Bookshelf

Facteurs correcteurs et signaux de reconnaissance

Un système modèle pour la thérapie de remplacement enzymatique est né d’études sur des fibroblastes cutanés en culture dérivés de patients atteints de maladies de stockage des mucopolysaccharides (MPS). Ces fibroblastes présentaient une accumulation excessive de glycosaminoglycanes, ce qui a été interprété comme étant dû à une dégradation inadéquate de ces macromolécules . On a découvert fortuitement qu’un mélange de fibroblastes provenant de patients atteints de MPS I (syndrome de Hurler) et de MPS II (syndrome de Hunter) présentait un schéma normal de métabolisme des glycosaminoglycanes (figure 1) . Les deux maladies étaient connues pour être génétiquement distinctes, la MPS I étant transmise de manière autosomique récessive et la MPS II étant une maladie liée au chromosome X, ce qui a conduit Fratantoni et al. à émettre l’hypothèse que les fibroblastes de différents génotypes se fournissaient mutuellement le produit du gène manquant. D’autres études ont montré qu’il n’était pas nécessaire que les cellules génétiquement distinctes soient en contact les unes avec les autres pour qu’il y ait correction croisée, car le milieu conditionné par l’une pouvait être correcteur pour l’autre. La stratégie de correction croisée pourrait être étendue à des maladies apparentées – les cellules qui se corrigent mutuellement auraient un génotype différent, tandis que les cellules qui ne se corrigent pas auraient le même génotype (mais voir l’importante exception ci-dessous).

Comme le syndrome de Hurler avait été postulé comme étant une maladie de stockage lysosomale basée sur l’observation des lysosomes hépatiques dramatiquement gonflés chez les patients affectés , Fratantoni et al. ont émis l’hypothèse que les « facteurs correctifs » dans le milieu conditionné pourraient être des enzymes lysosomales qui ont été sécrétées par une lignée cellulaire et endocytosées par l’autre. Cependant, les facteurs correctifs ne correspondaient à aucune enzyme lysosomale connue à l’époque (cette situation a changé quelques années plus tard, lorsqu’une MPS déficiente en β-glucuronidase a été découverte ). La purification des facteurs correcteurs de Hurler et de Hunter a été entreprise, non pas à partir d’un milieu conditionné mais à partir de l’urine, un fluide corporel relativement riche en enzymes lysosomales. Une fonction a été attribuée aux facteurs purifiés en utilisant une variété de méthodes biochimiques, ce qui a permis de nommer les facteurs correcteurs de Hurler et de Hunter respectivement α-l-iduronidase et iduronate sulfatase .

Les cellules qui avaient besoin du facteur correcteur de Hurler pour normaliser leur métabolisme des glycosaminoglycanes (provenant de patients atteints du syndrome de Hurler et du syndrome de Scheie ) étaient également déficientes en activité α-l-iduronidase ). La correction des fibroblastes de Hurler s’est accompagnée d’une captation de l’α-l-iduronidase. Comme de bons présages pour la thérapie de remplacement enzymatique, l’absorption était remarquablement efficace et seule une très petite quantité d’α-l-iduronidase devait être internalisée afin de fournir une correction complète.

Cela aurait pu être la fin de l’histoire, sauf pour une petite divergence dans le schéma d’élution de l’activité enzymatique et de l’activité correctrice à partir d’une colonne d’hydroxyapatite , suggérant que les deux activités du facteur correcteur de Hurler n’étaient pas précisément identiques. Suite à cette divergence, Shapiro et al. ont séparé l’α-l-iduronidase en fractions correctrices et non correctrices sur une colonne d’héparine-Sepharose, ce qui indique que le facteur correcteur présentait une caractéristique qui n’était pas nécessaire à l’activité catalytique mais qui était nécessaire à l’absorption. De même, de multiples formes de β-glucuronidase ont été trouvées, différant dans l’absorption et l’activité correctrice .

L’existence d’un signal spécifique pour l’absorption d’une enzyme lysosomale avait été suggérée par les résultats d’une étude sur un trouble nouvellement découvert ressemblant au MPS – nommé maladie des cellules d’inclusion (maladie des cellules I) en raison des inclusions denses à phase proéminente dans les fibroblastes cultivés . Alors que ces fibroblastes présentaient de multiples déficiences en enzymes lysosomales, le milieu qui les entourait contenait un large excès d’enzymes lysosomales . Cependant, les enzymes sécrétées par les fibroblastes atteints de la maladie des cellules I n’étaient pas endocytosées par d’autres cellules et n’étaient pas correctives ; on peut supposer qu’elles n’avaient pas le signal nécessaire pour être absorbées par les lysosomes. Étant donné qu’un certain nombre d’enzymes lysosomales étaient affectées par cette anomalie génétique unique (la maladie des cellules I est héritée de manière autosomique récessive), on a supposé que le signal était une modification post-traductionnelle des protéines enzymatiques. On a également supposé qu’il s’agissait d’un hydrate de carbone par nature, car il pouvait être détruit par un traitement léger au periodate. Le concept d’un système de reconnaissance basé sur les hydrates de carbone a été fortement influencé par les découvertes d’Ashwell et de ses collègues concernant le rôle des hydrates de carbone dans l’absorption des glycoprotéines circulantes par le foie.

La présence d’un signal spécifique reconnaissable impliquait un processus saturable, médié par un récepteur, et suggérait que l’absorption des enzymes lysosomales suivrait la cinétique de Michaelis-Menten. On s’attendait à ce que des analogues des signaux de reconnaissance se comportent comme des inhibiteurs compétitifs de l’absorption. Cette hypothèse a été étudiée par le biais de l’absorption d’α-l-iduronidase et de β-glucuronidase par les fibroblastes déficients correspondants. La découverte par Kaplan et al. que le meilleur inhibiteur de l’absorption de la β-glucuronidase était le mannose-6-phosphate (M6P), et leur suggestion que le M6P était (ou faisait partie) du signal de reconnaissance tant recherché, était surprenante, car aucun hydrate de carbone phosphorylé n’avait été signalé auparavant sur les glycoprotéines des mammifères. Elle a été immédiatement confirmée pour l’absorption de l’α-l-iduronidase et d’autres enzymes lysosomales, à l’aide de diverses méthodes biochimiques ; la preuve ultime est venue de l’analyse structurelle des groupes glucidiques phosphorylés. Le signal découvert par endocytose s’est également avéré être le signal permettant de cibler les hydrolases naissantes vers les lysosomes .

Le défaut dans la maladie des cellules I, qui empêche les cellules de synthétiser le signal de reconnaissance du M6P, s’est révélé être une déficience de la première des deux enzymes impliquées dans la synthèse du signal du M6P . Deux récepteurs du M6P ont été découverts ; la chimie et la biologie des récepteurs du M6P et leur rôle dans le trafic cellulaire sont devenus un vaste domaine très actif de la biologie cellulaire. Ces sujets font l’objet de nombreuses études, dont les chapitres 3 et 5 du présent ouvrage. L’importance du système M6P pour la thérapie de remplacement des enzymes sera discutée ci-dessous.

Concurremment à ces études sur les fibroblastes en culture, un système in-vivo a permis de découvrir un autre signal pour l’absorption des enzymes lysosomales. On a constaté que plusieurs enzymes lysosomales, injectées par voie intraveineuse à des rats, étaient rapidement éliminées de la circulation ; cependant, elles persistaient beaucoup plus longtemps si elles étaient prétraitées avec du périodate ou si elles étaient co-injectées avec une agalactoglycoprotéine. Une fois de plus, on a supposé que les glucides fournissaient des signaux pour une reconnaissance spécifique. Dans ce cas, le sucre clé pour la reconnaissance était le mannose, et l’absorption se faisait dans les cellules réticulo-endothéliales du foie. Le récepteur du mannose, qui reconnaît la N-acétylglucosamine et le l-fucose ainsi que le mannose, est présent à la surface des macrophages. Il est d’un certain intérêt historique que les expériences d’absorption de l’invertase, qui ont figuré en bonne place dans la proposition originale de la thérapie de remplacement d’enzyme (voir ci-dessus), ont été couronnées de succès parce que l’invertase est une glycoprotéine avec des chaînes de mannose qui sont reconnues par le récepteur de mannose.