Lignées de drosophile
Plusieurs lignées (GMR57C10-Gal4, elav-Gal4, UAS-GCaMP6s, UAS-GCaMP6f, UAS-CD4 :tdGFP, et UAS-tdTomato) ont été obtenues auprès du Bloomington Stock Center. MAN-Gal4 (VT50660-AD ; VT14014-DBD) et MDN-1-Gal4 (VT44845-DBD ; VT50660-AD) ont été fournis par B. Dickson (Janelia Research Campus). DNa01-Gal4 (SS00731 : GMR22C05-AD ; GMR56G08-DBD), DNb06-Gal4 (SS02631 : GMR20C04-AD ; BJD113E03-DBD), DNg13-Gal4 (SS02538 : BJD118A10-AD ; BJD123E03-DBD), et DNg16-Gal4 (SS01543 : BJD104A07-AD ; BJD107F12-DBD) ont été fournis par G. Rubin (Janelia Research Campus).
Génération de la construction Act88F:Rpr et des mouches
Les souches Actin88F:Rpr (mouches Act88F:Rpr) ont été générées en utilisant une construction Actin88F:eGFP29. La lignée Act88F:GFP, qui abrite une construction eGFP pilotée par une région de 2053 pb du promoteur actin88F, a été obtenue de R. Benton (Université de Lausanne). Une construction Act88F:Rpr a été générée en utilisant d’abord la paire d’amorces suivante, pour ajouter un site de restriction KpnI à l’extrémité 5′ d’un clone d’ADNc rpr (IP02530, Drosophila Genomics Resource Center, Bloomington, IN) et un site XbaI à l’extrémité 3′ du cadre de lecture ouvert, via un kit de mutagenèse dirigée par site QuikChange (Agilent Technologies) :
Amorce avant 5′ AGACGGTACCATGGCAGTGGCATTC 3′
Amorce arrière 5′ GCCGCGTCTAGATCATTGCGATGGCTT 3′
La construction Rpr a ensuite été épissée dans la construction Act88F :eGFP derrière le promoteur Act88F à la place de la séquence eGFP. La construction Act88F:Rpr a été injectée dans des embryons de drosophile attp18 pour une transgénèse spécifique au site médiée par l’intégrase PhiC3135 (cytolocalisation du site d’atterrissage du transgène 6C12) par BestGene Inc. (Chino Hills, CA). Pour certaines expériences, ce transgène a été combiné avec UAS-GCaMP6s-p2A-tdTomato (généré dans le laboratoire de M.H.D.).
Imagerie par fluorescence des muscles de vol indirect
La microscopie fluorescente des hémi-thoraces a été réalisée36,37. Brièvement, les mouches ont été anesthésiées, puis leur tête et leur abdomen ont été retirés. Les thoraces ont été fixées pendant une nuit dans du paraformaldéhyde à 4 % à 4 °C et rincées dans une solution saline tamponnée au phosphate 1× (PBS) le jour suivant. Les spécimens ont été disposés sur une lame de verre, congelés instantanément dans l’azote liquide et coupés en deux dans le plan midsagittal à l’aide d’une lame de rasoir. Les IFM ont été colorés avec de la phalloïdine Alexa-Fluor 568 (1:100 dans du PBS avec 0,1 % de Triton-X (PBST)) pendant une nuit à 4 °C, rincés avec du PBS et visualisés à l’aide du système d’imagerie cellulaire EVOS® FL (Life Technologies) à un grossissement de ×4. Pour l’imagerie complète des myofibrilles de l’IFM, les mouches ont été préparées et les thorax coupés en deux comme décrit ci-dessus. Les hémi-thoraces ont été colorées avec de la phalloïdine Alexa-Fluor 568 (1:100 dans PBST) pendant la nuit à 4 °C. Les échantillons ont été rincés dans du PBS, montés avec du Vectashield (Vector Laboratories) et visualisés à l’aide d’un microscope confocal Leica TCS SPE RGBV (Leica Microsystems) à un grossissement de 100x.
Imagerie par immunofluorescence des cerveaux et des cordons nerveux ventraux
Les cerveaux et les VNC ont été disséqués de mouches femelles de 2-3 dpe dans du PBS. Les tissus ont ensuite été fixés pendant 20 min dans du paraformaldéhyde à 4% dans du PBS à température ambiante. Après la fixation, les cerveaux et les VNCs ont été lavés 2-3 fois dans du PBS avec 1% de Triton-X-100 (PBST) pendant 10 minutes chacun, puis incubés à 4 °C pendant la nuit dans du PBST. Les échantillons ont ensuite été placés dans du PBST avec 5% de sérum de chèvre normal (PBSTS) pendant 20 min à température ambiante. Ils ont ensuite été incubés avec des anticorps primaires (anti-GFP de lapin au 1:500, Thermofisher RRID : AB_2536526 ; anti-Bruchpilot/nc82 de souris au 1:20, Developmental Studies Hybridoma Bank RRID : AB_2314866) dilués dans du PBSTS pendant 48 h à 4 °C. Les cerveaux et les VNC ont été rincés 2 à 3 fois dans du PBST pendant 10 minutes chacun avant d’être incubés avec des anticorps secondaires (anticorps secondaire de chèvre anti-lapin conjugué à Alexa 488 au 1:500 ; Thermofisher ; anticorps secondaire de chèvre anti-souris conjugué à Alexa 633 au 1:500 ; Thermofisher) dilués dans du PBSTS pendant 48 heures à 4 °C. Enfin, les cerveaux et les VNC ont été rincés 2 à 3 fois pendant 10 min chacun dans du PBST et montés sur des lames avec des lamelles couvre-joint dans du Slowfade mounting-media (Thermofisher).
Les échantillons ont été imagés à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser Carl Zeiss LSM 700 avec les paramètres suivants : Grossissement ×20, plage dynamique de 8 bits, moyenne d’image 2×, taille de pixel de 0,52 × 0,52 μm, intervalle de pas en z de 0,57 μm. Les projections en z de l’écart-type des volumes d’imagerie ont été réalisées à l’aide de Fiji38. Pour comparer l’expression de la GFP dans le système nerveux central, l’intensité du laser et les gains PMT pour le canal vert ont été maintenus constants dans les échantillons de type sauvage, A1 > GFP, et Act88F:GFP.
Imagerie de l’expression de la GFP dans les muscles de la jambe
Les jambes ont été disséquées manuellement à l’articulation corps-coxa et montées sur des lames de verre à l’aide de ruban adhésif double face. Le milieu de montage Slowfade (Thermofisher) a ensuite été ajouté dans l’espace entre la lamelle couvre-objet et la lame. Nous avons ensuite enregistré la fluorescence de la GFP dans le canal vert en utilisant un microscope confocal à balayage laser LSM 700 (Zeiss). L’intensité du laser, les gains de la PMT et les paramètres de balayage sont restés constants pour les animaux de type sauvage, MHC > GFP et Act88F:GFP : Grossissement ×20, plage dynamique de 8 bits, moyenne d’image ×8, taille de pixel de 0,63 × 0,63 µm et intervalle de pas z de 10 µm. Auto-fluorescence cuticulaire a également été enregistrée dans le canal rouge.
Dissection thoracique pour l’imagerie VNC
Les supports personnalisés utilisés pour monter les mouches pendant l’imagerie ont été fabriqués comme décrit précédemment39. Pour l’imagerie VNC, ces étapes ont été modifiées pour avoir (i) des cales en acier plates plutôt que pliées, et (ii) des sommets chanfreinés pour rendre le tapis roulant sphérique visible aux capteurs de flux optiques (Shapeways, ‘file’). Les cales en acier ont été fabriquées à partir d’un acier inoxydable de 0,001 pouce, type 316 recuit à l’acide (McMaster-Carr, pièce n° 2317K11). Les cales ont été gravées (Etchit, Buffalo, MN) pour générer des trous rectangulaires comme expliqué ici. Le fichier de conception des cales se trouve ‘ici’.
Toutes les expériences ont été réalisées sur des mouches femelles 1-3 dpe élevées à 25 °C sur une nourriture standard à base de farine de maïs selon un cycle lumière:obscurité de 12 heures. Les mouches ont été anesthésiées à 4 °C. Une mouche femelle a été sélectionnée et, dans certains cas, ses ailes ont été coupées pour simplifier le processus de montage. Le thorax dorsal de la mouche a ensuite été poussé à travers un trou dans la cale en acier de la platine d’imagerie. La platine a ensuite été retournée, de la colle à séchage UV (Bondic, Aurora, ON Canada) a été soigneusement appliquée autour du périmètre du thorax et séchée par illumination UV (LED-200, Electro-Lite Co. Bethel, CT USA). De la colle UV a ensuite été utilisée pour fixer la tête et l’abdomen sur la face inférieure de la scène. La platine a ensuite été remplie de solution saline extracellulaire18. Sous un microscope de dissection à fort grossissement (Leica M165C), une aiguille hypodermique (30 G, BD PrecisionGlide, Franklin Lakes, NJ USA) a été utilisée pour trancher et soulever la cuticule du thorax dorsal40, en prenant soin de ne pas sectionner le connecteur du cou. Ensuite, chez les animaux non-Act88F:Rpr, une paire de pinces émoussées a été utilisée pour retirer les IFM, principalement de la région antéro-médiane du thorax recouvrant l’intestin (cette étape est inutile chez les animaux Act88F:Rpr). Ce processus expose la surface dorsale du proventricule, une grande structure intestinale bulbeuse. Avec beaucoup de précautions, une paire de pinces superfines a ensuite été utilisée pour saisir et soulever le proventricule afin de déplacer une grande partie de l’intestin (y compris le jabot et les glandes salivaires) du tissu nerveux situé plus ventralement. Une fois l’intestin soulevé, des ciseaux à clipper ultrafins (Fine Science Tools, Foster City, CA USA) ont été utilisés pour le sectionner dans sa partie la plus antérieure. Le proventricule a ensuite été retiré et une incision postérieure a été pratiquée pour retirer complètement ces parties de l’intestin, révélant ainsi le tissu nerveux sous-jacent. Notamment, cette dissection enlève également l’aorte, ce qui limite le flux d’hémolymphe provenant du vaisseau dorsal abdominal. Néanmoins, nous avons constaté que les mouches étaient viables et se comportaient jusqu’à 4 heures. Dans certains cas, nous avons observé que les tissus intestinaux ou musculaires commençaient à obscurcir le VNC pendant l’imagerie. Par conséquent, les tissus lâches doivent être enlevés à ce stade tout en faisant très attention à ne pas sectionner le VNC. Après chaque dissection, nous avons examiné dans quelle mesure l’animal bougeait ses pattes en réponse à une bouffée d’air ou saisissait un objet avec chacune de ses pattes. Cet examen s’est avéré être un indicateur précis de la réussite de la préparation. Pour évaluer la qualité d’une dissection, nous avons examiné les mouvements de chaque patte sur le tapis roulant sphérique. Si une mouche pouvait marcher de manière coordonnée, la dissection était considérée comme réussie. Dans le cas contraire, l’animal était classé comme ayant une déficience des mouvements des membres. Les animaux avec plusieurs pattes dysfonctionnelles ont été catégorisés comme incapables.
Microscopie à 2 photons pendant le comportement
Les expériences ont été réalisées dans la soirée heure Zeitgeber (Z.T.) et les animaux ont été généralement imagés 30-60 min après la dissection. Les supports de mouche ont été fixés à une plate-forme surélevée au-dessus du tapis roulant sphérique (figure supplémentaire 3a). Le VNC a ensuite été localisé à l’aide d’oculaires de microscope et positionné au centre du champ de vision par imagerie à 2 photons.
Le tapis roulant sphérique est une tige d’aluminium avec un trou en forme de boule fraisé à une extrémité22. Nous avons fabriqué des boules de mousse de 10 mm de diamètre (Last-A-Foam FR-7106, General Plastics, Burlington Way, WA USA) et les avons repérées manuellement à l’aide d’un stylo Rapidograph (Koh-I-Noor, Leeds, MA USA) afin de fournir des caractéristiques à fort contraste pour les mesures de flux optique. Un flux de 500-600 mL min-1 d’air filtré et humidifié est passé à travers le support à l’aide d’un contrôleur de flux numérique (Sierra Instruments, Monterey, CA USA). Les mouvements de la balle ont été mesurés à l’aide de deux capteurs de débit optiques (ADNS3080) équipés d’objectifs zoom (Computar MLM3X-MP, Cary, NC USA). La balle et la mouche ont été éclairées à l’aide d’une paire de LED IR (longueur d’onde maximale de 850 nm) couplées à des fibres optiques et des lentilles collimatrices (ThorLabs, Newton, NJ USA). Les mesures du flux optique ont été transmises à une carte microcontrôleur (Arduino Mega2560) pour être enregistrées à l’aide d’un code Python personnalisé. Simultanément, des enregistrements vidéo des animaux se comportant sur la balle ont été réalisés à l’aide d’une caméra firewire sensible aux IR (Basler, Ahrensburg, Allemagne) à environ 30 images par seconde.
Nous avons réalisé une microscopie à 2 photons à l’aide d’un microscope Bergamo II (ThorLabs) équipé de deux détecteurs GaAsP PMT pour l’imagerie de GCaMP6 et de tdTomato et couplé à un laser Ti:Sapphire (MaiTai DeepSee, Newport Spectra-Physics, Santa Clara, CA USA) accordé à 930 nm. Nous avons utilisé un objectif Olympus 20× à immersion dans l’eau avec 1,0 NA (Olympus, Center Valley, PA USA). Le microscope était contrôlé par le logiciel ThorImage (ThorLabs). Les expériences d’imagerie de coupes coronales ont été réalisées en mode d’imagerie Galvo-Galvo à 6-9 Hz. Cette fréquence d’images variait en fonction de la taille de l’image, qui était comprise entre 26,58 × 26,58 µm et 53,15 × 53,15 µm. La puissance du laser était comprise entre 3 mW et 5,7 mW. L’imagerie volumétrique est également possible avec le matériel approprié (par exemple, scanner à galvo-résonance et collier d’objectif à entraînement piézoélectrique).
Occasionnellement, une bouffée d’air était utilisée pour susciter des comportements de marche. Ces bouffées ont été codées numériquement (Honeywell AWM 3300 V, Morris Plains, NJ USA). Un logiciel ROS personnalisé, interfacé par un dispositif de sortie analogique (Phidgets, Calgary, Canada) au logiciel ThorSync (ThorLabs), a été utilisé pour synchroniser les mesures du flux optique, la vidéographie du comportement, les mesures des bouffées d’air et l’acquisition d’images à 2 photons. Pour l’imagerie en coupe coronale, un collier Piezo (Physik Instrumente, Karlsruhe, Allemagne) a été utilisé pour contrôler les mouvements rapides de l’axe z de l’objectif du microscope.
Pour comparer l’activité neuronale entre les animaux témoins et les animaux Act88F:Rpr, nous avons acquis des images de 512 × 512 pixels à 1,7 ips en utilisant une intensité laser et un gain PMT constants. Les régions d’imagerie sélectionnées ont été choisies empiriquement comme des sections horizontales constituées de points de repère observés à une profondeur de ~61-65 µm dans le film supplémentaire 1.
Comparaison de la marche avec ou sans dissection
Pour évaluer les effets de la dissection sur la locomotion, les animaux de type sauvage ont été soumis à la procédure suivante. Les animaux ont été montés sur des étages d’imagerie et une solution saline a été ajoutée à chaque étage. Seul un sous-ensemble aléatoire d’animaux a été disséqué. Chaque mouche montée a ensuite été placée sur le tapis roulant sphérique et ses comportements de marche ont été enregistrés pendant 30 minutes. Le flux optique a été enregistré comme décrit ci-dessus. Pour augmenter la probabilité de locomotion, une impulsion de 500 ms de CO2 à 100% a été dirigée sur les antennes de la mouche avec un intervalle d’une minute entre les impulsions (0,05 ln min-1 en utilisant un contrôleur de débit massique ; Vögtlin Instruments, Suisse).
Stimulation antennaire par laser infrarouge
Pour comparer les comportements de marche entre Act88F:Rpr et les animaux témoins, nous avons stimulé leurs antennes avec un laser proche infrarouge de 830 nm (Schäfter + Kirchhoff, Allemagne). Nous avons d’abord anesthésié des animaux femelles de 7-8 dpe à 4 °C et les avons montés sur des platines d’imagerie. Les mouches ont ensuite été acclimatées pendant 10 minutes. Pour chaque expérience, un animal a reçu dix impulsions de stimulation laser de 2 s (18,1 mW) sur son antenne droite, avec un intervalle de 60 s entre les impulsions. Les animaux témoins et les animaux Act88F:Rpr ont été testés en alternance afin de minimiser les effets du temps circadien sur les comparaisons comportementales.
Statistiques
La taille des échantillons pour les expériences sur les animaux a été choisie comme suit : nous avons réalisé au moins trois expériences pour illustrer les enregistrements neuronaux de population et clairsemés, et réalisé plus de dix expériences par groupe lors des comparaisons statistiques. Un critère préétabli de signaux de fluorescence à faible rapport signal/bruit a entraîné le retrait de deux expériences MDN de notre ensemble de données. Aucune randomisation ni aucun aveuglement n’ont été utilisés. Pour la stimulation laser antennaire, les données n’étant pas normalement distribuées, des tests de Friedman et de Mann-Whitney U ont été effectués. Les estimations de la variation sont présentées sous forme de moyenne et d’intervalles de confiance à 95 % bootstrapped.
Analyse des données
Nous avons analysé toutes les données à l’aide de scripts Python personnalisés. Comme la fréquence d’acquisition des données différait pour le flux optique, la vidéographie du comportement et l’imagerie à 2 photons, nous avons interpolé les signaux pour qu’ils correspondent à ceux de la fréquence la plus élevée. Ensuite, les données de flux optique ont été lissées à l’aide d’une moyenne courante (fenêtre = 200 ms), puis traduites en rotations s-1 pour les axes antérieur-postérieur, médial-latéral et lacet22. Pour rendre ces mesures plus intuitives, les rotations s-1 ont ensuite été converties en mm s-1 (1 rot s-1 = 31,42 mm s-1) pour les mouvements antéro-postérieurs (vforward) et médio-latéraux (vside) et en degrés s-1 (1 rot s-1 = 360° s-1) pour les mouvements de lacet (vrotation)22.
L’analyse de la locomotion chez les animaux disséqués (figure supplémentaire 2) a été effectuée comme suit. Les données de flux optique Vforward pour 20 mouches disséquées et 20 mouches non disséquées ont été sous-échantillonnées à 1500 points s-1 et lissées en utilisant une moyenne courante de durée 0,2 s. Pour calculer le pourcentage de temps de marche avant/arrière ou de marche latérale, deux seuils, -0,31 mm s-1 et +0,31 mm s-1, ont été définis empiriquement pour différencier l’immobilité de la marche avant (vers la droite) ou arrière (vers la gauche), respectivement. Les valeurs supérieures à 0,31 mm s-1 étaient considérées comme des moments de marche avant (vers la droite) et les valeurs inférieures à -0,31 mm s-1 comme des moments de marche arrière (vers la gauche). Les valeurs de flux optique entre ces seuils étaient considérées comme des moments d’immobilité. Le pourcentage de temps de marche a été calculé comme la proportion de points de données dans lesquels un animal n’était pas considéré comme immobile. De même, des seuils de 10,8 et -10,8 degrés s-1 ont été utilisés pour définir les moments de rotation. Un moment a été défini comme une période continue de marche ou de rotation.
De grandes déformations des tissus pourraient se produire pendant le comportement. Par conséquent, nous avons effectué un enregistrement post-hoc des images pan-neuronales (figure 2). Nous avons enregistré toutes les images d’une expérience d’imagerie à une image de référence. Comme la complexité des déformations ne pouvait pas être saisie à l’aide de modèles de mouvement paramétriques simples (par exemple, des transformations affines), nous avons utilisé une approche variationnelle non paramétrique, conçue pour modéliser des déformations arbitrairement complexes. Nous avons calculé le champ de mouvement w entre l’image de référence, notée Ir, et l’image au temps t, notée It, en résolvant le problème de minimisation
où D(w) est un terme d’ajustement des données, le second terme est une régularisation favorisant le lissage de w en pénalisant son gradient ∇w41, Ω est le domaine discret de l’image, et le paramètre λ équilibre les contributions des deux termes.
Les images deGCaMP6s présentent un défi pour l’estimation du mouvement car l’activité neuronale produit de grands changements d’intensité locaux. Par conséquent, nous avons utilisé un fluorophore supplémentaire indépendant de l’activité, tdTomato, et défini un terme de données de la forme
Le premier terme modélise l’hypothèse standard de conservation de l’intensité le long de la trajectoire de chaque pixel. Il est défini par
où nous utilisons une norme \(\ell _1\) pour gagner une robustesse partielle aux changements d’intensité42. Le deuxième terme de l’équation (2) est une contrainte d’appariement des caractéristiques inspirée par Revaud et ses collègues43, écrite comme suit
Dans les équations (2)-(4), Ir et It sont issus du canal tdTomato. La minimisation de la fonction ϕ favorise les vecteurs de mouvement w(x) pour être proches des correspondances de caractéristiques m(x, Ir, It), calculées sur un ensemble clairsemé de points clés pertinents. Nous obtenons m à l’aide de l’algorithme de correspondance de caractéristiques proposé par Revaud et ses collègues43, qui est spécifiquement conçu pour traiter les grandes déformations d’images. Nous calculons m en utilisant le canal d’imagerie tdTomato, de sorte que les correspondances sont également insensibles aux changements d’intensité entre Ir et It. Par conséquent, l’estimation est guidée par des correspondances de caractéristiques fiables. Le paramètre γ équilibre les deux termes de l’équation (2).
Pour chaque expérience, nous avons optimisé les valeurs de λ et γ en utilisant une recherche de grille pour enregistrer les images de section horizontale du VNC (figure supplémentaire 4). Comme fonction objective pour l’optimisation, nous avons utilisé le gradient de l’image moyenne temporelle44. De petites valeurs de λ (c’est-à-dire, λ < 1000), ont occasionnellement conduit à des artefacts dans les images enregistrées. Ces artefacts étaient associés à une forte convergence dans le champ vectoriel w(x) (figure supplémentaire 4c). Par conséquent, nous avons défini empiriquement les artefacts comme des grappes de pixels avec \({\mathrm{div}}\,{\mathbf{w}}\left( {\mathbf{x}} \right) < – 1,2\) et une cardinalité >20 (nous avons obtenu des résultats similaires avec une cardinalité >5). Enfin, nous avons sélectionné les valeurs λ et γ comme celles ne présentant aucun artefact et le gradient le plus élevé de l’image moyenne. Des exemples d’images non enregistrées, de champs de vecteurs de transformation et d’images enregistrées des trois exemples optimisés sont présentés dans le film supplémentaire 5.
Nous avons résolu le problème d’optimisation de l’équation (1) avec un algorithme de méthode du multiplicateur à direction alternée (ADMM)45. Nous avons introduit deux variables de fractionnement, associées aux termes de régularisation et de correspondance des caractéristiques, respectivement. Chaque sous-problème de l’algorithme a été résolu analytiquement. Nous avons utilisé des parties de la bibliothèque de problèmes inverses décrite dans la réf. 46. Un post-traitement basé sur un filtrage médian pondéré a été appliqué en utilisant la méthode de47.
Dans la figure 2, les comportements ont été annotés de manière semi-automatique, en utilisant un module Python personnalisé. Ce module permet à l’utilisateur de sélectionner deux régions d’intérêt (ROI) sur la première image de la vidéo. La première ROI est utilisée pour détecter la marche et doit être positionnée sur les pattes métathoraciques et mésothoraciques. La seconde ROI est responsable de la détection du toilettage des pattes prothoraciques et doit être positionnée devant la mouche. Pour détecter le mouvement dans ces régions, les images consécutives sont soustraites. Les images différentielles résultantes sont ensuite floutées au médian (rayon = 5 pixels), afin de réduire le bruit. Sur la base de cette image floue, un seuil sur le nombre de pixels non-zéros dans chacun des deux ROIs est appliqué pour extraire des séquences binaires des épisodes de toilettage et de marche. Notez que les mouvements des pattes prothoraciques observés pendant la marche sont ignorés (c’est-à-dire que la classification du toilettage est subordonnée à celle de la marche). Un filtre d’hystérésis a ensuite été appliqué pour filtrer en passe-bas les séquences comportementales binaires et pour supprimer les transitions qui se produisent sur trop peu d’images pour être biologiquement plausibles. Des exemples de ROIs et d’annotations comportementales sont illustrés dans le film supplémentaire 6. Ces données comportementales ont été utilisées dans la Fig. 2 comme indiqué dans le film supplémentaire 2. Elles ont été annotées en utilisant les paramètres suivants : seuil pour la marche = 400, seuil pour le toilettage = 5, longueur de l’hystérésis pour la marche = 8, longueur de l’hystérésis pour le toilettage = 10.
Pour les figures 2b, c, nous avons utilisé la régression linéaire pour trouver des régions dans le VNC associées soit à la marche, soit au toilettage. Les régresseurs Xw et Xg (pour la marche et le toilettage, respectivement) ont été construits à partir des deux séquences comportementales, Sw et Sg, à l’aide de l’équation (5) par convolution avec une réponse impulsionnelle du signal calcique à décroissance exponentielle (CIR) dérivée de la constante de temps mesurée pour GCaMP6s (t½ = 1,1448 s)19.
Les fonctions cibles étaient des traces ∆F/F pixel par pixel, où ∆F = Ft – F. Ft est la fluorescence au temps, t. F est un signal de fluorescence de base mesuré comme la valeur moyenne du pixel pour les dix premières images séquentielles de GCaMP6s dans lesquelles aucune activité cellulaire n’a été observée (c’est-à-dire, fluorescence GCaMP6s minimale et immuable).
Les poids des régresseurs ont été calculés à l’aide de l’équation (6).
où y est la trace ∆F/F au pixel près.
La figure 2b, c montre des cartes thermiques des poids des régresseurs, ww pour la marche et wg pour le toilettage, normalisés à leurs maxima respectifs. Le ROI 1 a été choisi comme une région de la carte de chaleur avec un poids élevé pour le toilettage mais un poids faible pour la marche. Le ROI 2 a été choisi comme l’emplacement spatial présentant la valeur la plus élevée de ww. Chaque ROI englobe une région d’un rayon de 15 pixels.
Pour identifier les données d’imagerie neuronale clairsemées des processus (figures 3-5), les ROI ont d’abord été sélectionnés à l’aide de scripts Python personnalisés qui dépendaient des bibliothèques OpenCV et Numpy. Pour ce faire, un cadre de référence a été sélectionné pour lequel le logiciel a identifié tous les ROIs potentiels. Pour ce faire, l’image GCaMP6s a été lissée pour réduire le bruit de fond, puis un seuil de filtre Otsu a été appliqué à l’image. Un facteur d’érosion a ensuite été appliqué à tous les objets détectés dans l’image. Les contours de tous les objets détectés ont ensuite été présentés à l’utilisateur pour une sélection manuelle. Une fois ces ROIs de référence sélectionnés pour les neurones gauche et droit, nous avons utilisé un algorithme d’enregistrement d’image basé sur la corrélation croisée48 pour identifier les ROIs gauche et droit les plus probables pour chaque image en fonction de ceux sélectionnés manuellement sur l’image de référence. Un deuxième script a été utilisé pour vérifier manuellement les ROIs sélectionnés automatiquement et, s’ils étaient incorrects, pour afficher tous les ROIs potentiels dans l’image pour une sélection manuelle. Si les valeurs d’érosion donnaient des ROI malformés, un autre script était utilisé pour positionner manuellement des ROI elliptiques d’orientation arbitraire sur une image donnée. Enfin, les images ROI binaires ont été utilisées comme masque d’image pour extraire les signaux de fluorescence moyens des images GCaMP6s ou tdTomato originales. Ces signaux ont été rapportés en %∆R/R comme dans la réf. 49 afin de réduire les effets du mouvement sur nos mesures. En raison de l’absence de stimuli, le R de base a été calculé comme le rapport minimum de GCaMP6s/tdTomato dans un bin de 2,5 s.
Pour détecter les augmentations transitoires de l’activité, nous avons développé un algorithme basé en partie sur la réf. 50. Nous avons d’abord déterminé quand la dérivée première du signal %∆R/R franchissait un seuil, qui a été déterminé en examinant toutes les valeurs dérivées pour une classe de neurones donnée (MDN, MAN, ou A1). Nous avons raisonné que les valeurs de seuil devraient être caractéristiques et potentiellement différentes pour chaque type de neurone car la dynamique de fluorescence est liée à des propriétés physiologiques intrinsèques qui peuvent différer entre les classes de neurones mais pas entre les expériences pour une seule classe. Nous avons fixé ce seuil au 97,5ème percentile pour les MDN et les dMAN et au 90ème percentile pour les neurones A1. Une valeur de seuil plus faible a été choisie pour les neurones A1 car beaucoup plus de transitoires de fluorescence ont été observés dans les traces A1. Ces transitoires auraient été négligés en utilisant un seuil de 97,5ème percentile. Pour identifier le début de l’augmentation de la fluorescence, nous avons trouvé le point temporel précédent le plus proche où la dérivée a croisé zéro. Ce passage par zéro est considéré comme le point temporel d’un « événement » associé à l’augmentation de fluorescence identifiée. Les événements détectés à proximité les uns des autres sans passage par zéro de la dérivée ont été regroupés en un seul événement associé au premier point temporel. Il y avait environ 10 expériences distinctes par animal. Les événements survenus dans les 10 premières et les 10 dernières secondes de chaque expérience n’ont pas été pris en compte car la fenêtre de présentation des données englobait 10 secondes avant et 10 secondes après chaque événement.
Parce que les activités du MDN et du dMAN gauche et droit covariaient fortement (figure supplémentaire 5), une étape supplémentaire a été effectuée pour la détection des événements : si des événements étaient détectés dans les neurones gauche et droit à moins de 2 secondes l’un de l’autre, les deux événements étaient retenus ; sinon, un événement identifié pour le neurone A (par ex, MDN gauche) et non le neurone B (par exemple, MDN droit) a également été ajouté à la bibliothèque d’événements du neurone B.
En revanche, les activités A1 gauche et droite ne covariaient pas fortement. Par conséquent, les événements ont été associés à un neurone et non à l’autre. Pour ce faire, si un événement était détecté à la fois pour les neurones A1 gauche et droit dans une fenêtre temporelle de 0,25 s, aucun des événements n’était utilisé pour l’analyse.
Les traces de %∆R/R et de flux optique liées à chaque événement ont été alignées en fixant les points temporels de l’événement à 0 s. Nous avons ensuite calculé la moyenne et les intervalles de confiance bootstrapped à 95 % pour ces traces alignées en utilisant la bibliothèque Python Seaborn. Les mesures de débit optique et de %∆R/R ont été sous-échantillonnées à 500 valeurs s-1 pour cette analyse. Pour plus de clarté, les traces %∆R/R ont été soustraites de la ligne de base pour les rendre nulles au moment de l’événement dans les panneaux de résumé (figures 3d, 4d et 5d, e). Les données de contrôle, mélangées (traces grises) ont été calculées en assignant des points de temps aléatoires à la place des événements réels et identifiés. Ces points de temps aléatoires ont été traités comme des événements réels et leur moyenne et leurs intervalles de confiance bootstrapped à 95 % ont été calculés et tracés à des fins de comparaison.
L’analyse de covariance (figure supplémentaire 5) a été réalisée à l’aide d’un script Python personnalisé qui dépendait des bibliothèques Matplotlib et Numpy. Des diagrammes de dispersion ont été calculés pour comparer les valeurs de %∆R/R des neurones gauche et droit de toutes les expériences pour chaque mouche séparément. Les valeurs r de Pearson sont rapportées en tant que moyenne ± écart-type.
Les comportements liés aux événements (Supplementary Movies 8, 10, 12 et 13) ont été sélectionnés manuellement à partir des événements détectés automatiquement, comme décrit ci-dessus. Pour les dMANs, les événements ont été sélectionnés parmi ceux qui maximisaient la différence de rotations antérieures-postérieures de la boule entre 1 s avant et 2 s après l’événement. Pour les MDN, les événements ont été sélectionnés parmi ceux qui minimisaient les rotations antérieures-postérieures de la boule jusqu’à 2 s après l’événement. Pour les neurones A1, les événements ont été sélectionnés parmi ceux qui maximisaient les rotations moyennes de la boule de lacet (positives pour les exemples de neurones A1 gauche et négatives pour les exemples de neurones A1 droit) jusqu’à 2 s après les événements.
Dans la figure supplémentaire 8, les réponses à la stimulation laser proche infrarouge ont été moyennées sur 10 essais pour chaque animal. Le flux optique a été sous-échantillonné à 500 valeurs s-1. La moyenne et les intervalles de confiance bootstrapped à 95 % pour les traces du flux optique ont été mesurés et tracés à l’aide de la bibliothèque Python Seaborn. La bibliothèque Python Scipy a été utilisée pour effectuer les tests U de Friedman et de Mann-Whitney.