oxydation de divers carbones (Tableau 4).

Il est connu que le métabolisme de l’azote et l’expression des gènes régulés par l’azote dans les champignons phytopathogènes est d’une grande importance pour l’établissement de la maladie dans la plante hôte58. Cependant, le nitrate est la source d’azote la moins préférée par rapport à l’ammonium et à la L-glutamine en ce qui concerne l’utilisation des nutriments chez les champignons, au moins pendant l’infection des feuilles59. Chez les champignons, cette utilisation préférentielle des nutriments est régulée par la répression des métabolites azotés et assure la transcription des gènes codant pour la perméase active de l’ammonium et de l’urée. Outre la forte expression transitoire des gènes codant pour les perméases de transport de l’ammonium et des composés azotés (Ben3g6147, Ben3g6767, Ben3g4369 et Ben3g7775) au stade précoce de l’interaction à 3 dpi, l’isolat Ben3 de R. solani AG3-PT a également exercé une forte induction et expression des gènes impliqués dans l’absorption et l’assimilation du nitrate (Ben3g6360, Ben3g6359 et Ben3g6361). Qu’il s’agisse d’un trait distinctif de l’isolat Ben3 ou d’une caractéristique des champignons phytopathogènes du sol nécessiterait des investigations supplémentaires.

La majorité des gènes dont l’expression a différentiellement augmenté entre 3 et 8 dpi sont impliqués dans la dégradation de la paroi cellulaire codant pour des hydrolases agissant sur les liaisons glycosyl, et des pectate lyases. Ceci était attendu et démontre à nouveau l’importance croissante de la dégradation des composants de la paroi cellulaire désignant la stratégie de virulence d’un pathogène nécrotrophe21.