Cycle GroEL/GroES : L’ATP se lie à un anneau ouvert avant la protéine substrat favorisant la liaison de la protéine et la production de l’état natif

Résultats

La liaison rapide de l’ATP à GroEL comme révélé par les changements d’intensité de fluorescence de GroEL F44C marqué avec Oregon Green 488.

Pour surveiller la liaison de l’ATP par GroEL, nous nous sommes appuyés sur une variante de GroEL produite précédemment, F44C, contenant une seule cystéine dans une version autrement  » cystéine-zéro  » de GroEL dans laquelle les 3 cystéines naturelles de la sous-unité GroEL (acides aminés 138, 458 et 519) ont été remplacées par une alanine (21). Comme l’illustre la figure 1A, F44 se trouve dans une boucle pointant vers le haut de la cavité centrale de GroEL au niveau du domaine équatorial, positionnée entre des β-brins équatoriaux antiparallèles près desquels se trouvent des résidus qui forment des contacts de liaison hydrogène avec le phosphate terminal de l’ATP lié par l’intermédiaire d’une molécule d’eau et d’un ion potassium. La boucle et le résidu 44 sont donc disposés à être affectés par l’absence ou la présence d’ATP. Une étude antérieure a rapporté qu’une substitution F44W pouvait rendre compte de la liaison à l’ATP (16). Ici, nous avons utilisé le mutant F44C, qui avait déjà été observé comme étant entièrement fonctionnel, comme l’indique la capacité de son plasmide codant à sauver la croissance d’un mutant déficient en GroEL et la capacité de la protéine purifiée à effectuer un repliement efficace de la protéine dépendant de l’ATP/GroES in vitro (21). F44C a été marquée avec le vert d’Oregon 488 (OG488)-maléimide à un niveau d’occupation de ≈70%. Il est resté entièrement fonctionnel dans la médiation du repliement de la malate déshydrogénase (MDH) in vitro, présentant une cinétique presque identique à celle de WT GroEL . Le taux de rotation de l’ATP à l’état d’équilibre par le mutant modifié, appelé EL44-OG, ressemblait également à celui de WT GroEL (Fig. S1B).

Les spectres d’émission de fluorescence de EL44-OG (excité à 496 nm) ont révélé que l’ajout d’ATP produisait une forte baisse de l’intensité de fluorescence à l’état d’équilibre (≈65 % dans 500 μM d’ATP), accompagnée d’un petit déplacement vers le bleu du maximum d’émission (figure 1B). En revanche, l’ADP a produit une plus petite chute d’intensité, ce qui soutient que le γ-phosphate de l’ATP a un effet spécifique sur la conformation de la boucle contenant 44.

Lors du mélange à flux arrêté de 0,5 mM d’ATP avec EL44-OG, une chute rapide de l’intensité d’émission a été observée, avec une courbe qui pourrait être ajustée comme la somme de 2 exponentielles, l’une avec une constante de vitesse de ≈100 s-1 et l’autre avec une constante de vitesse de 4 s-1 (Fig. 1C). Le premier taux indique une interaction rapide de l’ATP avec GroEL non ligandé et correspond aux taux rapportés précédemment à la fois pour F44W (réf. 16 ; 80 ± 5 s-1) et pour 2 autres versions de GroEL substituées par un tryptophane : Y485W, où un tryptophane a été substitué ailleurs dans le domaine équatorial (réf. 18 ; 123 ± 2 s-1), et R231W (réf. 17 ; 80 s-1), où un tryptophane a été substitué dans l’aspect faisant face à la cavité du domaine apical (GroEL est autrement dépourvu de tryptophane). Comme prévu, la vitesse d’interaction de l’ATP avec EL44-OG dépendait de la concentration d’ATP (Fig. 1D), et une constante de vitesse bimoléculaire de 2 × 105 M-1 s-1 a été déterminée pour la phase la plus rapide. La phase cinétique plus lente, également dépendante de la concentration en ATP, correspond probablement à la troisième phase fluorescente observée pour les R231W et Y485W de GroEL lors de la liaison à l’ATP (17, 18). La possibilité que cette phase reflète l’hydrolyse de l’ATP a été exclue en employant une chaperonine D398A/EL44-OG déficiente en hydrolyse.

Changement de fluorescence également rapide lors de la liaison de l’ATP à l’anneau trans ouvert du complexe asymétrique GroEL/GroES/ADP.

Dans des conditions physiologiques, l’état accepteur normal de l’ATP est l’anneau trans ouvert d’un complexe asymétrique GroEL/GroES/ADP. Avec un mélange à flux arrêté, nous avons observé que le taux de liaison de l’ATP à l’anneau trans des complexes EL44-OG/GroES/ADP était similaire à celui d’un anneau GroEL non ligandé (Fig. 1E, comparer avec Fig. 1F). Ici, il y avait également une dépendance de la concentration d’ATP ressemblant à celle de l’EL44-OG non ligandé (Fig. 1D).

Le polypeptide substrat lié à l’anneau trans n’affecte pas la vitesse de liaison de l’ATP.

Dans un certain nombre d’études in vitro, un polypeptide non natif a d’abord été complexé à l’anneau trans ouvert d’un complexe ADP GroEL/GroES asymétrique avant l’addition d’ATP et d’un excès de GroES (8, 9). Dans ces conditions, la liaison de l’ATP suivie de la liaison de GroES est clairement capable d’encapsuler le polypeptide non natif et de diriger le repliement productif. La vitesse de liaison de l’ATP dans un tel contexte est-elle affectée par la protéine substrat liée ? Pour le tester, la MDH non native a été liée aux complexes asymétriques EL44-OG/GroES/ADP, et l’ATP a ensuite été ajoutée avec un mélange à flux arrêté. Dans ces conditions, le taux de changement de l’intensité de la fluorescence était pratiquement identique à celui du complexe EL44-OG/GroES/ADP en l’absence de polypeptide (comparer la Fig. 1G avec la Fig. 1E). Ainsi, la présence d’un substrat non natif lié aux domaines apicaux de l’anneau trans n’a aucun effet détectable sur l’entrée rapide de l’ATP dans les poches équatoriales de liaison des nucléotides de l’anneau trans.

Mouvement rapide des domaines apicaux accompagnant la liaison de l’ATP.

Lorsque l’ATP se lie rapidement à GroEL, cela provoque-t-il un ajustement significatif dans les domaines de liaison polypeptidique apicaux sur la même échelle de temps rapide, ou les changements apicaux en réponse à la liaison de l’ATP sont-ils relativement lents, de sorte que les effets de la liaison de l’ATP doivent être considérés comme se produisant à un moment ultérieur ? L’étude antérieure de R231W avait déjà indiqué que les effets apicaux se produisaient rapidement avec ce mutant (17). Dans la présente étude également, une sonde fluorescente sur l’aspect extérieur des domaines apicaux, éloignée du site de liaison de l’ATP à l’intérieur du cylindre (GroEL E315C dans un fond de cystéine zéro marqué avec OG), a montré un changement rapide de l’intensité de fluorescence, sur la même échelle de temps que la liaison de l’ATP. Par exemple, une constante de vitesse de 20 s-1 a été observée pour un complexe asymétrique GroEL315-OG/GroES/ADP à une concentration d’ATP de 150 μM (figure 1H, à comparer avec 25 s-1 dans la figure 1E). De tels changements apicaux se sont produits dans le même anneau auquel l’ATP est lié, car l’analyse d’une version à un seul anneau modifiée par OG de E315C, SR315-OG, a montré un taux similaire de changement d’intensité de fluorescence (Fig. 1I). Le taux de mouvement apical était également dépendant de la concentration d’ATP, les taux étant parallèles à ceux de la liaison de l’ATP (Fig. S2, comparer avec la Fig. 1D).

La liaison relativement lente du polypeptide de substrat mesurée par FRET.

Pour permettre une comparaison du taux de liaison du polypeptide de substrat non natif avec celui de la liaison de l’ATP, nous avons ensuite mesuré le taux de liaison des protéines de substrat aux complexes GroEL/GroES/ADP asymétriques en utilisant la FRET. Trois protéines de substrat différentes ont été étudiées : MDH (33 kDa), Rubisco (51 kDa), et une forme double-mutante de la protéine de liaison au maltose (DM-MBP ; 41 kDa). Ces trois protéines se comportent comme des substrats stricts à 25 °C, nécessitant la présence de GroEL, GroES et ATP pour atteindre la forme native (3). En leur absence, une agrégation quantitative s’ensuit. Pour suivre la liaison, le FRET a été mesuré entre la protéine substrat marquée avec du coumarin propyl maleimide (CPM ; donneur) sur un résidu cystéine (voir Matériaux et Méthodes) et EL44-OG (accepteur). En excitant au maximum d’excitation du CPM (384 nm), les spectres d’émission ont été collectés pour les substrats marqués au CPM (donneur) lorsqu’ils sont liés à GroEL non marqué (Fig. 2A, DM-MBP-CPM comme exemple, trace noire), pour EL44-OG complexé avec un substrat non marqué (Fig. 2A, accepteur marqué, trace bleue), ou pour les complexes avec le substrat marqué au CPM lié à EL44-OG (Fig. 2A, trace rouge). Pour la DM-MBP-CPM et la MDH-CPM, il y avait une forte extinction du donneur lors de l’association avec EL44-OG ; en même temps, il y avait l’apparition d’un signal d’accepteur substantiel.

Lors du mélange à flux arrêté de 125 nM de DM-MBP-CPM avec 125 nM d’EL44-OG, une chute de l’intensité d’émission du donneur a été observée, avec une courbe qui pouvait être ajustée comme la somme de 2 exponentielles, l’une avec une constante de vitesse de 1,33 s-1 et l’autre avec une constante de vitesse de 0,65 s-1 (Fig. 2B). Le taux le plus rapide (k1) dépendait de la concentration de chaperonine (Fig. 2C), mais pas le taux le plus lent. À une concentration de GroEL de 125 nM (Fig. 2B), le taux de liaison du polypeptide substrat (k1 = 1,33 s-1) est 60 fois plus lent que le taux de liaison de l’ATP (100 s-1 à 500 μM d’ATP ; Fig. 1C). Bien que l’on puisse prévoir que la vitesse de liaison du substrat soit plusieurs fois supérieure à la concentration physiologique de GroEL de 1 à 2 μM (figure 2C), la vitesse de liaison de l’ATP serait aussi probablement un peu plus grande, étant donné que la concentration physiologique d’ATP est de plusieurs millimolaires (figure 1D). Ainsi, le taux d’arrivée de l’ATP dans des conditions physiologiques est probablement au moins 10 fois supérieur à l’arrivée du substrat.

Dans un autre test, l’ajout d’ATP en même temps que de la DM-MBP marquée par fluorescence a eu un effet reproductible d’augmentation du taux de liaison de la DM-MBP (figure 2D et tableau S2). En somme, l’ordre physiologique d’addition à un anneau trans semble comprendre une arrivée rapide de l’ATP suivie d’une arrivée plus lente de la protéine substrat. Cet ordre est opposé à celui programmé dans des études récentes, où le polypeptide était initialement lié à l’anneau trans et l’ATP était ensuite ajouté (8, 9). L’ordre d’addition a-t-il un effet mesurable sur le repliement de la protéine substrat ? Pour le vérifier, nous avons réalisé des expériences d’ordre d’addition et mesuré la récupération de l’enzyme native dans des conditions essentiellement à un seul tour.

Récupération plus étendue de l’état natif lorsque l’ATP est ajouté en premier, suivi du polypeptide, par rapport à l’ordre opposé.

Une expérience d’ordre d’addition a été réalisée en utilisant la version à un seul anneau de GroEL, SR1, permettant une analyse « à un seul tour ». Le polypeptide capturé par SR1 est presque quantitativement plié en forme native, après la liaison de GroES, à l’intérieur de la cavité cis à longue durée de vie du complexe stable SR1/GroES (10, 11). Ainsi, SR1 peut être incubée avec de l’ATP et un polypeptide non natif dans n’importe quel ordre, suivi par l’addition de GroES, et le degré de récupération de la protéine native peut être mesuré en fonction de l’ordre d’addition et de l’intervalle entre les additions (Fig. 3A). Pour ces tests, GroES a été ajouté 2 secondes après ATP/polypeptide pour permettre l’achèvement des interactions initiales. Dans une première expérience, nous avons observé de manière reproductible que lorsque la Rubisco non native était ajoutée en premier, suivie 2 sec plus tard par l’ATP, l’étendue de la récupération de la Rubisco sous forme native était seulement ≈30%. Ceci est à comparer avec une récupération de >60% lorsque l’ATP a été ajouté en premier et avec la récupération de ≈70% observée lorsque l’ATP et GroES ont été ajoutés à un complexe binaire Rubisco-SR1 préformé (produit par une incubation de 10 minutes de Rubisco non native avec SR1). Cela suggère que dans le contexte d’une réaction de cyclisation dans laquelle le cycle trans d’un complexe accepteur GroEL/GroES/ADP est ouvert et disponible pour la liaison du polypeptide pendant seulement ≈1-2 s avant que GroES ne se lie, la mobilisation de ses domaines apicaux par la liaison rapide de l’ATP favorise la liaison du polypeptide non natif. L’ordre opposé, l’ajout du polypeptide 2 s avant l’ATP, est apparu moins favorable à la liaison, même si les domaines apicaux mobilisés par l’ATP étaient ensuite disponibles pendant 2 s avant l’ajout de GroES. Notamment, lorsque l’intervalle entre les ajouts de Rubisco et d’ATP a été porté à 4 s (Fig. 3A), l’effet de l’ordre d’ajout a été atténué, la cinétique et l’étendue de la récupération étant maintenant égales à celles de l’ajout d’ATP en premier, ce qui est probablement une fonction de la liaison plus importante du polypeptide pendant l’intervalle précédant l’ajout d’ATP. Bien que l’étendue de la récupération de la Rubisco dans les études d’ordre d’addition avec un intervalle de 2-s ait été significativement affectée, la cinétique de récupération de l’état natif à l’intérieur des complexes SR1/GroES stables était similaire, ce qui est cohérent avec un effet sur la liaison des protéines du substrat et non sur le taux de repliement dans la chambre encapsulée.

La liaison plus étendue de la Rubisco avec l’ATP ajouté en premier.

Pour aborder l’effet de l’ordre d’addition sur la liaison de la protéine substrat, nous avons utilisé la Rubisco marquée au 35S et mesuré la quantité qui est devenue liée par SR1 pendant les incubations de l’ordre d’addition en utilisant la filtration sur gel des mélanges de produits finaux pour séparer les complexes stables SR1/GroES/Rubisco du polypeptide non lié. Cela a révélé que ≈10 000 cpm 35S-Rubisco s’étaient liés lorsque 40 000 cpm 35S-Rubisco (125 nM) ont été ajoutés 2 secondes avant l’ATP et que ≈30 000 cpm s’étaient liés lorsque l’ATP a été ajouté 2 secondes avant la Rubisco (figure 3B). Ce dernier degré de liaison a également été obtenu lorsque les complexes binaires SR1-Rubisco formés sur une période de 10 min ont ensuite été incubés avec l’ATP et GroES ensemble (Fig. 3B). Ces mesures de l’étendue de la liaison du substrat sont donc parallèles à l’étendue de la récupération de l’activité enzymatique (comparez la figure 3B avec la figure 3A) et soutiennent la conclusion que dans le contexte d’un intervalle de 2 s entre l’ajout d’ATP/polypeptide, l’ajout d’ATP favorise initialement une liaison plus efficace de la protéine substrat.

Taux plus élevé de liaison de Rubisco à un anneau de chaperonine exposé à l’ATP.

L’observation précédente d’une plus grande étendue de la liaison de Rubisco dans une expérience d’ordre d’addition dans laquelle l’ATP est ajouté initialement suggère que le taux d’association de Rubisco avec les domaines apicaux mobilisés par l’ATP pourrait être plus élevé. Pour tester cela, une version D398A de SR1 déficiente en hydrolyse de l’ATP avec OG attaché à une cystéine substituée en position 44 (dans un fond C138A) a été utilisée pour rapporter par FRET le taux de liaison de Rubisco marqué au CPM (Fig. 3 C-E). Nous avons observé que le taux de liaison de la Rubisco, effectué dans les mêmes conditions que les expériences précédentes sur l’ordre d’addition, était 2 fois plus élevé en présence qu’en l’absence d’ATP (comparer la Fig. 3D avec la Fig. 3C). Lorsque l’ATP et la Rubisco non native ont été ajoutés simultanément, reflétant la situation physiologique, le taux de liaison de la Rubisco ressemblait à celui obtenu lorsque l’ATP avait été ajouté avant la Rubisco (Fig. 3E, comparer avec Fig. 3D). Ces données confirment que la Rubisco s’associe plus rapidement à un anneau dont les domaines apicaux ont été mobilisés par l’ATP et que, dans des conditions physiologiques où l’ATP et le substrat non natif sont présents, ce sont les domaines apicaux mobilisés par l’ATP qui interviennent dans la liaison du substrat.