Base clinique, génétique et structurelle de l’excès apparent de minéralocorticoïdes dû au déficit en 11β-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 2

Résultats

Nous rapportons les données démographiques et le phénotype clinique de 36 patients AME génétiquement confirmés du Consortium international des troubles stéroïdiens rares. La majorité des patients étaient d’origine omanaise (22 sur 36) et perse (6 sur 36), 75 % d’entre eux étant issus de mariages consanguins, principalement au sein d’Oman (Fig. 1B et Tableau S1). L’âge médian au moment du diagnostic de l’AME était de 4,6 ans (fourchette : 0,1-15) et la cohorte était répartie de manière égale pour les deux sexes. La majorité des patients (86 %) sont nés à terme, 76 % étant nés petits pour l’âge gestationnel. La figure 1A montre que, dans notre cohorte, il y avait six mutations faux sens, une insertion, deux délétions et trois décalages de cadre, ainsi que deux indels. Comme on pouvait s’y attendre au vu de la physiopathologie de l’AME, la pression artérielle moyenne était élevée au-dessus du 90e percentile pour tous les sujets (Fig. 1C). Le taux moyen de potassium sérique au moment du diagnostic était faible, à 2,72 mmol/L (plage : 1,5-4,1 mmol/L), tandis que le taux de bicarbonate sérique était élevé, à 29,5 mmol/L (plage : 20-38 mmol/L) (Fig. 1 D et E). Les taux sériques d’aldostérone étaient, comme on pouvait s’y attendre, faibles (Fig. 1F), deux patients présentant des taux élevés pour des raisons peu claires. De plus, les taux de rénine étaient faibles, sauf pour deux patients (10,4 et 14 ng/mL/h) qui étaient sous traitement (tableau S1). Dans un sous-ensemble de 29 patients, le rapport moyen (THF + alloTHF)/THE, représentant les principaux métabolites urinaires du cortisol et de la cortisone, était significativement élevé à 19 (intervalle : 3-55, normal : 1,0) (Fig. 1G). Il convient de noter que 27 des 36 patients (75 %) présentaient également une néphrocalcinose. La néphrocalcinose peut provenir d’une hypokaliémie chronique de longue durée, comme cela a été noté, par exemple, dans le syndrome de Bartter de type III (14).

Pour comprendre si le phénotype clinique de la déficience en HSD11B2 pouvait être prédit en examinant les modifications de la structure enzymatique induites par une mutation HSD11B2 donnée, nous avons effectué des analyses in silico en utilisant trois HSD17B1 œstrogéniques qui présentaient une similarité de séquence de 27% avec HSD11B2 sur 284 acides aminés (Fig. S1A). Le modèle HSD11B2 humain présentait un motif de pliage de Rossmann caractéristique de liaison au NAD (Fig. S1B) avec un site adjacent de liaison au substrat (Fig. S1 C et D). Les simulations MD à 500 ns des formes monomère et dimère de HSD11B2 ont indiqué un modèle stable avec une protéine repliée de manière stable (Fig. S1 E-H). Nous avons utilisé le logiciel Internal Coordinate Modeling (ICM) (www.molsoft.com) (18) pour déterminer le ΔΔG des mutations faux-sens trouvées chez les patients AME ou des mutations créées expérimentalement. Toutes les mutations (Fig. 2A) ont montré une augmentation des valeurs ΔΔG, suggérant la perte de stabilité et de fonction de la protéine (Fig. 2B).

HSD11B2 existe sous forme d’homodimère dans son état inactif (13). Quatre résidus, à savoir R186, E190, A237 et R336, se trouvent à l’interface du dimère et pourraient donc interférer avec la formation du dimère (figure 2C). Les résidus R186 et E190 sont positionnés à l’interface du dimère sur l’hélice α4. Une interaction de paire d’ions intersous-unité (R186-E190) est formée en raison de la symétrie inversée double de la sous-unité adjacente (Fig. 2D), semblable à la paire d’ions R112-E120 dans HSD17B1 (15⇓-17). Il est important de noter que cette interaction s’est avérée stable et a été maintenue tout au long des simulations MD de 500 ns (Fig. 2 E-G). De plus, l’interaction s’est avérée stabiliser l’hélice α4 et maintenir la flexibilité autour du site de liaison des coenzymes. Ainsi, la mutation R186C entraîne la perte de la paire d’ions intersous-unitaire et pousse l’équilibre vers la formation d’une enzyme monomère active (Fig. 2H). Elle empêche également la formation de l’interaction intra-hélicoïdale de la paire d’ions et permet ainsi la déstabilisation des éléments structurels autour du site de liaison aux coenzymes.

Il existe plusieurs autres mutations perturbatrices au niveau de cette interface du dimère impliquant les résidus A237, D244, L251 et D176. Le résidu A237 est entouré par L241 et V239 des deux sous-unités HSD11B2. Sa mutation en Val augmente l’hydrophobie de ce groupe et renforce l’état dimérique inactif de l’enzyme (Fig. 2I). Le résidu D244 crée non seulement un pont salin intrasous-unité avec R336 qui maintient l’hélice α5 et les feuillets β7 ensemble, mais aussi des interactions par liaison hydrogène avec R360 de la sous-unité adjacente (Fig. 2J). Sa mutation en Asn diminue la force de l’interaction R360, conduisant à la perte du pont salin avec R366 ; ce qui, à son tour, altère la stabilité de la protéine. De même, la mutation de la chaîne latérale hydrophobe L251 en groupe hydroxyle de Ser augmente la polarité et forme une liaison hydrogène avec les groupes de la chaîne latérale chargés positivement de R361 ; ceci améliore la liaison du dimère (Fig. 2K). Enfin, la mutation de D176 en Asn crée une liaison hydrogène entre l’asparagine et T200, ce qui renforce l’état de dimère inactif (Fig. 2L).

Les mutations des résidus de HSD11B2 qui forment la poche de liaison au substrat ou à la coenzyme (NAD+) ont montré dans des études in vitro qu’elles éliminent l’activité enzymatique (19) et provoquent un EAM sévère. Par exemple, Y226 est situé dans la poche de liaison au substrat (Fig. 3A). La chaîne latérale du phénol aromatique forme des interactions hydrophobes avec le cycle aromatique du substrat. La mutation Y226N remplace ce résidu par un résidu non aromatique, ce qui entraîne la perte de l’empilement hydrophobe, qui interfère avec la liaison du substrat (Fig. 3A). De plus, cette mutation fait passer la chaîne latérale d’hydrophobe à hydrophile, ce qui est défavorable à la liaison d’un substrat hydrophobe. La mutation A221V remplace la chaîne latérale courte par une chaîne latérale légèrement plus volumineuse de Val, interférant ainsi avec la liaison du substrat en réduisant le volume de la poche, tandis que la mutation A221G diminue l’hydrophobie et introduit une flexibilité autour de la poche de liaison rigide (Fig. 3B).

Notre modèle montre que le groupe polaire 17-OH dans le cortisol est rentré dans une région hydrophobe entourée par Y226, P227 et L229. Ce groupe hydroxyle est absent dans la corticostérone, ce qui entraîne une augmentation des interactions hydrophobes et une affinité de liaison ∼10 fois plus élevée pour HSD11B2 par rapport au cortisol (Fig. S2A). Outre le rein, HSD11B2 est également exprimé dans le placenta. Bien que le récepteur minéralocorticoïde ne soit pas exprimé dans ce tissu, HSD11B2 inactive le cortisol pour éliminer ses effets inhibiteurs de croissance et proapoptotiques pendant le développement embryonnaire. Pendant la grossesse, le niveau élevé de progestérone dans la circulation maternelle peut se lier à l’activité de HSD11B2 et la moduler. Cela peut se traduire par les effets de toute mutation de perte de fonction qui perturbe la liaison à la progestérone sur le poids de naissance. Par exemple, la mutation A221V affecte gravement la liaison de la progestérone plus que celle du cortisol en raison des conflits stériques entre Val et les groupes méthyles saillants dans la progestérone (Fig. S2B). De manière très intéressante, nous constatons que les deux patients présentant les mutations A221V étaient petits pour leur âge gestationnel (tableau S1). De même, la mutation A221G affecte indirectement la liaison à la progestérone en modifiant la structure du site de liaison. De même, la mutation Y226N est plus préjudiciable à la liaison de la progestérone car elle réduit les interactions hydrophobes entre le squelette de la progestérone et le cycle hydroxyphényle de la tyrosine (Fig. S2B). En revanche, P227 fournit un support structurel indirect au site de liaison, et la mutation en Leu a des effets similaires pour le cortisol et la progestérone (Fig. S2B).

Il existe quatre mutations qui résident dans le site de liaison du coenzyme et le perturbent, altérant ainsi gravement l’activité de HSD11B2. La chaîne latérale du résidu L179 est normalement positionnée spatialement dans un court virage entre le feuillet β4 et l’hélice α4 (figure 3C). En permettant des interactions avec les chaînes latérales hydrophobes de V174 et L282, ces interactions rendent le site de liaison des coenzymes plus flexible. La mutation en Arg introduit une chaîne latérale de guanidinium, qui permet des interactions avec la chaîne latérale du groupe carboxyle de E172 et la chaîne latérale du groupe hydroxyle de T184 (Fig. 3C), introduisant ainsi de la rigidité dans la spire et diminuant la flexibilité requise pour une fonction optimale de l’enzyme (7). Situé dans la poche de liaison du coenzyme, Y232 est un résidu hautement conservé dans le motif du pli de Rossmann (20), ce qui suggère que sa mutation sera préjudiciable à l’activité enzymatique (21). La chaîne latérale hydroxyl-phényle de Y232 forme des liaisons hydrogène importantes avec N171 et NAD+, maintenant le coenzyme dans la position correcte pour sa fonction catalytique (Fig. 3D). Cette interaction est perturbée dans la mutation Y232C qui provoque une EMA sévère. L’importance de ce résidu dans l’activité de l’enzyme a été confirmée indépendamment par plusieurs mutations modifiées (21) (Fig. 3D). Dans la mutation G89D, la chaîne latérale carboxyle de l’Asp présente des conflits stériques graves avec la partie sucre ribose de l’adénosine, ce qui affecte la liaison du NAD+ (Fig. 3E). Une autre mutation modifiée K236R entraîne la perturbation de la liaison au NAD (Fig. 3F). Tout en conservant la capacité d’interagir avec le NAD+ par liaison hydrogène, cette mutation abolit l’activité enzymatique (21).

Les altérations de la stabilité structurelle de HSD11B2 perturbent sa structure tertiaire, provoquant une atténuation marquée de l’activité enzymatique et une EMA sévère. Le résidu L250 est positionné dans l’hélice α5, et ses chaînes latérales se situent dans une poche hydrophobe serrée entourée par les chaînes latérales de L204, F246, W253, V255, et V257 (Fig. 4A). Les résidus de la poche hydrophobe sont verrouillés par une interaction par paire d’ions entre R208 et E249. L’introduction d’une chaîne latérale Pro casse l’hélice α5 en introduisant de la rigidité. Cette poche est également trop étroite pour accueillir la grande et volumineuse chaîne latérale guanidinium de l’Arg (figure 4A). Une perte subséquente d’hydrophobie dans cette région affecte la stabilité structurelle. Une autre interaction stable intra-hélicoïdale par paire d’ions est formée entre D144 et R147 (Fig. 4B). Cette interaction permet à l’hélice α3 de s’entasser étroitement avec les feuillets β adjacents près du site de liaison du NAD+. La mutation D144V entraîne la perte de cette interaction et déstabilise l’arrangement de l’emballage (Fig. 4B). L’emballage hydrophobe est également perturbé dans la mutation F185S, lorsque la chaîne latérale aromatique de la phénylalanine, entourée des résidus hydrophobes de V182, C188 et M189, est remplacée par une chaîne latérale polaire de la sérine (Fig. 4C). De même, la chaîne latérale hydrophobe de L363, entourée de M347, I350 et F362, est positionnée en hélice-tournante (Fig. 4D). La mutation L363P perturbe l’hélice et l’environnement structural local.

De plus, plusieurs mutations peuvent perturber l’emballage de la protéine HSD11B2 pour altérer la stabilité par l’introduction d’un résidu plus volumineux. Le résidu A328 forme une interaction hydrophobe avec V215, I260, I325, et Y338 (Fig. 4E). En remplaçant l’alanine par un résidu Val plus volumineux, la mutation A328V provoque des collisions stériques avec la chaîne latérale de I260 et Y338 des feuillets β environnants (Fig. 4E). Le résidu S180 est positionné sur une boucle et sa chaîne latérale de groupe hydroxyle interagit avec la chaîne latérale et l’azote du squelette de T184 (Fig. 4F). Cette chaîne latérale se trouve dans un espace très restreint et limite l’accommodation de tout résidu plus volumineux, ce qui provoque des heurts stériques, en fait, sans altérer la structure de la protéine. Ainsi, une chaîne latérale Phe avec un noyau aromatique volumineux, comme dans la mutation S180F, n’est pas tolérée à cette position (Fig. 4F).

De multiples liaisons hydrogène et ponts salins entre les résidus polaires stabilisent la structure tertiaire de l’enzyme HSD11B2. Certaines mutations provoquent une perte de ces interactions, ce qui entraîne une enzyme inactive et un EAM sévère. Par exemple, le pont salin entre R208 et E249 est critique (Fig. 4G). Sa perte, comme dans le cas des mutations R208C et R208H, déstabilise la protéine et entraîne une maladie grave (Fig. 4G). De même, D223 forme un pont salin avec R337 (Fig. 4H). En remplaçant ce pont salin par une liaison moins forte, une liaison hydrogène, la mutation D223N transforme le résidu chargé négativement en un résidu polaire non chargé, ce qui entraîne une atténuation marquée de l’activité in vitro (22). Cela suggère également que le pont salin joue un rôle crucial dans le maintien de la stabilité et de l’activité de HSD11B2. Les chaînes latérales de R213 forment des liaisons hydrogène avec les atomes du squelette des résidus A331 et L329 (Fig. 4I). En diminuant ces liaisons hydrogène, qui aident à maintenir la structure tertiaire de la protéine, la mutation R213C altère la stabilité de l’enzyme (Fig. 4I).

Le cluster Arg/Tyr des résidus 335-339 a été précédemment impliqué dans le maintien de la stabilité de la protéine, bien que le mécanisme précis soit resté obscur (23). Des mutations impliquant ces résidus ont été rapportées chez des patients atteints d’AME, notamment R337C et Y338H. Les simulations des modèles monomères et dimères de HSD11B2 suggèrent que le résidu R337 forme une interaction de type pont salin avec D223 et des liaisons hydrogène avec le groupe OH de Y339 (Fig. 4J). Leurs interactions semblent être importantes pour maintenir le repliement correct et la stabilité de la protéine. Ainsi, sa mutation en Cys abolit à la fois le pont salin et la liaison hydrogène pour déstabiliser l’enzyme et provoquer une EMA sévère. Les mutations de ce résidu par génie génétique montrent en outre que R337K, qui maintient la polarité et la charge positive, réduit l’activité de l’enzyme de 70 %, tandis que R337A, qui est similaire à R337C en ayant des chaînes latérales non chargées et courtes, inactive complètement HSD11B2 (23) (Fig. 4J). Dans le même groupe Arg/Tyr, la mutation de Y338 en His inactive l’enzyme et provoque un EAM sévère. Notre modèle suggère que ce résidu Tyr forme des interactions hydrophobes avec A328 et des liaisons hydrogène avec D327 (Fig. 4K). Ces deux interactions contribuent à maintenir la stabilité de la protéine, de sorte que la substitution de Tyr par His, par exemple, inactive HSD11B2. Cela est dû au fait que, bien que Y338H conserve la capacité de liaison hydrogène, il possède des chaînes latérales plus courtes qui déstabilisent l’enzyme. De même, la substitution de Tyr par Phe dans une construction Y338F n’est pas tolérée. Ici, les interactions hydrophobes sont conservées mais la liaison hydrogène est abolie (23). Enfin, R337 et Y338 dans le cluster Arg/Tyr sont également très conservés à travers de nombreuses espèces ; ainsi, toute modification de ces résidus est peu susceptible d’être tolérée (23).

Plusieurs mutations sont rapportées pour provoquer une forme plus légère de l’AME avec des manifestations cliniques et biochimiques moins sévères. Les constructions mutées pertinentes se sont avérées avoir maintenu l’activité HSD11B2 in vitro (4, 19, 24), ce qui est cohérent avec le phénotype clinique moins sévère. D’un point de vue structurel, ces mutations peuvent soit perturber indirectement la fixation du substrat (comme la mutation P227L chez l’un de nos patients), soit modifier la structure de la protéine (comme les mutations R279C et R359W) pour atténuer, mais pas abolir, l’activité enzymatique (Fig. 5). Notamment, alors que le résidu P227 ne se trouve pas dans une position qui interagit directement avec le substrat, son positionnement adjacent au résidu Y226 suggère qu’il pourrait avoir un rôle dans la liaison du substrat (Fig. 5A). En fait, ce résidu forme le  » coude  » dans la région de la boucle, ce qui maintient la conformation du site actif et maintient également Y226 dans la bonne position pour interagir de manière optimale avec le substrat. La mutation de ce résidu en Leu (P227L) perturbe le kink et modifie le positionnement de Y226 (Fig. 5A).

Deux mutations non conservatrices censées perturber la structure tertiaire de HSD11B2 ont été identifiées chez des patients atteints d’AME de type 2. R279 forme une liaison hydrogène avec le squelette de N171, ce qui contribue à maintenir et à stabiliser l’environnement local de la protéine (Fig. 5B). Le remplacement de R279 par un résidu qui ne forme pas de liaison hydrogène, comme dans la mutation R279C, entraîne une légère atténuation, mais pas une élimination totale de l’activité HSD11B2 (24), ce qui correspond à un phénotype clinique léger (Fig. 5B). Une autre mutation non conservatrice, R359W, modifie les propriétés de la chaîne latérale de chargée à hydrophobe. Cela modifie l’interaction locale dans la structure de la protéine, dans laquelle la chaîne latérale chargée positivement de R359 forme une liaison hydrogène avec l’oxygène carbonyle du squelette de I350 (Fig. 5C). La perte de cette interaction contribue à l’amélioration de la flexibilité structurelle, entraînant une atténuation de l’activité enzymatique. Il faut noter que les deux R279C et R359W provoquent une perturbation minimale des interactions intramoléculaires et se produisent près de la surface de la protéine.