Abstract
Préalablement, notre groupe a démontré que l’expression nucléaire de l’ubiquitine ligase E3 (MDM2) dans le mésothéliome pleural malin (MPM) est significativement associée à une diminution de la survie globale. Une explication possible est que la surexpression de MDM2 conduit à une dégradation protéasomique de TP53 qui aboutit finalement à une perte de l’apoptose et de la sénescence induites par TP53. Il est bien connu, d’après d’autres entités tumorales, que la restauration de l’activité de TP53, par exemple par l’inhibition de MDM2, entraîne une réponse instantanée des cellules cancéreuses au stress et/ou aux dommages à l’ADN induits par TP53. La Nutlin-3A (un analogue de la cis-imidazoline) a été décrite comme un inhibiteur puissant et sélectif de MDM2 empêchant l’interaction MDM2-TP53 par une liaison spécifique à la poche hydrophobe de liaison TP53 de MDM2. Dans la présente étude, les effets de l’inhibition de MDM2 dans le MPM via Nutlin-3A et les agents chimiothérapeutiques standard à base de platine ont été testés de manière comparative dans trois lignées cellulaires MPM (NCI-H2052, MSTO-211H et NCI-H2452) présentant différents profils d’expression de TP53, MDM2 et son inhibiteur physiologique de MDM2-P14/ARF. Nos expériences in vitro sur des lignées cellulaires de MPM ont révélé que la Nutlin-3A, en combinaison avec le cisplatine, entraînait une induction de la sénescence jusqu’à 9,75 fois plus élevée (p=0,0050) et un taux d’apoptose jusqu’à 5 fois plus élevé (p=0,0067) par rapport aux schémas cisplatine et pemetrexed couramment utilisés. Ainsi, la Nutlin-3A, un puissant inhibiteur de MDM2, est associée à une induction significative de la sénescence et de l’apoptose dans les lignées cellulaires de MPM, faisant de la Nutlin-3A une substance prometteuse pour une thérapie ciblée dans le sous-groupe de MPM présentant une surexpression de MDM2.
1. Introduction
Le mésothéliome malin est une tumeur très agressive survenant à partir de surfaces tapissées de mésothélium, principalement dans les cavités pleurales (mésothéliome pleural malin, MPM) . En l’absence de traitement, la survie médiane des patients est de neuf mois. Les patients atteints de MPM subissent les effets négatifs des modalités de traitement actuelles, pour la plupart insuffisantes, qui consistent en des régimes à base de platine utilisant le cisplatine ou le carboplatine comme premier choix. Le traitement au cisplatine entraîne un taux de réponse d’à peine 14 % et une survie médiane de moins de sept mois. Le carboplatine entraîne des taux de réponse similaires, allant de 6 à 16 % . Dans la pratique clinique, l’antifolate pemetrexed, en tant que seule thérapie approuvée par la FDA pour le MPM, est utilisé en combinaison avec des composés de platine .
Plusieurs études ont montré l’efficacité de l’évaluation de l’expression intratumorale des membres du métabolisme de l’acide folique pour la prédiction de la réponse à la thérapie antifolate multicible chez les patients atteints de différentes entités cancéreuses, mais sont discutées de manière controversée . Comme les analogues de la platine sont des composés génotoxiques qui induisent des lésions de l’ADN conduisant à l’arrêt du cycle cellulaire et à l’apoptose induits par TP53, il est fondamentalement concevable que le mécanisme de réparation de l’ADN puisse être l’une des clés associées à une réponse thérapeutique altérée. Comme l’identification de propriétés moléculaires partagées par les MPM pourrait aider à surmonter la faible réponse au traitement observée, plusieurs études ont abordé cette question. Cependant, les raisons de l’efficacité plutôt faible des composés de platine restent largement inconnues.
En résumé, il n’existe à ce jour ni biomarqueurs prédictifs fiables ni concepts thérapeutiques individualisés pour le MPM. Par conséquent, les directives actuelles soulignent la nécessité de thérapies innovantes et inédites.
Puisque les mutations du gène TP53 sont extrêmement rares dans le MPM , d’autres mécanismes tels que la délétion du locus ou des altérations épigénétiques peuvent contribuer à l’inactivation de TP53 . La surexpression de MDM2 dans certains types de tumeurs peut conduire à une perte de la fonction régulatrice de TP53 dans les cellules cancéreuses par sa dégradation protéasomique accrue. P14/ARF, l’inhibiteur physiologique de MDM2, est reconnu comme un suppresseur de tumeur et contribue à ce mécanisme en induisant l’arrêt du cycle cellulaire d’une manière à la fois TP53-dépendante et TP53-indépendante. De plus, la régulation des miRNA semble jouer un rôle important. Dans des études précédentes, nous avons démontré une forte surexpression nucléaire de MDM2 dans environ 25 % des cas de MPM ; cette observation était limitée aux MPM épithélioïdes ou aux composants épithélioïdes des MPM biphasés. Les patients présentant un MPM MDM2-positif ont montré une survie globale (OS) et une survie sans progression (PFS) significativement réduites par rapport au MPM MDM2-négatif. Ceci pourrait s’expliquer par une activité et/ou une stabilité de TP53 significativement diminuée ou complètement abolie, médiée par une surexpression de MDM2.
Une restauration de l’activité de TP53, par exemple par l’inhibition de MDM2, pourrait résulter en une réponse instantanée au stress induit par TP53 et/ou aux dommages à l’ADN des cellules cancéreuses. La Nutlin-3A (un analogue de la cis-imidazoline) est un inhibiteur puissant et sélectif de MDM2 avec une valeur IC50 de 90nM et empêche l’interaction MDM2-TP53 en se liant à la poche hydrophobe de liaison à TP53 de MDM2 .
Donc, l’objectif de cette étude était de tester l’effet de l’inhibition de MDM2 dans le MPM via Nutlin-3A en comparaison avec les stratégies chimiothérapeutiques communes contemporaines en utilisant trois lignées cellulaires présentant différents profils de marqueurs concernant le statut TP53, le niveau d’expression P14/ARF- et MDM2.
2. Matériel et méthodes
2.1. Expériences sur les lignées cellulaires
Sur la base d’une revue de la littérature, les concentrations des cytostatiques ont été estimées (Nutlin-3A , cisplatine , et pemetrexed , respectivement).
Les lignées cellulaires humaines de MPM ont été obtenues auprès de l’American Type Culture Collection en 2012-08 (Manassas, VA, USA). Les lignées cellulaires ont été authentifiées et testées pour les contaminations en utilisant un service commercial (Multiplexion, Heidelberg, Allemagne) et ont été testées à nouveau directement après la fin des expériences.
NCI-H2052, NCI-H2452 et MSTO-211H ont été cultivées dans un milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Invitrogen, CA, USA) contenant 10% de sérum bovin fœtal (Invitrogen) à 37°C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO2. Les cellules ont été cultivées jusqu’à 85 à 95 % de confluence, puis lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (Invitrogen), et trypsinisées avec 1 ml de trypsine 0,05 % – acide éthylènediaminetétraacétique 0,53 mM, rouge de phénol (Invitrogen). La trypsinisation a été arrêtée en ajoutant du milieu frais à la réaction. Environ 10 μl ont été transférés dans un hémocytomètre (BRAND, Wertheim, Allemagne) à des fins de comptage cellulaire. 1 000 cellules par puits (100 μl) ont été ensemencées dans des microplaques 96/U (Eppendorf, Hambourg, Allemagne) adaptées à la détection par luminescence et fluorescence. On a laissé les cellules se fixer pendant une nuit à 37 °C et à 5 % de CO2. Le lendemain, le milieu a été retiré et du milieu frais contenant l’un des cytostatiques ou sans additif a été appliqué dans chaque puits. Le cisplatine (10μM ; TEVA, Petah Tikva, Israël) le pemetrexed (200μM ; Lilly, IN, USA) et le Nutlin-3A (5, 10 ou 20μM ; Sigma-Aldrich, MO, USA) ont été appliqués seuls ou en combinaison. La Nutlin-3A a dû être solubilisée dans du diméthylsulfoxyde (Sigma-Aldrich). Les concentrations des cytostatiques appliqués sont résumées dans le tableau 1. Les cultures cellulaires contenant les cytostatiques et le milieu vierge ont été incubées pendant trois jours à 37°C et 5% de CO2. Dans les 72 heures, la nécrose, l’apoptose et la viabilité cellulaire ont été évaluées à l’aide des tests de luminescence suivants : CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay (Promega), Caspase-Glo® 3/7 Assay (Promega), et CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega). Les tests ont été réalisés conformément aux recommandations du fournisseur. Au moins quatre points de données ont été mesurés par médicament cytostatique et par test de luminescence. La luminescence a été évaluée à l’aide d’un lecteur de microplaques à luminescence SpectraMax L (Molecular Devices, CA, USA). La luminescence (unités luminescentes relatives ; RLU) a été mesurée à 570nm et le temps d’intégration a été ajusté à 1 seconde. La température du SpectraMax L a été maintenue entre 21,5°C et 24,5°C pendant les mesures. En outre, à partir de chaque lignée cellulaire, un bloc FFPE a été préparé pour une analyse immunohistochimique et qPCR.
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2.2. Isolation de l’ARN et qPCR en temps réel
Les niveaux d’expression de l’ACTB (gène de référence), de MDM2 et de P14/ARF, ont été étudiés par qPCR en temps réel TaqMan dans les trois lignées cellulaires de MPM. L’ARN a donc été isolé en coupant trois à cinq sections de 4μm du bloc FFPE à l’aide d’un microtome (Leica, SM 2000 R, Wetzlar, Allemagne). L’ARN total a été isolé à l’aide du kit miRNeasy FFPE (Qiagen, Hilden, Allemagne) et du protocole du fabricant, à l’exception de deux modifications (digestion à la protéinase K pendant la nuit ; élution dans 25μl). Les concentrations d’ARN ont été mesurées par spectrométrie UV/VIS (NanoDrop ND-1000, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Allemagne). L’ARN a été conservé à -80°C. Pour la synthèse d’ADNc, le kit et le protocole de synthèse d’ADNc iScript Select (Bio-Rad Laboratories, Inc, CA, États-Unis) ont été utilisés avec une entrée de 1μg d’ARN total par réaction.
Pour la qPCR en temps réel, les tests d’expression génique TaqMan à la demande (AoD) pour ACTB (Hs03023943_g1), MDM2 (Hs01066942_m1) et P14/ARF (Hs99999189_m1) ont été utilisés (Applied Biosystems® ; CA, États-Unis). Les volumes de réaction ont été modifiés en utilisant 50 % des volumes de réaction totaux recommandés avec 50 ng d’ADNc en entrée. Chaque cible a été mesurée en triplicata. Les valeurs Ct de P14/ARF et MDM2 ont été normalisées par rapport aux valeurs moyennes de l’ACTB. La qPCR en temps réel et l’analyse des données ont été réalisées sur un LightCycler 480 II de Roche (Roche, Bâle, Suisse) et le logiciel correspondant. Toutes les expériences de qPCR en temps réel ont été réalisées conformément aux directives de la MIQE
2.3. Immunohistochimie
L’immunohistochimie a été réalisée selon les protocoles standards en utilisant un colorant automatisé (Ventana Discovery XT, Munich, Allemagne). Après validation sur des tissus de référence (liposarcome pour MDM2, adénocarcinome pulmonaire pour TP53), les investigations immunohistochimiques ont été réalisées avec des anticorps dirigés contre MDM2 (clone IF2, Calbiochem, Darmstadt, Allemagne, dilution : 1:80) et TP53 (clone BP53-12, Zytomed, Berlin, Allemagne ; dilution : 1:5000). Le prétraitement pour la récupération de l’antigène a été effectué par chauffage dans de l’eau désionisée à pH 6 pendant 30 minutes. L’expression des protéines a été évaluée à l’aide d’un système de notation IHC à quatre niveaux basé sur le pourcentage de noyaux de cellules tumorales présentant une immunoréaction positive (Score 0 : aucun signal ; Score 1 (faible expression) : 1-25% ; Score 2 (expression modérée) : 26-50% ; Score 3 (forte expression) : >50%).
2.4. Analyse statistique
Les analyses statistiques et graphiques ont été réalisées avec l’environnement de programmation statistique R (v3.4.2).
Pour l’analyse entre groupes simples, le test de la somme des rangs de Wilcoxon Mann-Whitney (non paramétrique) ou le test t bilatéral des étudiants (paramétrique) a été appliqué. Pour les variables ordinales avec plus de deux groupes (différences de signal de luminescence entre tous les groupes de traitement), le test de Kruskal-Wallis (non paramétrique) ou l’ANOVA (paramétrique) a été utilisé pour détecter les différences de groupe.
Le niveau de signification statistique a été défini comme p<0,05.
3. Résultats
Les profils d’expression de MDM2, TP53 et P14/ARF diffèrent entre les lignées cellulaires étudiées et sont résumés dans le tableau 2. Les scans des colorations immunohistochimiques sont présentés dans la Figure 1 ; les résultats de la qPCR sont visualisés dans la Figure 2. NCI-H2052 a montré une immuno-expression prononcée de MDM2, mais une faible expression de P14/ARF et de TP53. Par immunohistochimie, MSTO-211H n’a montré aucune expression de MDM2 et de P14/ARF, mais l’expression de TP53 était présente. NCI-H2452 n’a montré aucune expression de MDM2 ni de TP53, mais l’expression de P14/ARF a été détectée. Les lignées cellulaires étudiées représentent la constellation moléculaire qui a été rapportée dans des études précédentes de patients atteints de MPM .
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– : expression minime à nulle
+ : expression mesurable +/- : faible expression mesurable |
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(a) NCI-H2052, coloration anti-P53
(b) NCI-H2052, coloration anti-MDM2
(c) NCI-H2452, coloration anti-P53
(d) NCI-H2452, coloration anti-MDM2
(e) MSTO-211H, coloration anti-P53
(f) MSTO-211H, coloration anti-MDM2
(a) NCI-H2052, coloration anti-P53
(b) NCI-H2052, coloration anti-MDM2
(c) NCI-H2452, coloration anti-P53
(d) NCI-H2452, coloration anti-MDM2
(e) MSTO-211H, coloration anti-P53
(f) MSTO-211H, coloration anti-MDM2
3.1. Réponse des lignées cellulaires de MPM au pemetrexed, au cisplatine et à des concentrations variables de Nutlin-3A
Le cisplatine (10μM) et le pemetrexed (200μM) en agent unique ainsi qu’en combinaison ont été testés par rapport à trois concentrations de Nutlin-3A (5μM, 10μM et 20μM).
3.1.1. Viabilité cellulaire
NCI-H2052. Toute concentration de Nutlin-3A était supérieure pour réduire la viabilité cellulaire par rapport au cisplatine ou au pemetrexed ou à leur combinaison, respectivement (p=0,0039). En revanche, le traitement avec le pemetrexed seul a montré une viabilité cellulaire significativement élevée. Le traitement par le cisplatine seul a montré une viabilité cellulaire plus élevée que le cisplatine et le pemetrexed en association.
MSTO-211H. Le pemetrexed associé au cisplatine était associé à la viabilité cellulaire la plus élevée, suivi par le cisplatine seul et la concentration la plus faible de Nutlin-3A (p=0,0952). Le pemetrexed combiné au cisplatine a réduit la viabilité cellulaire de manière significative, mais le Nutlin-3A (10μM) a présenté une réduction légèrement plus forte. La concentration la plus élevée de Nutlin-3A a réduit la viabilité cellulaire au minimum.
NCI-H2452. La concentration la plus élevée de Nutlin-3A (20μM) a réduit la viabilité cellulaire au minimum (p=0,0017). La concentration de 10μM de Nutlin-3A était le deuxième plus fort inhibiteur de viabilité cellulaire, suivi du cisplatine seul, du pemetrexed seul et du cisplatine en combinaison avec le pemetrexed. La plus faible concentration de Nutlin-3A a montré le plus faible impact sur la réduction de la viabilité cellulaire.
Les diagrammes en boîte pour la viabilité cellulaire mettent en évidence la diminution de la viabilité cellulaire avec l’augmentation de la concentration de Nutlin-3A dans les lignées cellulaires testées. Les résultats pour toutes les lignées cellulaires concernant la sénescence/viabilité cellulaire sont résumés dans les figures 3(a)-3(c).
(a)
(b)
(c)
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(b)
(c)
3.1.2. Apoptosis
NCI-H2052. Dans la lignée cellulaire NCI-H2052, le taux d’apoptose le plus élevé a été trouvé pour 20μM de Nutlin-3A, alors que les autres approches de traitement ont montré une induction d’apoptose similaire (p=0,14).
MSTO-211H. Dans MSTO-211H, les taux d’apoptose les plus élevés ont été trouvés pour le pemetrexed, suivi du pemetrexed en combinaison avec le cisplatine et différentes concentrations de Nutlin-3A (p=0,0219). Presque aucune apoptose n’a été observée pour le cisplatine seul et le Nutlin-3A.
NCI-H2452. NCI-H2452 a révélé le taux d’apoptose le plus élevé en réponse au Nutlin-3A à la concentration la plus élevée (20μM), suivi du cisplatine (p=0,0359). Des taux d’apoptose significativement plus faibles ont été trouvés pour les cytostatiques restants.
Les résultats pour l’apoptose sont résumés dans les figures 4(a)-4(c).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3.1.3. Nécrose
La nécrose des cellules n’a été influencée par aucun des chimiothérapies par rapport au contrôle (données non présentées).
3.2. Réponse des lignées cellulaires MPM à des concentrations variables de Nutlin-3A combinées au cisplatine
Dans d’autres expériences, l’induction de l’apoptose a été testée en utilisant soit un régime de Nutlin-3A, soit une combinaison de Nutlin-3A et de cisplatine. Trois combinaisons de Nutlin-3A (5μM, 10μM et 20μM) plus cisplatine (10μM) ont été comparées au cisplatine (10μM) seul, au pemetrexed (200μM) seul, au Nutlin-3A seul (10μM) et à une combinaison de cisplatine et de pemetrexed.
3.2.1. Viabilité cellulaire
NCI-H2052. La Nutlin-3A seule et sa combinaison avec le cisplatine ont montré une induction de sénescence significativement accrue par rapport à l’autre régime (p=0,0051). Seule la Nutlin-3A 5μM en combinaison avec le cisplatine a montré une puissance d’induction des taux de sénescence inférieure à celle de la Nutlin-3A 5μM sans cisplatine. Les concentrations plus élevées de Nutlin-3A (10 et 20μM) avec le cisplatine ont réduit la viabilité cellulaire au minimum. La viabilité cellulaire la plus élevée a été trouvée pour le pemetrexed suivi par la combinaison du pemetrexed et du cisplatine.
MSTO-211H. Toute combinaison de Nutlin-3A avec le cisplatine a induit une sénescence cellulaire significativement accrue par rapport au cisplatine, au pemetrexed ou à une combinaison des deux (p=0,0059). Cependant, l’association de cisplatine et de pemetrexed a montré une efficacité similaire à celle du régime le plus faible de Nutlin-3A/cisplatine et de Nutlin-3A seul. Des concentrations plus élevées de Nutlin-3A combiné au cisplatine ont réduit la viabilité cellulaire au minimum.
NCI-H2452. La Nutlin-3A en combinaison avec le cisplatine ou seule était supérieure par rapport aux autres cytostatiques, sauf à la plus faible concentration de 5μM (p=0,0089). De manière intéressante, le cisplatine a montré une efficacité comparable à celle de 10μM de Nutlin-3A seul et du cisplatine en combinaison avec 5μM de Nutlin-3A. La viabilité cellulaire la plus élevée a été observée avec le pemetrexed, le cisplatine en combinaison avec le pemetrexed et 5μM de Nutlin-3A. La plus forte concentration de Nutlin-3A (20μM) avec le cisplatine a montré le taux de sénescence le plus élevé.
Les diagrammes en boîte pour la viabilité cellulaire mettent en évidence que la viabilité cellulaire diminue avec l’augmentation de la concentration du schéma cisplatine/Nutlin-3A dans les lignées cellulaires testées. Les résultats de la sénescence/viabilité cellulaire sont résumés dans les figures 3(a)-3(c).
3.2.2. Apoptosis
NCI-H2052. Dans la lignée cellulaire NCI-H2052, des concentrations plus élevées de Nutlin-3A combinées au cisplatine appliqué ont induit une augmentation significative de l’apoptose par rapport au pemetrexed seul ou combiné au cisplatine (p=0,0069). Les taux d’apoptose les plus élevés ont été trouvés pour 10μM de Nutlin-3A en combinaison avec le cisplatine.
MSTO-211H. La lignée cellulaire MSTO-211H a présenté le taux d’apoptose le plus élevé lorsqu’elle a été traitée par le pemetrexed seul (p=0,0035). Le deuxième taux d’apoptose le plus élevé a été trouvé pour 10μM de Nutlin-3A combiné au cisplatine. Le pemetrexed en association avec le cisplatine a entraîné le troisième taux d’apoptose le plus élevé. Le cisplatine en combinaison avec 20μM de Nutlin-3A était plus puissant que le cisplatine seul, le Nutlin-3A seul et la plus faible concentration de Nutlin-3A (5μM) en combinaison avec le cisplatine.
NCI-H2452. Les taux d’apoptose les plus élevés ont été trouvés pour l’agent unique 20μM de Nutlin-3A ainsi que pour les concentrations 10μM et 20μM de Nutlin-3A combinées avec le cisplatine, suivis par le cisplatine (p=0,1).
Les résultats concernant l’apoptose sont résumés dans les figures 4(a)-4(c).
3.2.3. Nécrose
La nécrose des cellules n’a été influencée par aucun des chimiothérapies par rapport au témoin non traité (données non présentées).
Tous les résultats des expériences d’inhibition des lignées cellulaires sont résumés dans le tableau 3.
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(a) Réponse des lignées cellulaires MPM au pemetrexed, au cisplatine, et à des concentrations variables de Nutlin-3A à des concentrations variables
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(b) Réponse des lignées cellulaires MPM à des concentrations variables de Nutlin-3A combinées avec le cisplatine
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4. Discussion
Dans des études précédentes, nous avons identifié MDM2 comme un biomarqueur pronostique chez les patients atteints de MPM et cette expression est régulée par des miRNA spécifiques . La Nutlin-3A inhibe l’interaction MDM2-TP53 et induit ainsi l’arrêt du cycle cellulaire, la sénescence et l’apoptose selon le type de cellule . En outre, il s’agit d’un médicament non génotoxique qui présente une faible toxicité dans les modèles animaux et qui est associé à un risque de résistance plus faible que les médicaments conventionnels.
Dans ce contexte, nous avons émis l’hypothèse que la surexpression de MDM2, peut-être en combinaison avec la perte partielle ou complète de P14/ARF, peut être ciblée par un régime thérapeutique basé sur le Nutlin-3A pour restaurer l’activité de TP53 dans un sous-groupe de MPM.
Dans cette approche in vitro, les effets des chimiothérapies de pointe actuelles, le cisplatine et le pemetrexed, seuls et en combinaison, par rapport au Nutlin-3A ont été étudiés dans trois lignées cellulaires couvrant le modèle trouvé chez les patients . La Nutlin-3A a induit efficacement la sénescence dans les trois lignées cellulaires MPM et s’est avérée supérieure au cisplatine et/ou au pemetrexed, alors que l’apoptose ne pouvait être induite qu’à des concentrations élevées. La littérature montre que les effets de la Nutlin-3A sont spécifiques au type cellulaire, induisant plutôt l’arrêt du cycle cellulaire et la sénescence que l’apoptose. Par conséquent, nous avons étudié la combinaison du cisplatine et de la Nutlin-3A pour augmenter le stress cellulaire en induisant des dommages à l’ADN à base de platine. La combinaison de Nutlin-3A avec le cisplatine entraîne une augmentation des taux d’apoptose et de sénescence par rapport à Nutlin-3A seul, car une fonction majeure de TP53 est la réponse aux dommages et au stress de l’ADN .
Le même mécanisme semble être vrai lors de la combinaison de Nutlin-3A et de la radiothérapie pour fournir des dommages cellulaires supplémentaires et déplacer la réponse cellulaire de TP53 vers l’apoptose, déjà montré dans le carcinome épidermique oesophagien de type sauvage TP53 in vitro et in vivo . Il est intéressant de noter que Shimazu et al. ont trouvé un effet supplémentaire d’inhibition de la croissance dans le MPM en combinant le Nutlin-3A avec la metformine, un inhibiteur de mTOR, suggérant une possible interaction entre les voies mTOR et TP53. À noter que les auteurs ont confirmé nos résultats concernant les lignées cellulaires NCI-H2052 et MSTO-211H comme étant les meilleures répondeuses au traitement par Nutlin-3A, postulant une valeur IC50 de 0,37μM (MSTO-211H) et 0,50μM (NCI-H2052), respectivement .
Comme mentionné précédemment, la surexpression de MDM2 peut conduire à une perte de la fonction régulatrice de P53 via une dégradation protéasomique accrue . Outre son inhibiteur physiologique P14/ARF, l’analyse de la relation de signalisation entre ces gènes indique un rôle supplémentaire de RB1 dans ce réseau de signalisation . Il a été démontré que, en plus de l’inhibition de l’interaction MDM2-TP53, la Nutlin-3A influence également les interactions MDM2-RB1, ce qui constitue une explication possible des effets indépendants de TP53 basés sur la Nutlin-3A.
Intéressant, même la lignée cellulaire MSTO-211H à faible expression de MDM2 ainsi que la lignée cellulaire NCI-H2452 négative pour MDM2 et TP53 montrent une induction réduite mais clairement détectable de l’apoptose par la Nutlin-3A combinée au cisplatine. De plus, les cellules immunohistochimiquement négatives présentent, comme indiqué précédemment, un profil d’expression génique détectable de MDM2, ce qui se traduit par des concentrations de protéines MDM2 inférieures au seuil de détection de l’IHC. Nous supposons que, comme la régulation de TP53 par MDM2 est un médiateur essentiel de l’apoptose et de l’état cellulaire dans une situation physiologique, l’inhibition de l’interaction TP53-MDM2 à ces faibles niveaux de MDM2 aura un effet bénéfique sur la cytotoxicité des composés de platine, ce qui explique les effets secondaires du traitement au Nutlin-3A. Pour NCI-H2452, une lignée cellulaire avec une expression absente de TP53, l’effet observé doit être indépendant de TP53 et est très probablement basé sur les effets inhibiteurs de RB1.
En ce moment, le Nutlin-3A est administré per os comme substance R05045337 dans un essai clinique multicentrique de phase I pour la thérapie des néoplasies hématologiques . De plus, le RG7112, un dérivé du Nutlin-3A, est entré dans les essais cliniques de phase I chez les patients atteints de liposarcomes qui sont des tumeurs de type TP53 sauvage avec MDM2 amplifié. Dans cet essai clinique, le RG7112 a été administré per os à 20 patients dans un contexte néoadjuvant. Un patient a présenté une rémission partielle et 14 ont présenté une maladie stable, mais tous les patients ont souffert d’effets secondaires tels que la neutropénie. Une explication possible pourrait être les doses élevées de médicament de 1440 mg m-2 jour-1 per os . Dans les études in vivo précédentes, l’administration orale de Nutlin-3A a montré plusieurs limites, notamment des quantités élevées de Nutlin-3A (200-400 mg/Kg) et des difficultés à administrer ces doses élevées. Il convient de noter que des systèmes de livraison efficaces ont été développés en utilisant des polymères comme le poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) et des anticorps monoclonaux .
5. Conclusion
Dans cette étude in vitro, notre hypothèse selon laquelle le MPM surexprimant MDM2 peut être ciblé par une chimiothérapie à base de Nutlin-3A a été prouvée. En particulier, pour un biomarqueur optimal de surexpression de MDM2 et d’expression faible/absente de P14/ARF, des taux d’apoptose et de sénescence supérieurs ont été observés par rapport aux chimiothérapies conventionnelles. Même dans le cas d’un paramètre de biomarqueur moins optimal avec une expression minimale de MDM2, une induction favorable de l’apoptose et de la sénescence était évidente pour la Nutlin-3A en association avec le cisplatine par rapport au régime médicamenteux conventionnel. Par conséquent, l’approche thérapeutique basée sur la Nutlin-3A pourrait être d’une grande valeur pour un sous-groupe de patients atteints de MPM.
Data Availability
Les données utilisées pour soutenir les résultats de cette étude sont disponibles sur demande auprès de l’auteur correspondant.
Divulgation
Les résultats de la présente étude ont été présentés au Consortium allemand du cancer (DKTK), au 1er symposium d’oncologie translationnelle d’Essen (ETOS) (Essen, 2018) et au 33e congrès allemand du cancer (Berlin 2018).
Conflits d’intérêts
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
L’étude a été financée par l’Institut de pathologie, l’hôpital universitaire d’Essen et la Ruhrlandklinik Essen.