Lignes cellulaires
Les lignes cellulaires et leurs sources sont les suivantes : 293T (ATCC CRL-11268), 786-O (ATCC CRL-1932), et HK-2 (ATCC CRL-2190). Les cellules THP-1 ont été aimablement fournies par la banque de cellules souches de l’Académie chinoise des sciences. Les cellules ont été cultivées dans un milieu DMEM (pour 293T et 786-O), MEM (pour HK-2) ou RPMI 1640 (THP-1) avec 10% de sérum bovin fœtal et 2 mM l-glutamine, à 37 °C en présence de 5% de CO2. Avant l’infection par les bactéries, le traitement par les protéines ou l’analyse de chimiotaxie, le milieu a été changé en milieu sans sérum.
Souches bactériennes et plasmides
Les souches bactériennes et les plasmides utilisés dans cette étude sont listés dans le tableau supplémentaire S3. Les souches d’E. coli ont été cultivées à 37 °C dans un milieu Luria-Bertani (LB) dans des conditions statiques pendant 12 h avec des antibiotiques appropriés lorsque nécessaire, aux concentrations suivantes : Kanamycine à 50 μg/ml, ampicilline à 100 μg/ml et chloramphénicol à 15 μg/ml. La souche ΔhlyA a été générée par la substitution de hlyA par un gène cat en utilisant la recombinase λ-Red. Pour générer la souche ∆hlyA p-hlyA, le gène hlyA a été amplifié par PCR à partir du chromosome de la souche UPEC CFT073 et ligaturé dans pTRC99A aux sites enzymatiques KpnI et XbaI, et le plasmide a été transformé en ∆hlyA par électroporation. Les gènes hlyC et hlyA de CFT073 ou l’ADN complémentaire (ADNc) codant pour la Nectin-2 ont été amplifiés par PCR et clonés dans pET-28a ( + ) pour produire des protéines recombinantes HlyA ou Nectin-2 actives marquées FLAG ou HA. Pour produire de la HlyA inactive étiquetée FLAG (pro-HlyA), le gène hlyA sans hlyC de CFT073 a été cloné dans pET-28a ( + ) aux sites enzymatiques XbaI et XhoI. La Nectin-2 étiquetée Myc a été intégrée dans le vecteur pLenti-Hygro pour la transfection.
Expression et purification de la protéine recombinante HlyA, pro-HlyA et Nectin-2 humaine
L’expression de la HlyA ou pro-HlyA recombinante a été réalisée dans E. coli BL21 (DE3), et l’expression de la Nectin-2 a été réalisée dans Rosetta (DE3). Avant l’induction avec 100 μM d’IPTG, les bactéries ont été cultivées à 37 °C jusqu’à ce qu’elles atteignent une OD600 de 0,6 à 0,8. Les bactéries cultivées ont été recueillies par centrifugation (8000 × g pendant 5 min à 4 °C) après 12 h d’induction à 16 °C dans du LB avec IPTG. Les bactéries ont été lysées avec du lysozyme et des ultrasons et le surnageant a été centrifugé pour éliminer les particules (18 000 × g pendant 30 min à 4 °C). Les protéines ont ensuite été purifiées en utilisant le système de purification Ni-NTA (GenScript, Nanjing, Chine). Les protéines ont été éluées avec 250 mM d’imidazole. Les fractions contenant les fragments HlyA ont été regroupées, dialysées dans 150 mM d’imidazole, 50 mM d’imidazole et deux fois avec du PBS. Ensuite, les fractions contenant la protéine souhaitée ont été concentrées à 500 μl à l’aide d’unités de filtration centrifuge Amicon Ultra-15 (Millipore, Burlington, MA, USA). Le dernier tampon de dialyse qui présentait un environnement ionique similaire à celui de la protéine HlyA purifiée a été utilisé comme témoin de la protéine purifiée dans les expériences. La concentration finale des protéines a été déterminée par spectrophotométrie (Nanodrop-2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) en utilisant le kit de dosage des protéines BCA (23225, Thermo Scientific).
Modèle de pyélonéphrite de souris
Toutes les études sur les animaux ont été examinées et approuvées par le comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale de Tianjin, Tianjin, Chine. Nous avons tout mis en œuvre pour minimiser la souffrance des animaux et pour réduire le nombre d’animaux utilisés. Les souris femelles C57BL/6J, âgées de 6 à 8 semaines, ont été achetées auprès de l’Académie des sciences médicales militaires (Pékin, Chine). Le modèle de souris à pyélonéphrite aiguë a été établi comme décrit précédemment.53 Les bactéries ont été cultivées pendant la nuit dans un milieu statique LB à 37 °C. Les bactéries cultivées ont été éliminées par centrifugation (5000 × g pendant 5 minutes à 4 °C) et remises en suspension dans du PBS pour obtenir une densité de 2 × 1010 UFC/ml. À 3 h d’intervalle, des souris C57BL/6J femelles anesthésiées ont été inoculées par voie intra-urétrale avec 50 μl de souches UPEC (109 UFC) à deux reprises.54,55 À 12, 24 et 48 hpi, les souris ont été sacrifiées et leurs reins ont été prélevés de manière aseptique et homogénéisés dans 1 ml de PBS contenant 0,025 % de Triton X-100, puis dilués en série pour le dénombrement des bactéries. A 24 hpi, les tissus rénaux ont également été utilisés pour la cytométrie en flux, l’histologie et l’analyse des cytokines pro-inflammatoires.
Analyse par cytométrie en flux
Des suspensions unicellulaires ont été générées par digestion avec 1,5 mg/ml de collagénase IV (C5138, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) et 100 ng/ml de DNase I dans du PBS pendant 30 min à 37 °C sous légère agitation. Les suspensions cellulaires digérées ont ensuite été filtrées à travers une crépine cellulaire de 70-μm (352350, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) pour obtenir des suspensions unicellulaires. Les récepteurs Fc ont été bloqués à l’aide de CD16/32 (101319, Biolegend, San Diego, CA, USA) et les suspensions unicellulaires ont ensuite été incubées avec les anticorps suivants : anti-CD11b conjugué à l’APC (17-0112-82, Thermo Fisher Scientific), anti-Ly6G conjugué au PE (127608, Biolegend), anti-F4/80 conjugué au FITC (11-4801-82, Thermo Fisher Scientific), anti-CD11c conjugué au PE (127608, Biolegend), anti-CD206 conjugué au PerCP/Cy5.5 (141716, Biolegend). Les cellules ont été analysées sur un cytomètre en flux FACSCanto II (BD Biosciences) à l’aide du logiciel Flow Jo (FlowJo, Ashland, OR, USA).
H&E coloration et immunohistochimie
Les reins ont été fixés dans du formol tamponné au phosphate à 10% pendant au moins 24 h. Le tissu fixé a ensuite été inclus dans de la paraffine et coupé en sections de 5-μm. Les lames ont été colorées à l’hématoxyline et à l’éosine. Les modifications histopathologiques rénales ont été évaluées à l’aide d’une échelle à 6 points dans laquelle 0, 1, 2 et 3 indiquaient des lésions histologiques normales, légères, modérées et sévères (les dommages pathologiques étaient principalement situés dans la médulla et la jonction cortico-médullaire) ; tandis que 4, 5 et 6 indiquaient des lésions histologiques légères, modérées et sévères (les dommages pathologiques étaient principalement situés dans plus de parties du rein). Les examens histologiques ont été analysés par deux personnes qui ne connaissaient pas les groupes expérimentaux.56,57 Pour l’analyse immunohistochimique, les sections ont été colorées avec un anticorps anti-Nectin-2 (27171-I-AP, 1:200, Proteintech, Chicago, IL, USA). Les images ont été acquises sous un microscope (BX46, Olympus, Tokyo, Japon).
Analyse par immunofluorescence des tissus et des cellules
Les reins ont été inclus dans un composé OCT avec de l’azote liquide. Les blocs congelés ont été coupés en sections de 5 µm, et séchés à l’air à température ambiante pendant 1 h, puis fixés avec de l’acétone froide pendant 10 min. Les sections congelées ont ensuite été immédiatement immergées dans du méthanol pendant 20 min, puis dans du méthanol avec 3 % de peroxyde d’hydrogène pendant 10 min. Les tissus ont été bloqués avec de l’albumine de sérum bovin (BSA) à 5% pendant 1 h, puis incubés avec l’anticorps anti-F4/80 (ab6640, Abcam, 1:200), l’anticorps anti-Ly6G (ab210402, Abcam, 1:200), l’anticorps Nectin-2, (ab135246, Abcam, 1:200) dans un tampon de blocage pendant une nuit à 4 °C si nécessaire. Les lames ont ensuite été lavées cinq fois avec du PBS, et incubées avec un anticorps secondaire marqué à l’Alexa Fluor 488/549 (Proteintech, 1:200) pendant 1 h à température ambiante. Pour la visualisation des noyaux, les sections de tissus ont été contre-colorées avec du DAPI. Les images ont été acquises sous un microscope à fluorescence (IX73, Olympus). Les cellules 293T transfectées avec pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2 ont été cultivées sur un coverglass à chambre Lab-Tek et traitées avec 75 nM de HlyA pendant 6 h, fixées avec du paraformaldéhyde à 4% pendant 15 min et soumises à une coloration par immunofluorescence avec l’anticorps anti-MYC-Tag (66003-2-Ig, 1:25, Proteintech) et l’anticorps HA-Tag (2367S, 1:200, CST) à 4 °C pendant la nuit. Des seconds anticorps marqués à l’Alexa Fluor 488/594 (Proteintech) ont été utilisés par incubation à température ambiante pendant 1 h. Les cellules ont été imagées à l’aide d’un microscope confocal à fluorescence (FV1000-D, Olympus).
Infection de cellules épithéliales rénales avec des souches d’UPEC
Des cellules épithéliales rénales humaines (786-O ou HK-2) ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits, 24 h avant les infections par UPEC. Pour l’inhibition d’ADAM10, les cellules ont été pré-incubées avec l’inhibiteur d’ADAM10 GI254023X (Sigma-Aldrich) pendant 20 h avant les infections. Les cellules ont été infectées par des bactéries à la multiplicité d’infection (MOI) indiquée pendant 6 h ou stimulées avec les concentrations indiquées de HlyA purifiée ou de pro-HlyA pendant 12 h. Dans certaines expériences, les cellules ont été traitées avec ∆hlyA (MOI 0.01) dopées avec HlyA purifiée (75 nM) pendant 6 h. Pour le test d’invasion, après 6 h d’infection, les cellules ont été lavées cinq fois avec du PBS et traitées avec 200 μg/ml de gentamicine pendant 1 h pour tuer les bactéries extracellulaires. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois avec du PBS et lysées avec 500 μl de triton X-100 à 0,2% dans du PBS et placées sur des plaques de gélose LB pour dénombrer les bactéries intracellulaires.
Dosage immunoenzymatique (ELISA)
Les niveaux deGM-CSF dans le surnageant des cellules 786-O infectées, des cellules 786-O traitées par HlyA/pro-HlyA ou des reins homogénéisés après l’infection ont été mesurés à l’aide d’un kit de développement ELISA (Neobioscience Technology Company, Shenzhen, Chine) selon les instructions du fabricant. Les reins des souris ont été prélevés et homogénéisés dans du PBS contenant 1 % de Triton X-100 et des comprimés complets de cocktail d’inhibiteurs de protéase sans mini-EDTA (11697498001, Roche, Indianapolis, IN). Les homogénats ont ensuite été incubés sur glace pendant 30 min et centrifugés à 10 000 × g pendant 10 min à 4 °C ; les surnageants ont été recueillis et utilisés pour le dosage ELISA du GM-CSF, de l’IL-1β, du TNF-α, de l’IL-6 et du MIP-2 selon les instructions du fabricant (Neobioscience Technology Company, Shenzhen, Chine).
Tests de cytotoxicité
Les surnageants de culture cellulaire des cellules 786-O traitées par les protéines purifiées ou le tampon de dialyse pendant 12 h ont été collectés, et détectés pour la lactate déshydrogénase (LDH) en utilisant un kit de test de cytotoxicité non radioactif CytoTox-96 (G1780, Promega, Madison, WI, USA).
Échantillons d’urine de patients
Les échantillons d’urine ont été recueillis auprès de patients infectés par des souches d’UPEC soumis à un traitement au deuxième hôpital de l’Université médicale de Tianjin, et la présence du gène hlyA dans la souche d’UPEC isolée de l’urine de chaque patient a été déterminée par PCR (tableaux supplémentaires S2 et S4). L’urine a été concentrée à 200 μl à l’aide des unités de filtration centrifuge Amicon Ultra-15 (UFC901024, Millipore), puis le liquide concentré a été détecté par le kit de développement ELISA (Neobioscience Technology Company). Les études associées aux échantillons de patients ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’Université médicale de Tianjin, et le consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients.
Extraction d’ARN et qRT-PCR
Les cellules 786-O ont été infectées par CFT073, ∆hlyA ou ∆hlyA p-hlyA (MOI 0,01) pendant 4 h. L’ARN a été extrait à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN total (Solarbio, Pékin, Chine) selon le protocole du fabricant et transcrit à l’inverse à l’aide du kit de synthèse d’ADNc de premier brin RevertAid (Thermo Fisher Scientific). La qRT-PCR a été réalisée à l’aide d’un mélange maître FastStart Universal SYBR Green (Roche, Bâle, Suisse) sur un système 7900 Fast Real-Time PCR (Roche). Les conditions de cyclage de la PCR étaient les suivantes : 95 °C pendant 5 min, suivi de 40 cycles de 95 °C pendant 20 s, 60 °C pendant 20 s et 72 °C pendant 20 s. La β-actine a été utilisée comme contrôle endogène et les données ont été normalisées sur la base du niveau de transcription de la β-actine dans le type sauvage et quantifiées à l’aide de la méthode comparative du cycle de seuil critique 2-∆∆Ct. Les amorces utilisées sont énumérées dans le tableau supplémentaire S4.
Tests de chimiotaxie
Les tests de migration cellulaire ont été réalisés à l’aide de chambres Transwell (taille des pores 5 μm, Costar, Corning 3421, Corning, NY, USA). Les cellules THP-1 (2 × 106 dans 200 μl) ont été remises en suspension dans un milieu RPMI 1640 sans sérum et ajoutées à la chambre supérieure. Le surnageant des cellules 786-O infectées a été mélangé avec 1 μg/ml d’anticorps neutralisant contre le GM-CSF humain (502203, BVD2-23B6, Biolegend) ou une IgG2a de contrôle (400515, Rat IgG2a, Biolegend) et incubé pendant 30 min. Ensuite, 600 μl de milieu contenant le surnageant ont été ajoutés dans la chambre inférieure comme chimioattractant. Après 3 h ou 6 h d’incubation à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2, les cellules migrantes dans la chambre inférieure ont été comptées.
Liposomes de clodronate et traitement par anticorps anti-GM-CSF
Pour éliminer les macrophages, 200 µl de PBS ou de liposomes de clodronate ont été administrés à des souris par voie intraveineuse 24 h avant l’infection32,33. Pour neutraliser le GM-CSF, un anticorps neutralisant contre le GM-CSF (505408, MP1-22E9, Biolegend, 250 µg) ou une IgG2a témoin (400533, Rat IgG2a, Biolegend, 250 µg) a été injecté par voie intraveineuse à des souris 1 h avant l’infection.33,58
Anti-corps et western blotting
Les anticorps ont été obtenus auprès des sociétés suivantes : anticorps monoclonal anti-FLAG (F1804, Sigma-Aldrich), anticorps anti-MYC-Tag (66004-I-Ig, Proteintech, Chicago, IL, USA), et anticorps anti-Nectin-2 (ab135246, Abcam, Cambridge, UK). Les lysats de cellules entières ont été préparés à l’aide du tampon de lyse RIPA (Millipore), avec des inhibiteurs de protéase complets (Roche, Basel, Suisse). Le kit de dosage des protéines BCA (Thermo Fisher) a été utilisé pour déterminer la concentration en protéines. Les IgG anti-lapin (1:10000, Sigma-Aldrich) ou anti-souris (1:10000, Sigma-Aldrich) conjuguées au HRP ont été utilisées pour révéler la liaison des anticorps. Les complexes immunoréactifs ont été détectés à l’aide du substrat chimioluminescent HRP Immobilon Western (Millipore) et exposés à un appareil GE Amersham Imager 600.
Blotting far-western et analyse LC-MS/MS
Le protocole de blotting far-western a été réalisé comme décrit précédemment59. Les cellules 786-O ont été lavées deux fois avec du PBS glacé, et les protéines de la membrane cellulaire ont été isolées à l’aide d’un kit d’extraction des protéines de la membrane et du cytosol (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine) selon le protocole du fabricant. Les protéines solubles associées à la membrane ont été analysées par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide sur des gels à 10 %. Les protéines ont ensuite été transférées sur une membrane en fluorure de polyvinylidène (PVDF) (Merck Millipore, Darmstadt, Allemagne). Les protéines transférées ont été renaturées à l’aide du tampon AC en réduisant progressivement la concentration de guanidine-HCl.59 Ensuite, la membrane a été bloquée avec 5 % de lait écrémé dans le tampon TBST pendant 1 h. Ensuite, la membrane a été incubée avec 30 μg/ml de HlyA purifiée étiquetée FLAG ou un tampon de dialyse pendant une nuit à 4 °C. Après lavage, la membrane a été incubée avec un anticorps anti-FLAG dilué au 1:1000 (Sigma-Aldrich) pendant une nuit à 4 °C dans du lait écrémé à 5 % dans le tampon TBST. Ensuite, la membrane a été lavée soigneusement et incubée avec de l’IgG anti-souris conjugué au HRP (1 :10000, Sigma-Aldrich)
Les bandes différentielles entre le groupe tampon de dialyse et le groupe HlyA marqué au FLAG ont été identifiées par LC-MS/MS, réalisée à l’aide d’un spectromètre de masse nanoLC-LTQ-Orbitrap XL (Thermo, San Jose, CA, USA) couplé à un système HPLC Eksigent nano LC 1D plus de Majorbio (Shanghai, Chine). Les peptides tryptiques ont été entièrement digérés par voie enzymatique et ionisés à l’aide de l’ionisation nano electrospray.33 Les données ont été analysées à l’aide d’un spectre de masse à balayage complet (300 à 1800 m/z). Enfin, Proteome Discoverer (version 1.4.0.288, Thermo Scientific) a été utilisé pour analyser les données MS.
Interférence ARN et surexpression de la Nectin-2
Des petits ARN interférents (siRNA) pour les gènes ciblés et un siRNA de contrôle brouillé (siScr) ont été synthétisés par GenePharma (Shanghai, Chine). Les siRNA ont été transfectés dans des cellules 786-O ou HK-2 à l’aide de la Lipofectamine 3000 (Invitrogen). pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2 a été transfecté dans des cellules 786-O ou HK-2 à l’aide de la Lipofectamine 3000 (Invitrogen) pour surexprimer la Nectin-2. Quarante-huit heures après la transfection, l’expression protéique des cellules a été analysée par western blotting. Les séquences des siRNA sont répertoriées dans le tableau complémentaire S4.
Immunoprécipitation
Les cellules 293T ont été transfectées avec le vecteur pLenti-Hygro ou pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2, puis cultivées pendant 48 heures. Les cellules ont ensuite été incubées avec de l’HlyA marquée au FLAG (75 nM) pendant 6 h après la transfection et ont été fraîchement lysées dans un tampon de lyse (50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 % NP-40, 0,2 mM EDTA, 150 mM NaCl) pour le western blotting ou les tests d’immunoprécipitation (IP). Les cellules 786-O ont été incubées avec de l’HlyA marquée par FLAG (75 nM) ou un tampon de dialyse pendant 6 h, puis lysées à l’aide d’un tampon de lyse pour le test IP des protéines. Les surnageants cellulaires ont été incubés avec des billes M2 anti-FLAG (A2220, Sigma-Aldrich) ou des billes M2 anti-Myc (A7470, Sigma-Aldrich) pendant 12 h à 4 °C pour l’IP de la protéine étiquetée FLAG ou étiquetée Myc. Pour l’IP de la protéine Nectin-2, les surnageants cellulaires ont été incubés avec l’anticorps anti-Nectin-2 (ab135246, Abcam) pendant 12 h à 4 °C, puis incubés avec de l’agarose Protéine A/G (20241, Thermo Fisher) pendant 2 h à 4 °C. Une IgG normale de lapin (2729S, CST) a été utilisée comme contrôle. Après incubation, les précipités ont été recueillis par centrifugation, lavés cinq fois avec le tampon de lyse et analysés par immunoblotting en utilisant l’anticorps monoclonal anti-FLAG, l’anticorps anti-MYC-Tag ou l’anticorps anti-Nectin-2.
La protéine HlyA étiquetée FLAG exprimée et purifiée par des bactéries (1 µg) a été incubée avec 1 μg de Nectin-2 recombinante purifiée exprimée par des bactéries dans un tampon de liaison (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,1 % Triton-X 100, 100 mM NaCl, 20 % glycérine,1 % BSA) pendant 12 h. Les complexes ont ensuite été soumis à une IP de la protéine étiquetée FLAG ou à une IP de la protéine Nectin-2. Enfin, les protéines complexées ont été analysées par immunoblotting.
Analyse statistique
La signification statistique des différences entre les groupes a été testée en utilisant l’analyse de la variance (ANOVA). Le test non paramétrique de Mann-Whitney a été utilisé pour calculer la signification statistique dans les expériences in vivo.