La centrifugation différentielle est une méthode utilisée pour séparer les différents composants d’une cellule sur la base de la masse. La membrane cellulaire est d’abord rompue pour libérer les composants de la cellule à l’aide d’un homogénéisateur. Le mélange résultant est appelé homogénat. L’homogénat est centrifugé pour obtenir un culot contenant les organites les plus denses. Les composés les plus denses formeront un culot à des vitesses de centrifugation plus faibles, tandis que les composés moins denses resteront probablement dans le liquide surnageant au-dessus du culot. À chaque fois, le surnageant peut être centrifugé à des vitesses plus rapides pour obtenir les organites moins denses. La réalisation d’une centrifugation par étapes, dans laquelle la vitesse de centrifugation est augmentée à chaque fois, permet de séparer les composants en fonction de leur masse. Le noyau plutôt dense est le plus susceptible d’être trouvé après la première étape de centrifugation, suivi des mitochondries, puis des organites plus petits, et enfin du cytoplasme, qui peut contenir des protéines solubles.
La sédimentation à l’équilibre utilise un gradient d’une solution pour séparer les particules en fonction de leurs densités individuelles (masse/volume). Un aspect pivot de ce type de sédimentation est qu’il est complètement indépendant de la forme de la molécule. Il est utilisé pour purifier la centrifugation différentielle. Une solution est préparée avec la partie la plus dense du gradient au fond. Les particules à séparer sont ensuite ajoutées au gradient et centrifugées. Chaque particule avance jusqu’à ce qu’elle atteigne un environnement de densité comparable. Un tel gradient de densité peut être continu ou préparé de manière incrémentielle. Par exemple, lorsqu’on utilise du saccharose pour préparer des gradients de densité, on peut faire flotter avec précaution une solution de saccharose à 40% sur une couche de saccharose à 45% et ajouter d’autres couches moins denses au-dessus. L’homogénat, préparé dans un tampon dilué et brièvement centrifugé pour éliminer les tissus et les cellules non brisées, est ensuite superposé. Après centrifugation, généralement pendant une heure à environ 100 000 x g, on peut observer d’une couche à l’autre des disques de composants cellulaires résiduels en raison du changement de densité. En ajustant soigneusement les densités des couches pour correspondre au type de cellules, des composants cellulaires spécifiques peuvent être enrichis.
L’équilibre de sédimentation est assez utile car un culot n’est pas formé. La vitesse de rotation crée une force suffisante pour que la protéine quitte le rotor, mais elle ne la condense pas en un culot. Ceci est dû au fait qu’un gradient de concentration de la protéine est produit. La diffusion réagit pour contrer la création de ce gradient et après un certain temps, un équilibre parfait entre sédimentation et diffusion est atteint.
L’équilibre de sédimentation est également pratique pour étudier les interactions entre les protéines. En particulier, il est utilisé pour déterminer l’état natif ou la conformation native de la protéine. L’état natif nous indique la structure exacte en trois dimensions. Cette information comprend si c’est un monomère, un dimère, un trimère, un tétramère, etc. Un monomère est une protéine constituée d’une seule sous-unité. Un dimère est constitué de deux sous-unités protéiques qui ont subi une rotation de 180 degrés. Un trimère est constitué de trois sous-unités, etc. Ce type d’expérimentation nous permet également de déterminer si les protéines peuvent former des oligomères (chaînes polypeptidiques identiques qui constituent deux unités ou plus d’une protéine). En outre, l’équilibre de sédimentation a pour utilité de déterminer les constantes d’équilibre pour les interactions protéine-protéine et protéine-ligand. La valeur de ce Kd est souvent comprise entre 1nM et 1mM. On le calcule en mesurant la constante d’équilibre (Kd). Une dernière utilisation de cette méthode consiste à déterminer les rapports stœchiométriques entre les complexes protéiques. Un exemple de ceci est un ligand et son récepteur ou une paire antigène-anticorps
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