Les cryptochromes

Les horloges biologiques circadiennes sont des oscillateurs biochimiques qui effectuent des cycles environ toutes les 24 heures et qui peuvent être remis à zéro (entraînés) par l’exposition à la lumière et à d’autres signaux environnementaux. Chez les animaux, il existe un oscillateur central dans le cerveau qui contrôle le comportement circadien de l’organisme entier, ainsi que des oscillateurs périphériques dans certains tissus. L’oscillation résulte d’une boucle de rétroaction transcriptionnelle impliquant un ensemble de facteurs de transcription de l’horloge, dont le facteur temps (Tim), le facteur période (Per), le facteur horloge (Clk) et le facteur Bmal1, ainsi que les cryptochromes. Les cryptochromes sont exprimés de façon ubiquitaire dans les organes et les tissus de tous les organismes, et ce sont généralement des protéines nucléaires qui régulent l’expression des gènes. Les cryptochromes animaux les mieux étudiés sont le cryptochrome Cry de la drosophile et les cryptochromes Cry1 et Cry2 de la souris , et les deux cryptochromes CRY1 et CRY2 d’Arabidopsis ont également été largement étudiés.

Cryptochromes de la drosophile

Le Cry de la drosophile est une protéine principalement nucléaire qui médiatise la régulation de l’horloge circadienne par la lumière , bien qu’elle puisse également être trouvée dans le cytosol . Elle régule l’horloge circadienne en interagissant directement avec la protéine Tim pour supprimer la boucle de rétroaction négative de l’horloge (Figure 3a). La lumière stimule l’interaction Cry-Tim, ce qui favorise l’ubiquitination et la dégradation dépendante des protéosomes de Tim et réprime la formation de l’hétérodimère Per-Tim. L’inhibition d’un hétérodimère des protéines Clock et Cycle par l’hétérodimère Per-Tim est ainsi levée et la phase de l’oscillation circadienne est réinitialisée (Figure 3a). Cependant, le cryptochrome n’est apparemment pas le seul photorécepteur qui entraîne l’horloge circadienne chez la drosophile. La rythmicité comportementale de la mouche crybmutante, qui est dépourvue de la fonction Cry, peut néanmoins être entraînée en réponse à la lumière, à moins que la transduction du signal par le pigment visuel ne soit également éliminée . En plus de son rôle de photorécepteur pour l’entraînement de l’oscillateur central de la drosophile, Cry a également un rôle indépendant de la lumière dans le fonctionnement de l’oscillateur circadien périphérique .

Cryptochromes des mammifères

Les deux fonctions du Cry de la drosophile – comme photorécepteur pour l’entraînement de l’horloge circadienne avec les pigments visuels et comme composant intégral du complexe protéique de l’oscillateur circadien – sont également des caractéristiques des cryptochromes des mammifères. Les cryptochromes de mammifères sont principalement des protéines nucléaires, mais on peut également les trouver dans le cytosol. Comme le Cry de la drosophile, les cryptochromes des mammifères remplissent des fonctions dépendantes et indépendantes de la lumière dans la régulation de l’horloge circadienne. Plusieurs observations démontrent le rôle dépendant de la lumière des protéines Cry des mammifères. Les souris knock-out dépourvues d’un ou des deux gènes Cry ont une capacité réduite ou abolie à induire l’expression de gènes tels que per et le protooncogène c-fos en réponse à la lumière. De plus, les pupilles des souris mutantes dépourvues à la fois de Cry1 et de Cry2 présentent des réponses réflexes réduites à la lumière .

D’autre part, la souris double mutante cry1 cry2 présente une rythmicité apparemment normale dans des conditions de cycle lumière-obscurité, mais elle perd la rythmicité instantanément et complètement dans des conditions de fonctionnement libre (toujours dans l’obscurité) . Ces observations indiquent que les protéines Cry jouent une fonction essentielle et indépendante de la lumière dans l’oscillateur circadien central des mammifères, et que les cryptochromes ne sont pas les seuls photorécepteurs à assurer le contrôle de l’horloge par la lumière. Le fait que les cryptochromes fassent partie intégrante de l’oscillateur central de la souris rend presque impossible de tester directement leur rôle dans l’entraînement de l’horloge par la lumière. Néanmoins, il a été constaté que, de manière quelque peu analogue à la situation chez la drosophile, le mutant cry de la souris conserve sa capacité de médiation de l’entrée de lumière à moins que la fonction des pigments visuels ne soit également perturbée en même temps. Les souris triple-mutantes portant des mutations des deux cryptochromes ainsi qu’une mutation dégénérative de la rétine sont presque arythmiques dans des conditions de cycle lumière-obscurité. Ces résultats démontrent que les protéines Cry des mammifères sont effectivement impliquées dans la régulation de l’horloge circadienne par la lumière, mais que leur rôle dans l’entraînement de l’horloge circadienne par la lumière est assuré de manière redondante par d’autres photorécepteurs. Il semble clair maintenant que les photorécepteurs supplémentaires agissant avec les cryptochromes pour l’entraînement de l’oscillateur circadien des mammifères sont les opsines visuelles du cône bâtonnet et la protéine apparentée mélanopsine .

Comme Cry de drosophile, les cryptochromes des mammifères interagissent physiquement avec les protéines de l’horloge, y compris les régulateurs de transcription de liaison au promoteur Per, Clk et Bmal1 (Figure 3b). Contrairement aux Cry de la drosophile, les protéines Cry des mammifères sont des composants de la boucle de rétroaction négative de l’horloge circadienne (Figure 3b). L’interaction physique du cryptochrome avec les autres composants de l’horloge affecte leur activité, leur interaction, leur dégradation ou leur trafic nucléaire, et modifie par conséquent la régulation transcriptionnelle des gènes de l’horloge. Mais l’interaction entre les cryptochromes et d’autres protéines de l’horloge telles que Per, Clk et Bmal1 ne semble pas être affectée par la lumière, ce qui suggère que de telles interactions ne peuvent pas être le mécanisme de photo-entraînement de l’horloge circadienne, comme elles le sont chez la drosophile. En plus de la régulation directe de la transcription via une interaction physique avec les régulateurs de transcription se liant au promoteur, les cryptochromes peuvent également affecter l’horloge circadienne en participant à la régulation des modifications des histones , mais la façon dont cela fonctionne reste à élucider.

Arabidopsiscryptochromes

Arabidopsis CRY1 et CRY2 sont des protéines principalement nucléaires qui médient la régulation de l’expression des gènes et l’entraînement de l’horloge circadienne en réponse à la lumière . CRY1 et CRY2 jouent des rôles majeurs dans la photomorphogenèse des plantes, comme l’inhibition de l’élongation des tiges par la lumière bleue, la stimulation de l’expansion des feuilles par la lumière bleue, et la régulation de l’initiation florale par la longueur du jour . Il semble que les cryptochromes contrôlent les changements de développement des plantes par le biais de changements de l’expression génétique en réponse à la lumière. CRY1 et CRY2 sont ensemble responsables des changements de l’expression génique dépendant de la lumière bleue jusqu’à 10-20% du génome d’Arabidopsis .

Il existe au moins deux mécanismes par lesquels les cryptochromes peuvent affecter les changements de l’expression génique nucléaire en réponse à la lumière. Premièrement, une molécule de cryptochrome peut interagir avec des protéines associées à la machinerie transcriptionnelle pour affecter directement la transcription. Arabidopsis CRY2 se lie à la chromatine d’une manière indépendante de la séquence d’ADN ( et M. Maymon et C.L., observations non publiées), mais on ne sait pas comment une protéine interagissant avec la chromatine et indépendante de la séquence peut réguler l’expression des gènes. Contrairement aux cryptochromes animaux dont on a montré qu’ils régulaient la transcription via des interactions physiques avec des régulateurs de transcription se liant au promoteur, aucune interaction de ce type n’a été signalée pour les cryptochromes végétaux. Un modèle alternatif est que les cryptochromes végétaux peuvent interagir avec des protéines exerçant d’autres fonctions cellulaires pour réguler la stabilité, la modification, le trafic cellulaire des régulateurs de transcription. Par exemple, on a découvert que les cryptochromes végétaux interagissent avec une ubiquitine ligase E3, COP1, ce qui suggère que les cryptochromes végétaux peuvent agir d’une manière qui n’a pas encore été découverte pour les cryptochromes animaux. En accord avec ce point de vue, il a également été découvert récemment que les cryptochromes d’Arabidopsis interviennent dans la suppression par la lumière bleue de la dégradation dépendante du protéasome d’un important régulateur floral, CONSTANS . La façon exacte dont les cryptochromes font cela doit être étudiée plus avant.

Mécanisme

Le mécanisme catalytique des cryptochromes n’a pas été complètement élucidé, mais certains indices peuvent être trouvés dans le mécanisme des photolyases CPD, où le FAD joue le rôle catalytique principal . Dans une réaction de réparation de l’ADN, la CPD photolyase se lie au dimère de pyrimidine de l’ADN et le « retourne » de l’intérieur du duplex d’ADN vers la cavité d’accès au FAD de l’enzyme, pour former un complexe stable. L’autre chromophore (ptérine ou déazaflavine), également appelé chromophore « antenne », absorbe les photons de lumière bleue ou UV-A et transfère l’énergie d’excitation à la flavine du FAD. La flavine, à l’état excité, donne un électron au dimère de pyrimidine pour scinder le cycle cyclobutane. L’électron est retransféré à la flavine dans ce processus, ce qui entraîne la régénération de la flavine à l’état fondamental. Le dinucléotide réparé ne rentre plus dans la cavité d’accès au FAD et se dissocie donc de la photolyase. Le rôle exact du FAD et de la cavité d’accès au FAD dans la fonction des cryptochromes n’est pas clair, mais il est concevable qu’il puisse également être impliqué dans les réactions de transfert d’électrons.

Bien que la région PHR qui contient le(s) chromophore(s) soit la partie la plus conservée des protéines, il a été démontré que le domaine carboxy-terminal a un rôle dans la fonction ou la régulation des cryptochromes animaux et végétaux. L’expression des domaines carboxy-terminaux des cryptochromes d’Arabidopsis fusionnés à l’enzyme marqueur b-glucuronidase confère une réponse de croissance constitutive à la lumière, même dans l’obscurité, en l’absence de la région PHR. En revanche, les régions PHR des cryptochromes de la drosophile et du xénope sont physiologiquement actives en l’absence du domaine carboxy-terminal. Le domaine carboxy-terminal du Cry de Drosophila est important pour la stabilité de la protéine, l’interaction avec Tim, et la sensibilité du photorécepteur aux signaux lumineux circadiens , tandis que le domaine carboxy-terminal du Cry de Xenopus est nécessaire pour sa localisation nucléaire .

Les cryptochromes sont régulés par la phosphorylation. Il a été montré que les cryptochromes d’Arabidopsis sont phosphorylés en réponse à la lumière bleue et que cela est associé à la fonction et à la régulation des photorécepteurs . De plus, lorsque le CRY1 d’Arabidopsis a été exprimé dans des cellules d’insecte, il a subi une autophosphorylation dépendante de l’ATP et de la lumière bleue. On ne sait pas si les cryptochromes animaux se lient également à l’ATP, bien qu’il ait été démontré que les cryptochromes de souris sont phosphorylés .

L’interaction entre la région PHR de CRY1 d’Arabidopsis et l’ATP présente quelques caractéristiques intéressantes qui rappellent l’interaction entre le dimère de pyrimidine et la photolyase : les groupes phosphates de l’ATP sont exposés au solvant ; les fragments adénine et ribose sont enfouis profondément dans la cavité d’accès au FAD ; et l’ATP peut avoir un contact médié par l’eau avec le FAD . L’interaction de la région CRY1 pHR d’Arabidopsis avec l’ATP est également dépourvue de plusieurs caractéristiques communément trouvées dans les interactions protéine-ATP, telles que l’interaction protéine-phosphate, le contact protéine-Mg2+ et un résidu sérine proche pour le transfert de phosphore. Un examen de la topologie de la structure de la région PHR de CRY1 montre, cependant, que toutes ces caractéristiques pourraient potentiellement être fournies par le domaine carboxy-terminal du cryptochrome (Figure 4). L’observation que les domaines carboxy-terminaux riches en sérine des cryptochromes d’Arabidopsis fusionnés à la β-glucuronidase sont constitutivement phosphorylés in vivo (, suggère qu’un phosphotransfert peut se produire de l’ATP lié à la cavité d’accès au FAD au domaine carboxy-terminal voisin (Figure 4a). Il est également concevable que le FAD excité par des photons puisse déclencher un transfert d’électrons vers le nucléotide et un phosphotransfert de l’ATP vers les résidus de sérine du domaine carboxy-terminal. Comme la surface de la région PHR est principalement chargée négativement, surtout à l’endroit où le domaine carboxy-terminal est susceptible d’interagir avec elle, le domaine carboxy-terminal phosphorylé serait alors repoussé de la surface de la région PHR, ce qui entraînerait un changement de conformation du cryptochrome. Ce changement de conformation lui permettrait d’interagir avec d’autres protéines de signalisation et de propager le signal lumineux (Figure 4a). Alternativement, une autre molécule de cryptochrome se liant à la cavité d’accès au FAD peut également fournir les caractéristiques manquantes nécessaires à une interaction ATP-cryptochrome productive. En effet, l’interaction CRY2-CRY2 et l’interaction CRY1-CRY2 peuvent toutes deux être détectées chez Arabidopsis (D. Shalitin, X. Yu et C.L., observations non publiées). La formation d’un homo-oligomère ou d’un hétéro-oligomère de cryptochromes fournirait un mécanisme de phosphotransfert intermoléculaire, ce qui pourrait modifier la structure des cryptochromes (Figure 4b, c).

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