Le test clonogénique a été utilisé dans de nombreuses études pour quantifier la croissance clonogénique et son abrogation par des stimuli cytotoxiques, y compris les rayonnements, les médicaments chimiothérapeutiques et/ou les agents moléculairement ciblés, in vitro. La procédure standard actuelle pour déterminer les fractions de survie est basée sur l’hypothèse que la croissance clonogénique dans les cultures cellulaires traitées peut être normalisée par rapport aux contrôles non traités via la division par un PE constant spécifique à la lignée cellulaire.
Nous montrons ici, cependant, que cela n’est pas universellement applicable. Au contraire, nos données indiquent clairement que la corrélation entre le nombre de cellules ensemencées dans une boîte de culture et le nombre de colonies obtenues est loin d’être toujours linéaire. Pour les lignées cellulaires au comportement coopératif, l’analyse des données de survie clonogénique basée sur le PE a donné des résultats comportant des erreurs intrinsèques au test allant de grandes à énormes. Même si l’on n’utilisait pour l’analyse que des boîtes de culture contenant un nombre raisonnable de colonies (C = 5 à 100), les fractions de survie clonogénique à une dose donnée différaient de beaucoup plus d’un ordre de grandeur pour les lignées cellulaires présentant des degrés élevés de coopération cellulaire. Il convient de noter que pratiquement n’importe quelle courbe de survie (raide ou plate, modérément ou fortement incurvée, linéaire, quadratique ou irrégulière) peut être dérivée de cette gamme de résultats calculés à partir de l’ensemble de données donné – une observation qui pourrait être d’une importance particulière pour les biologistes des rayonnements.
Ensemble, nos données montrent que l’analyse conventionnelle basée sur le PE des données de survie clonogénique fonctionne de manière inappropriée dès que la coopération cellulaire se produit dans une ou plusieurs conditions au sein d’une expérience, et les résultats de survie extraits varieront dans une gamme insatisfaisante. Plus précisément, les résultats seront fortement faussés si seulement une ou quelques densités cellulaires similaires sont placées. Cette pratique génère des erreurs intrinsèques à l’essai qui sont une conséquence directe des densités cellulaires choisies et ne se prêtent donc pas à des analyses d’erreurs statistiques. Dans le cas des lignées cellulaires à croissance coopérative, nos observations peuvent expliquer en partie les incongruences signalées entre les essais, les chercheurs et les laboratoires en ce qui concerne les données sur la réponse au traitement. Une méta-analyse des données de l’essai de formation de colonies de l’A549 vient étayer cette hypothèse : Dans un panel de 156 études différentes, Nuryadi et al. ont rapporté des valeurs de SF4 pour cette lignée cellulaire spécifique allant de 5 à 90 % avec un écart interquartile de SF4 de plus de 25 % . Bien que divers autres paramètres puissent certainement influencer les données relatives à la réponse au traitement, nous concluons à partir de nos données que la coopération cellulaire est un facteur majeur expliquant la variabilité inter-études. Puisque même de petites différences dans les fractions de survie clonogénique peuvent encourager les chercheurs à postuler et à étudier de nouvelles hypothèses scientifiques qui pourraient éventuellement être basées sur une fausse précision, nous avons développé une nouvelle approche d’analyse qui est moins sensible à l’impact de la densité cellulaire – en particulier mais pas seulement pour les lignées cellulaires à croissance coopérative. Cette méthode tient compte des relations non linéaires entre les nombres de cellules ensemencées et les nombres de colonies obtenus en notant les boîtes de culture avec une large gamme de nombres de cellules ensemencées pour toutes les conditions de traitement.
Mathématiquement, notre approche utilise la régression de puissance et l’interpolation des nombres appariés de colonies à différentes doses d’irradiation. Appliquée au même ensemble de données que celui qui a été utilisé pour les calculs basés sur le PE, elle a fourni des résultats nettement plus stables et indépendants de la densité cellulaire. Les lecteurs attentifs auront peut-être remarqué que les calculs de la fraction de survie effectués selon la méthode présentée ici reposent uniquement sur le coefficient a et l’exposant b extraits par régression de puissance. Bien que cette méthode compense évidemment les effets de la coopération cellulaire, elle comporte une autre qualité d’erreur qui découle de l’imprécision de la régression et qui ne peut pas être comparée quantitativement à la qualité d’erreur similaire dans les calculs de fraction de survie basés sur le PE. Par conséquent, cette erreur doit être minimisée en veillant à une conception expérimentale minutieuse avec un nombre suffisant de répliques indépendantes. En outre, les calculs de fraction de survie ne devraient être effectués qu’avec des résultats de régression de puissance de performance appropriée, comme indiqué par le coefficient de régression R.
Notre approche mathématique remplace fondamentalement les calculs de survie clonogénique basés sur le PE par la question suivante :
Combien de fois plus de cellules doivent être ensemencées dans une boîte de culture traitée pour produire le même nombre de colonies que dans une boîte de contrôle ?
L’exposant b est particulièrement important à cet égard. Il indique si la corrélation entre le nombre de cellules ensemencées et le nombre de colonies comptées est linéaire (b ≈ 1) ou non. Des valeurs b élevées, comme celles obtenues pour les cellules BT20 et SKLU1, indiquent que la croissance cellulaire in vitro est ralentie (ou entièrement abrogée) si le volume de milieu de culture par cellule est augmenté – soit par l’utilisation de grands volumes d’essai, soit par la réduction du nombre de cellules ensemencées. Il convient de souligner que les valeurs b ne sont en aucun cas spécifiques d’une certaine lignée cellulaire, mais qu’elles sont plutôt la conséquence du milieu de culture cellulaire choisi, de plusieurs paramètres d’incubation de l’essai et de la procédure expérimentale, y compris pratiquement tous les aspects susceptibles d’affecter la croissance clonale des cellules qui se trouvent dans une situation de stress extrême lorsqu’elles sont ensemencées en tant que cellules individuelles, comme la formulation du milieu, l’apport de nutriments et de facteurs de croissance, les méthodes utilisées pour la séparation des cellules, les récipients en plastique, etc. Par exemple, l’utilisation de milieux conditionnés provenant de cellules BT20 quasi-confluentes a fortement atténué le comportement coopératif des cellules BT20 individuelles, alors que cette procédure n’a eu aucun impact sur la croissance clonogénique des cellules MDA-MB231 en croissance non coopérative. En outre, le temps de doublement des cellules BT20 coopératives dépendait à la fois du temps d’incubation du test et de la densité cellulaire dans le puits, ce qui donne une explication biologique évidente aux fractions de survie clonogénique imprécises obtenues par les calculs basés sur le PE : Le taux de croissance d’un groupe de cellules en prolifération peut simplement être trop lent pour atteindre le seuil de 50 cellules par colonie pendant la durée d’incubation du test. Par conséquent, la « non-clonalité » apparente d’un groupe de 35 cellules à prolifération lente au moment de l’arrêt de l’essai n’est qu’une conséquence inévitable du temps d’incubation de l’essai, qui est choisi arbitrairement, du moins dans une certaine mesure. Dans ce contexte, nous avons en outre analysé l’impact du temps d’incubation sur les fractions de survie clonogénique obtenues et avons observé qu’il est insuffisant de déterminer le point d’arrêt par l’inspection des plats de contrôle uniquement, comme suggéré par d’autres : La fin prématurée de la période d’incubation peut conduire à des fractions de survie excessivement basses sur les plats avec un traitement plus agressif où la réparation des dommages avant la poursuite de la croissance cellulaire nécessite un temps supplémentaire.
Important, nos données sont entièrement conformes aux découvertes séminales des chercheurs pionniers de la culture cellulaire dans les années 1940 et 1950 et reflètent simplement un phénomène qui faisait l’objet d’une étude approfondie à l’époque. Puck et ses collègues ont été les premiers à publier une courbe de survie de cellules uniques irradiées en 1956. Cependant, le plus grand défi scientifique à cette réalisation fondamentale était un problème non résolu à l’époque, celui de la culture des cellules de mammifères : Les lignées cellulaires cessaient de croître in vitro dès que les cellules étaient placées à faible densité. Une tentative de surmonter ce problème a été faite en 1948 par Sanford et al. qui ont réussi à cultiver des colonies de fibroblastes à cellule unique dans de petits capillaires où la diffusion des facteurs dérivés des cellules dans le milieu était fortement réduite, permettant ainsi une stimulation suffisante de la croissance autocrine. Ils ont identifié l’importance du pré-conditionnement du milieu de culture par les cellules cultivées et ont conclu qu’un milieu de culture cellulaire suffisant pour permettre la croissance infinie d’une culture cellulaire à haute densité est en fait « loin d’être optimal pour la croissance d’une seule cellule ». Dans le même ordre d’idées, Earle et al. ont décrit que l’ensemencement du type de cellule concerné à une très faible densité entraînait la mort cellulaire, et ce travail a servi de base à la première publication sur la croissance clonogénique des cellules de mammifères in vitro par Puck et Marcus en 1955. Inspirés par le besoin d’un milieu de culture conditionné pour faciliter la croissance de cellules uniques, ils ont utilisé un système de co-culture de cellules uniques HeLa et une couche de cellules nourricières fortement irradiées du même type. En accord avec les études précédentes, ils ont conclu que l’inhibition de la croissance des cellules uniques dans de grands volumes d’essai était due à la « perte d’un facteur diffusible à courte durée de vie ». Dans des publications ultérieures, comme celle présentant la première courbe de survie de cellules de mammifères irradiées, Puck et ses collègues ont fréquemment omis l’utilisation de couches nourricières, car ils avaient développé des techniques de culture avancées permettant la croissance unicellulaire avec 100 % de PE sans supplémentation en facteur de croissance par des cellules nourricières. Ils ont déclaré que des protocoles de lavage et de trypsinisation minutieux étaient essentiels à cet égard et ont inventé le terme « action coopérative » pour décrire le fait que les cellules d’une boîte de culture peuvent différer en termes de génotype et d’état physiologique. Nos résultats récapitulent ces observations : Au sein d’un panel de 50 lignées cellulaires cancéreuses, nous avons observé que la croissance sous-optimale de cellules uniques dans des milieux de culture modernes et standardisés complétés par du FCS est encore un phénomène très courant, comme on peut le déduire de la constatation que plus de la moitié des lignées cellulaires ont montré un comportement de croissance coopérative. Par conséquent, si des PE sous-optimaux sont trouvés pour une certaine lignée cellulaire, le test clonogénique est susceptible de détecter simultanément l’influence du traitement d’intérêt et l’impact de la coopération cellulaire. Il n’était pas dans le cadre de cette étude d’identifier les facteurs spécifiques de soutien de la croissance qui pourraient affecter le PE des lignées cellulaires analysées. Cependant, nous émettons l’hypothèse que des conditions de croissance sous-optimales pour les cellules uniques d’une lignée cellulaire donnée peuvent résulter de paramètres très différents, tels que de faibles concentrations de facteurs de croissance classiques et/ou d’hormones (par exemple, le facteur de croissance épidermique ou les œstrogènes), mais aussi de divers métabolites de poids moléculaire faible ou élevé pour lesquels au moins une fraction des cellules uniques présente une auxotrophie. En outre, l’apport de nutriments aux cellules uniques dans une boîte de culture sera probablement influencé par les paramètres physico-chimiques du milieu environnant et du matériel en plastique, notamment le degré de liaison protéique des facteurs auxotrophes respectifs ou leur adsorption à la surface du plastique. En théorie, ce problème pourrait être résolu en prenant des mesures qui rétablissent le PE maximal dans des conditions de faible densité de sorte qu’une corrélation linéaire entre S et C soit (ré)établie (b = 1). Les recommandations de Puck concernant l’utilisation de cellules nourricières, de milieux conditionnés et/ou l’inclusion de cellules individuelles dans de la gélose molle peuvent suffire à atteindre cet objectif pour certaines lignées cellulaires et devraient augmenter en conséquence la robustesse des calculs basés sur le PE. Cependant, il est évident qu’il peut être plus que difficile d’affiner et de normaliser les conditions de l’essai afin que les taux de survie et de croissance des cellules uniques soient optimaux pour chaque type de cellule d’intérêt. Nous avons décidé d’accepter des conditions de test sous-optimales pour la croissance des cellules uniques et avons plutôt développé une méthode de calcul pour l’analyse des données de survie clonogénique qui tient compte de ce phénomène bien décrit. De toute évidence, notre approche, qui fait appel à la régression et à l’interpolation de la puissance, dépassait les capacités techniques des années 1950, époque à laquelle les données de survie étaient ajustées à l’œil. Cependant, d’une manière ou d’une autre, la pertinence de la coopération cellulaire est passée au second plan au cours des décennies suivantes. Bien que quelques rapports sur la non-linéarité dans les essais de formation de colonies aient été rapportés au fil du temps, la performance limitée des analyses basées sur le PE n’a pas été abordée .
Intéressant, ces études ont rapporté une augmentation moins que linéaire du nombre de colonies avec un nombre croissant de cellules ensemencées pour certains types de cellules dans des conditions spécifiques. Conformément à cela, pour quelques lignées cellulaires de notre panel, nous avons également obtenu des valeurs b légèrement inférieures à 1,0. Trois scénarios différents peuvent expliquer cette observation, dont deux sont dus à des artefacts méthodologiques : Premièrement, les valeurs b légèrement inférieures à 1,0 peuvent résulter du comptage de puits avec un grand nombre de colonies envahissantes où les petites colonies sont négligées par le chercheur (voir les puits marqués par « nd » dans la Fig. 1a). Deuxièmement, la croissance cellulaire des boîtes avec un nombre élevé de cellules peut être inhibée à des stades assez précoces en raison d’un déclin rapide de la concentration en nutriments, ce qui entraîne des colonies avortées. Une troisième option, moins intuitive d’un point de vue biologique, est le comportement compétitif de la croissance cellulaire, dû par exemple à la sécrétion de facteurs inhibiteurs de croissance. Il est important de noter que l’un ou l’autre de ces phénomènes est pris en compte par l’approche de régression et d’interpolation, car elle tient compte de tout écart par rapport à la linéarité, tel que reflété par la valeur b.
De plus, il est remarquable que les valeurs b de diverses lignées cellulaires pour des conditions non traitées par rapport à des conditions irradiées ne soient pas identiques. Dans la majorité de ces cas, les valeurs b des cellules irradiées ont tendance à être plus élevées que les valeurs b respectives des témoins non traités, ce qui indique que la coopération cellulaire augmente lors de l’irradiation. Par conséquent, la gamme des valeurs de la fraction de survie obtenues pour C = 5 à 100 colonies devient plus large que dans le cas de valeurs b presque identiques (voir les lignées cellulaires HCC1806 et A549). Cela implique qu’il n’est techniquement pas possible d’extraire des valeurs de survie plus précises au moyen de la procédure de test clonogénique – à moins qu’un nombre fixe de colonies (C) ne soit sélectionné pour l’analyse. En outre, les lignées cellulaires présentant des valeurs b excessivement élevées pour les cellules traitées peuvent présenter un intérêt particulier pour les études de résistance aux traitements. Par exemple, le(s) facteur(s) de survie radio-induit(s) sécrété(s) par un certain type de cellule pourrait(ent) être identifié(s) en raison d’une valeur b élevée correspondante.
En résumé, nos données montrent la nécessité d’analyser soigneusement les données des expériences de formation de colonies et de prendre en compte l’impact sous-estimé de la coopération cellulaire sur les calculs de fraction de survie. Cela peut augmenter considérablement la fiabilité de l’essai clonogénique – et la résilience de toute hypothèse basée sur celui-ci.