Abstract
Les disaccharidases (DS) sont des enzymes de la bordure en brosse enchâssées dans la membrane microvillositaire des entérocytes de l’intestin grêle. Dans la maladie cœliaque (MC) non traitée, on observe une diminution générale des activités des DS. Ce manuscrit passe en revue différents aspects des activités des DS dans la MC : leur utilité dans le diagnostic et leur application aux tests de toxicité in vitro. Cette dernière n’a jamais été établie dans la recherche sur la MC. Cependant, grâce aux progrès récents des techniques d’organoïdes de l’intestin grêle, la DS pourrait être utilisée comme biomarqueur pour les études in vitro. Cela inclut l’établissement de cellules épithéliales auto-renouvelables issues de tissus, qui expriment des marqueurs de différenciation, y compris les enzymes de la bordure en brosse. La détermination des activités de la DS duodénale peut fournir des informations supplémentaires lors du bilan diagnostique de la MC : (i) quantifier la gravité des lésions histologiques observées, (ii) fournir des valeurs prédictives pour le grade de l’atrophie villositaire de la muqueuse, et (iii) aider à diagnostiquer la MC lorsque des changements histologiques mineurs sont observés. Les DS peuvent également fournir des informations supplémentaires pour évaluer la réponse à un régime sans gluten, car une augmentation marquée de leurs activités se produit quatre semaines après le début du régime. Divers facteurs endogènes et exogènes affectant le DS pourraient également être pertinents lorsqu’on envisage d’étudier le rôle du DS dans d’autres conditions, notamment la sensibilité au gluten non cœliaque et les carences en DS.
1. Introduction
Chez certains individus, les symptômes gastro-intestinaux, y compris la diarrhée, sont liés à l’ingestion de certaines formes de glucides alimentaires. Les symptômes sont attribuables à une ou plusieurs déficiences enzymatiques de la muqueuse de l’intestin grêle qui hydrolysent les disaccharides . Il s’agit notamment du déficit en lactase (congénital et chez l’adulte), du déficit en sucrase-isomaltase, du déficit en maltase-glucoamylase et du déficit en tréhalase. À l’exception du déficit en lactase chez l’adulte, les autres déficiences énumérées ci-dessus sont relativement rares. D’autres affections, dont la maladie cœliaque (MC), qui entraînent des lésions de l’intestin grêle peuvent provoquer une réduction des activités de la disaccharidase (DS). Il a également été suggéré que les déficiences secondaires en DS peuvent éventuellement expliquer les symptômes chez les patients atteints de la MC qui ont des villosités intactes .
Le lactose qui est digéré par l’enzyme lactase de la bordure en brosse est l’un des glucides à chaîne courte mal absorbés, souvent appelés FODMAPs (fermentable, oligo-, di-, monosaccharides et polyols). Il a été démontré que la réduction de l’apport en FODMAPs améliore les symptômes gastro-intestinaux chez les patients souffrant de sensibilité au gluten non cœliaque (NCGS). Il a été démontré que des composants autres que le gluten du blé pouvaient jouer un rôle important dans la NCGS, notamment l’inhibiteur de l’amylase-trypsine. L’absence de biomarqueurs pour cette affection pourrait inciter les chercheurs à étudier le rôle potentiel des enzymes de la bordure en brosse, comme la lactase.
Dans la MC non traitée, on observe une diminution générale des activités de la DS . Avant l’avènement des tests sérologiques, les activités des DS de l’intestin grêle étaient des paramètres de laboratoire importants pour aider au diagnostic de la MC. La détermination de l’activité des DS individuels a également été cruciale pour le diagnostic différentiel des troubles métaboliques innés. La mesure de leur activité permet de distinguer les déficiences primaires et secondaires en DS. Les types primaires de déficiences en DS constituent des « erreurs innées du métabolisme » d’une enzyme spécifique. Un exemple en est le déficit congénital en lactase, dans lequel les niveaux de maltase et de sucrase sont normaux, mais la lactase est réduite. La MC est une déficience secondaire en DS, car toutes les DS sont réduites en raison des lésions de la muqueuse de l’intestin grêle provoquées par le gluten.
Une augmentation marquée des activités des DS se produit quatre semaines après le début d’un régime sans gluten (RSG), mais leurs activités sont à nouveau réduites si les patients cœliaques reviennent à un régime normal . Chez les patients atteints de la maladie coeliaque, l’instillation intraduodénale de gluten produit des changements histologiques caractéristiques et une réduction marquée des activités de la disaccharidase dans les 3,5 heures. La réduction des activités DS est en corrélation avec le grade histologique de la biopsie, de sorte que le DS pourrait être employé comme biomarqueur de la MC.
Ce manuscrit passe en revue différents aspects des activités DS dans la MC : leur utilité dans le diagnostic et leur application aux tests de toxicité in vitro. En outre, nous décrivons les progrès récents des techniques d’organoïdes de l’intestin grêle, y compris la coculture avec des cellules immunitaires, qui offrent une opportunité intéressante de développer des modèles in vitro de pointe pour la recherche sur la MC. Dans ce modèle, les enzymes de la bordure en brosse pourraient être employées comme marqueurs de la pathogenèse de la MC.
2. Aspects diagnostiques des activités de la disaccharidase du petit intestin dans la MC
L’étalon-or pour le diagnostic de la MC et le suivi de l’effet du DGO est l’examen des biopsies duodénales en conjonction avec la sérologie de la MC, y compris la transglutaminase tissulaire. La mesure des activités de la DS fournit des informations supplémentaires au moment du diagnostic et pendant le suivi pour évaluer la réponse à un RSG. En outre, il a été démontré que la détermination des activités DS pourrait faciliter le diagnostic de la MC lorsque des changements histologiques plus légers sont observés, y compris des anomalies Marsh I et II dans les biopsies de l’intestin grêle .
2.1. Valeurs prédictives positives et négatives de l’atrophie villositaire muqueuse
La mesure des activités enzymatiques de la bordure en brosse offre un outil objectif supplémentaire pour évaluer la gravité des anomalies histologiques chez les patients cœliaques non traités . Les activités DS duodénales sont de bons prédicteurs du grade de l’atrophie villositaire muqueuse dans la MC. Les valeurs prédictives positives pour une atrophie villositaire modérée ou sévère sont les suivantes :(i)90% pour la maltase (maltase U/g de protéine)(ii)86% pour la sucrase (<40 U/g de protéine)(iii)71% pour la lactase (<20 U/g de protéine).
La diminution des activités de la maltase et de la sucrase a donc une valeur prédictive positive élevée pour le degré d’atrophie villositaire muqueuse. Les valeurs prédictives de l’activité lactasique sont plus faibles, probablement en raison de la présence d’un déficit primaire en lactase chez les patients cœliaques. Aucun patient dont l’activité de la DS se situait dans la fourchette normale n’a présenté d’atrophie villositaire grave .
2.2. Guérison muqueuse dans la MC avec un régime sans gluten (RSG)
Il est bien établi que les activités enzymatiques de la bordure en brosse sont réduites chez les patients cœliaques non traités. Cependant, les activités se rétablissent pendant la rémission, notamment quatre semaines après le début d’un RSG . Il est important de noter les différentes réponses entre la DS et un RSG ; une augmentation marquée des activités alpha-glucosidases se produit, tandis que l’activité lactase reste faible chez de nombreux patients. Peña et al. ont démontré que la réponse de la lactase à un RSG est variable, montrant parfois une récupération complète en quelques mois, mais restant parfois déprimée pendant des années. L’âge du patient est d’une grande importance dans le taux de récupération de l’activité de la lactase. Les patients âgés de moins de 30 ans présentent généralement une récupération complète en quelques mois, alors que la plupart des patients plus âgés ne présentent que peu ou pas de récupération dans ce laps de temps. La persistance de faibles activités de lactase malgré une bonne amélioration histologique a été démontrée dans d’autres études pour certains patients, en particulier les adultes.
À l’exception de la lactase, la mesure des DS peut fournir un indice quantitatif de l’amélioration de la muqueuse de l’intestin grêle ; leur augmentation est bien corrélée avec la récupération de la muqueuse basée sur l’histologie de la biopsie de l’intestin grêle . En plus du suivi histologique et sérologique, la mesure de l’activité des DS offre un outil potentiel supplémentaire pour évaluer le traitement de la MC par un RSG. L’activité de la sucrase est le meilleur indicateur de la réponse de la muqueuse à un RSG. Cependant, il est intéressant de noter que même après deux ans de traitement de la MC par un RSG, l’activité de la sucrase dans le duodénum distal n’augmente pas jusqu’au niveau des témoins, bien que des effets cliniques soient observés plus tôt . En général, les activités enzymatiques dans la muqueuse de l’intestin grêle des patients atteints de la MC en rémission sont inférieures à celles des groupes témoins appariés pour l’âge, le sexe et le site de la biopsie. Cependant, les patients cœliaques qui suivent un régime alimentaire complet présentent des niveaux significativement plus élevés de maltase et de sucrase, mais une augmentation limitée de l’activité de la lactase par rapport à un groupe non traité. Il est utile de mentionner qu’un RSG strict est le traitement de choix non seulement pour la MC, mais aussi pour les déficiences secondaires de la DS associées à la MC.
2.3. Diagnostic de la MC avec un score Marsh I/II des biopsies de la muqueuse de l’intestin grêle (MC subclinique)
Dans les biopsies de la muqueuse de l’intestin grêle avec un score Marsh I et/ou II, il n’y a pas d’atrophie villositaire . L’atrophie villositaire ne comprend que le stade final de l’évolution clinique de la maladie ; la MC se développe progressivement de l’inflammation de la muqueuse de l’intestin grêle à l’hyperplasie de la crypte et enfin à l’atrophie villositaire .
Les changements biopsiques plus légers qui sont limités à une infiltration lymphocytaire avec ou sans hyperplasie de la crypte peuvent nécessiter des données supplémentaires afin d’augmenter la certitude d’un diagnostic de MC, car ces changements histologiques ne sont pas exclusifs à la MC . Le diagnostic de la MC peut être amélioré par le génotypage (HLA-DQ2 ou HLA-DQ8) ; les marqueurs sérologiques et la coloration immunohistochimique des lymphocytes intraépithéliaux γδ+ve trouvés chez les patients atteints de la MC peuvent également être utilisés pour confirmer le diagnostic .
Les dommages aux microvillosités peuvent être l’une des premières altérations induites par le gluten dans la MC . Par conséquent, les changements biochimiques peuvent précéder les anomalies histologiques de la biopsie duodénale observées par microscopie optique . Murray et al. ont rapporté avoir diagnostiqué la MC lors d’une nouvelle biopsie chez 4 des 37 patients (10,8 %) qui n’avaient pas d’atrophie villositaire lors de leur biopsie initiale quelques années auparavant. Cependant, ces quatre patients présentaient des activités de DS réduites et des changements histologiques mineurs (Marsh I ou II) dans leur biopsie initiale. Les activités réduites de DS sans atrophie villositaire peuvent donc représenter une MC précoce.
Mones et al. ont observé une réduction marquée des activités de DS chez les patients pédiatriques atteints de MC dont les changements histologiques dans leurs biopsies de l’intestin grêle étaient classés comme Marsh I ou II (avec des villosités intactes). Un test positif pour prédire la MC a été défini par les valeurs seuils suivantes pour l’activité individuelle des DS : lactase, ≤15 unités/g de protéines ; sucrase, ≤25 unités/g de protéines ; maltase, ≤100 unités/g de protéines ; et palatinase, ≤5 unités/g de protéines. La sensibilité diagnostique variait de 74 % à 85 %, la sensibilité la plus élevée étant observée pour la lactase. La spécificité diagnostique variait de 57 % à 91 %, la spécificité la plus élevée étant observée pour la sucrase. La valeur prédictive positive d’un déficit en DS pour prédire la MC variait de 70 % à 91 %. Les valeurs prédictives négatives (un niveau normal de DS) variaient de 72 % à 76 % pour prédire une biopsie non considérée comme une MC. Le déficit en DS constaté dans les biopsies duodénales peut donc faciliter le diagnostic de la MC dans les biopsies avec des villosités intactes. Une constatation similaire a été rapportée dans une autre étude où l’évaluation des activités de la DS a fourni des preuves pour soutenir le diagnostic de la MC chez certains patients .
3. Aspects de la recherche des activités de la disaccharidase dans la maladie cœliaque
Les activités de la DS dans les biopsies de la muqueuse de l’intestin grêle peuvent être déterminées par la méthode de Dahlqvist. Le tissu est incubé avec le disaccharide pertinent et le glucose libéré est déterminé par un dosage colorimétrique utilisant le réactif TRIS-glucose oxydase. Les unités d’activité DS sont exprimées en micromoles de disaccharide hydrolysé par minute et par gramme de muqueuse (poids humide) .
3.1. Facteurs affectant les activités enzymatiques
Les DS sont réduites dans la maladie cœliaque active. Elles peuvent être réduites dans d’autres conditions, notamment les maladies inflammatoires de l’intestin, les allergies alimentaires, la dyspepsie, la malabsorption protéino-énergétique, les immunodéficiences et les maladies infectieuses (telles que la giardiase, les infections virales et la prolifération bactérienne de l’intestin grêle) . La diminution des activités de DS peut généralement être inversée par un traitement réussi de la maladie sous-jacente. Il est intéressant de noter que la DS peut également augmenter de façon anormale chez les patients diabétiques. Une réduction des déficiences individuelles de DS est observée dans les déficiences primaires de DS qui comprennent l’intolérance congénitale au lactose, la déficience en sucrase-isomaltase, la déficience en maltase-glucoamylase et la déficience en tréhalase .
Chez les individus sains, les activités de DS peuvent présenter une large gamme de valeurs absolues . Il existe plusieurs facteurs endogènes et exogènes qui affectent leurs activités.
3.1.1. Facteurs endogènes
Les activités des SD varient le long de l’axe longitudinal (duodénum-jéjunum-ileum) de l’intestin . La lactase a des activités maximales à 50-200 cm du ligament de Treitz et est presque absente dans l’iléon distal. Les activités de la Sucrase sont constantes le long de l’intestin grêle. La maltase est deux fois plus abondante dans l’iléon distal par rapport à celle du jéjunum proximal .
L’ethnicité affecte les valeurs de DS comme cela a été démontré en comparant des enfants africains et finlandais avec une architecture villositaire normale ; les premiers avaient des activités de lactase, sucrase et maltase duodénales plus faibles. Environ un tiers des enfants finlandais présentent une activité lactase inférieure à la plage de référence établie de 20 U/g de protéines, contre deux tiers des enfants africains.
Le sexe n’affecte aucune des activités du DS . L’âge a un effet significatif sur l’activité de la lactase uniquement ; elle diminue avec l’âge. Chez certains enfants noirs, la déficience en lactase peut se développer après l’âge de 3 ans et n’est pas associée à une maladie des muqueuses .
Le rythme circadien influence les activités du DS . En outre, les oscillations des activités du DS sont en corrélation avec le rythme de la prise alimentaire .
Les changements muqueux parcellaires qui peuvent se produire dans la MC affectent les valeurs absolues des activités du DS trouvées dans les biopsies. Jonsson et al. ont démontré qu’il y avait un coefficient de variation d’environ 30 % dans l’activité DS des échantillons prélevés sur deux sites du duodénum.
3.1.2. Facteurs exogènes
L’alimentation en saccharose est connue pour augmenter l’activité de la sucrase-isomaltase. Cette augmentation est le résultat d’une synthèse de novo de l’enzyme qui atteint son pic (multiplication par 2,6) 12 heures après le début d’un régime contenant du saccharose . La dégradation de l’enzyme est indépendante du régime alimentaire .
Le jeûne entrave le renouvellement des cellules épithéliales intestinales. Il entraîne une réduction de la masse de l’intestin grêle, de la taille des villosités et de l’indice mitotique des entérocytes de la crypte. La privation de glucides induit une chute de la sucrase intestinale qui est restaurée par l’alimentation glucidique .
Les niveaux de DS varient également en fonction du site de la biopsie . Ceci s’applique non seulement à l’axe longitudinal (duodénum-jéjunum-iléon) dans l’intestin grêle mais aussi à l’axe crypto-villaire. Comme les DS sont incorporés dans les microvillosités des entérocytes villositaires, leur activité dépend du nombre d’entérocytes villositaires présents dans la biopsie , de sorte que les biopsies plus superficielles ayant un contenu épithélial plus élevé pourraient avoir un contenu en DS plus élevé.
3.2. Méthodes ex vivo et in vitro pour étudier la toxicité du gluten dans la maladie cœliaque
Il n’existe pas de modèle animal reproduisant toutes les caractéristiques de la maladie cœliaque . Les tests in vivo constituent l’étalon-or pour évaluer la toxicité coeliaque . Cependant, il est bien établi que l’administration in vivo de gluten peut provoquer des lésions systémiques chez le patient. Par conséquent, les méthodes in vitro sont généralement utilisées avant les études in vivo pour évaluer l’absence de toxicité de la maladie cœliaque dans les aliments.
La méthode in vitro la plus fiable est la culture de biopsie de la muqueuse de l’intestin grêle, souvent appelée culture d’organe (CO) de biopsie duodénale. Cette méthode a été décrite à l’origine par Browning et Trier. Les études précliniques in vitro étant très demandées, le principe de la méthode de Browning et Trier a été développé et appliqué à l’essai des probiotiques qui nécessite une stimulation apicale des explants de muqueuse intestinale. L’OC permet diverses autres applications, par exemple, des études biochimiques de la synthèse et du traitement de la DS , l’assemblage dimérique de la DS , et l’étude des effets de l’insuline sur les activités élevées de la DS chez les sujets diabétiques .
La méthode originale de Browning et Trier a été modifiée de sorte que le système détecte les effets nocifs du gluten en l’ajoutant au milieu de culture et en évaluant les anomalies histologiques, morphologiques et immunologiques ultérieures. La technique modifiée de Browning et Trier est encore largement utilisée dans les études sur la pathogenèse de la maladie cœliaque et dans les tests de toxicité cœliaque. Le système OC s’est également révélé utile pour aider au diagnostic de la MC, principalement dans les cas sans atrophie villositaire ou chez les patients séronégatifs .
3.2.1. Premiers travaux sur la culture d’organes de l’intestin grêle et l’étude des enzymes de la bordure en brosse dans la MC
L’atteinte des entérocytes est la marque de la maladie cœliaque . L’effet toxique du gluten sur la muqueuse de l’intestin grêle a été démontré biochimiquement en mesurant l’activité de l’enzyme de la bordure en brosse, la phosphatase alcaline (PA), dans les OC. L’activité de l’AP obtenue à partir de biopsies de patients CD non traités a augmenté lorsque le tissu a été incubé dans un milieu sans gluten. Cette augmentation a été inhibée par la présence de peptides de gluten dans le milieu de culture, ce qui démontre les effets toxiques du gluten.
Katz et Falchuk ont par la suite proposé l’utilisation de la technique d’OC de l’intestin grêle comme test prédictif pour le diagnostic définitif de la sensibilité au gluten. Vingt-deux des 26 patients ayant reçu un diagnostic de MC avaient montré une sensibilité au gluten in vitro sur leurs biopsies initiales. Une augmentation de l’activité AP du tissu intestinal de ces 22 patients a été inhibée par la présence de peptides de gluten dans le milieu. Le taux de faux négatifs pour établir le diagnostic de la MC était donc de 15% (4 sur 26). Dans leur étude, 14 patients présentant une muqueuse anormale n’étaient pas atteints de la MC. Treize d’entre eux n’ont pas présenté de sensibilité au gluten in vitro (taux de faux positifs de 7 %). Tous les patients dont les biopsies étaient normales ont été classés correctement. Ces résultats passionnants suggèrent que la culture d’organes de l’intestin grêle pourrait être utilisée pour le diagnostic prospectif de la MC. Dans une autre étude, Falchuk et al. ont à nouveau démontré la sensibilité au gluten in vitro chez les patients atteints de la MC active. Ils ont en outre suggéré qu’il existait des différences en fonction du type d’histocompatibilité des sujets.
D’autres chercheurs ont entrepris des études OC similaires, mesurant l’activité AP et une autre enzyme de la bordure en brosse, l’α-glucosidase. Howdle et al. et Hauri et al. n’ont pas pu reproduire les effets in vitro du gluten sur les biopsies duodénales de patients atteints de MC non traités, ni par l’évaluation de l’activité de l’AP ou de l’α-glucosidase.
Mitchell et al. ont montré qu’il y a une perte progressive de protéines du tissu pendant l’OC. Dans le même temps, les niveaux d’enzymes de la bordure en brosse diminuent et s’accumulent dans le milieu. Ils ont donc suggéré d’exprimer les activités enzymatiques en mU/ml de milieu de culture, par opposition à U/g de protéines, en raison des pertes de protéines pendant la culture de l’organe et des activités enzymatiques récupérées dans le milieu .
Plusieurs auteurs ont étudié les protéines, le contenu en ADN et les enzymes de la bordure en brosse dans les biopsies d’OC de l’intestin grêle. La plupart ont observé une diminution de tous ces paramètres dans les biopsies cultivées, à l’exception de l’activité AP qui a augmenté dans pratiquement tous les cas . Les DS sont probablement plus facilement perdus dans le milieu pendant la culture que les AP .
3.2.2. Modèles cellulaires et activités enzymatiques
En plus de la CO de la muqueuse de l’intestin grêle des patients atteints de la MC, les chercheurs ont utilisé différentes lignées cellulaires pour des études in vitro de la MC. Les modèles cellulaires établis sont basés sur des lignées de cellules T sensibles au gluten et des clones isolés de personnes atteintes de la MC, qui sont encore largement utilisés dans le dépistage de la toxicité de la MC . D’importantes recherches ont également été menées sur des lignées de cellules épithéliales d’origine cancéreuse, relativement faciles à cultiver. Cependant, on n’a pas établi dans quelle mesure la transformation maligne affecte leur dépendance éventuelle aux influences du microenvironnement environnant. Il a été démontré que, contrairement aux cellules épithéliales normales, les lignées cellulaires du cancer du côlon ne nécessitent pas l’ajout de facteurs de croissance pour leur expansion in vitro. En outre, les cellules Caco2 expriment des quantités considérablement plus faibles d’enzymes de la bordure en brosse par rapport aux entérocytes normaux.
Avant que Sato et al. ne publient leur découverte révolutionnaire sur les organoïdes intestinaux, les entérocytes étaient notoirement difficiles à cultiver in vitro. Au cours des décennies, de nombreuses études sur l’épithélium intestinal normal ont fait état de difficultés à maintenir la culture de ces cellules pendant plus de quelques jours ( et les références y afférentes) malgré l’emploi de différents protocoles d’isolement et de conditions de culture ultérieures. Pendant de nombreuses années, on a pensé qu’il était impossible d’établir des cultures à long terme à partir de tissus humains primaires, à moins de transformer génétiquement les cellules. On a également découvert que la perturbation des interactions entre les cellules épithéliales normales et la matrice extracellulaire environnante induit l’apoptose des cellules.
Quaroni et al. ont toutefois réussi à établir une culture à long terme de cellules épithéliales de l’intestin grêle de rat. Leur approche initiale pour l’isolement était celle utilisée dans l’OC, mais les cellules épithéliales cultivées avaient les caractéristiques des cellules indifférenciées de la crypte de l’intestin grêle. Des niveaux de différenciation médiocres des entérocytes cultivés in vitro ont été signalés dans d’autres études utilisant des biopsies intestinales humaines, de souris, de rat et de bovin, ce qui correspond à nos observations (données non publiées). Rusu et al. ont étudié la différenciation in vitro en évaluant les activités spécifiques de la maltase et de l’AP dans des échantillons bovins (a) d’épithéliums fraîchement raclés, (b) de suspensions organoïdes utilisées pour ensemencer les cultures (à ne pas confondre avec les organoïdes de Sato), et (c) de cultures de cellules intestinales qui comprennent des cellules cultivées primaires et des cellules cultivées après le premier et le deuxième passage. Les suspensions organoïdes présentaient une réduction de 50 % par rapport à la préparation d’épithélium frais. L’activité de la maltase, utilisée comme marqueur de différenciation, a clairement diminué dans les cultures primaires et avec les passages ultérieurs de la culture vers un niveau bas stable. Des résultats similaires ont été obtenus à partir des mesures de l’activité AP intestinale. Ces résultats reflètent une perte de différenciation cellulaire in vitro .
L’épithélium n’est qu’un (i) des quatre composants d’une unité fonctionnelle intégrée qui comprend également (ii) une matrice extracellulaire, (iii) des cellules dérivées du mésenchyme et (iv) des facteurs luminaux. L’isolement des entérocytes de leur environnement mésenchymateux entraîne une perte de différenciation . Les cellules intestinales grêles fœtales humaines non transformées cultivées sur du plastique présentent des caractéristiques d’entérocytes cryptés indifférenciés. L’ajout séquentiel de molécules du tissu conjonctif et de molécules luminales à des entérocytes fœtaux humains non malins in vitro a induit un spectre de changements dans le type de cellule épithéliale vers une différenciation complète. Une lignée de cellules de l’intestin grêle de rat s’est également différenciée, comme en témoigne une augmentation significative de l’activité de la sucrase, lorsqu’elle a été cultivée en présence de mésenchyme. Le développement normal et la différenciation de l’épithélium de l’intestin grêle dépendent donc de l’interaction avec le mésenchyme et d’autres constituants .
Les cultures à long terme de cellules épithéliales humaines primaires normales isolées de l’intestin grêle sont maintenant bien établies. Des « mini-intestins » épithéliaux humains peuvent être cultivés à partir de cryptes intestinales et de cellules souches uniques . Il est possible de propager in vitro les cultures organoïdes dérivées de l’intestin humain et de la souris. Ces organoïdes peuvent être cultivés indéfiniment et présentent toutes les caractéristiques de l’épithélium de l’intestin grêle en termes d’architecture, de types de cellules et de caractéristiques d’auto-renouvellement .
Sato et al. ont défini les conditions qui favorisent la prolifération et la différenciation des organoïdes. Les cellules souches ainsi que les organoïdes devaient être noyés dans du Matrigel qui est une matrice riche en laminine et en collagène qui imite la lame basale. La culture de l’intestin grêle humain est plus complexe que celle de l’intestin de souris. Outre la R-spondine, la Noggin et le facteur de croissance épidermique, les conditions de culture optimisées pour l’homme nécessitent davantage de suppléments (Wnt3A, gastrine, nicotinamide, inhibiteur d’Alk et inhibiteur de p38). La différenciation des organoïdes épithéliaux humains de petite taille cultivés en différents types de cellules de l’intestin nécessite le retrait de certains suppléments (Wnt3, nicotinamide et inhibiteur de p38). Un marqueur de différenciation pour les entérocytes matures a été visualisé par la coloration AP de la bordure en brosse . Dans une autre étude, Middendorp et al. ont également omis certains suppléments de culture pour obtenir la différenciation de l’intestin grêle d’organoïdes humains. Il est intéressant de noter que la visualisation des entérocytes matures par coloration à la sucrase-isomaltase a bien fonctionné pour les organoïdes iléaux mais pas pour les duodénaux. L’expression de la lactase a été induite dans les organoïdes iléaux et duodénaux par le milieu dit de différenciation .
3.2.3. Progrès récents dans les méthodes d’organoïdes intestinaux
La technologie des organoïdes pourrait avoir des applications dans la thérapie régénérative de certaines maladies intestinales par expansion ex vivo des épithéliums intestinaux et transplantation . Cette méthodologie permet également la propagation in vitro de tissus gastro-intestinaux malades, ce qui pourrait permettre d’élucider la pathogenèse de la maladie et le développement de thérapies. Les organoïdes intestinaux ont déjà été utilisés pour modéliser des maladies monogéniques qui affectent l’épithélium, les maladies inflammatoires de l’intestin (en examinant la mort cellulaire, l’intégrité de la muqueuse et les effets des cytokines inflammatoires), et les interactions entre les tissus intestinaux et les microbes ainsi que le cancer ( et les références qui y figurent). La recherche sur la MC est à la traîne par rapport à ces avancées. Il est bien établi que de nombreux types de cellules sont impliqués dans la pathogenèse de la MC et, à ce titre, les organoïdes sont dépourvus de nombreux types de cellules présents dans un système in vivo. Toutefois, la complexité peut être accrue par la coculture avec des cellules immunitaires. Nozaki et al. ont décrit la coculture d’organoïdes murins et de lymphocytes intraépithéliaux (IELs) dans laquelle les cellules αβT et γδT ont proliféré avec succès et étaient aussi mobiles que les IELs résidant dans des contextes in vivo. Des cocultures d’organoïdes ont également été décrites pour le système nerveux entérique et les myofibroblastes.
En raison des progrès des tests sérologiques et génétiques dans le bilan diagnostique de la maladie cœliaque, la biopsie duodénale pourrait ne plus être nécessaire pour de nombreux patients. Par conséquent, le matériel de biopsie va se raréfier. Cependant, il est également possible de générer des organoïdes intestinaux à partir de cellules souches embryonnaires ou de cellules souches pluripotentes induites ( et leurs références) qui, bien que leur mise en place prenne plus de temps et qu’ils soient techniquement plus exigeants et coûteux par rapport aux organoïdes dérivés de biopsies, peuvent considérablement augmenter le nombre d’organoïdes obtenus et permettre d’utiliser plutôt le matériel clinique pour élever les cellules immunitaires.
3.2.4. Pertinence du travail des organoïdes intestinaux et des enzymes de la bordure de la brosse pour le développement de méthodes in vitro de pointe pour la recherche sur la MC
Il est bien établi que les réponses immunitaires innées et adaptatives sont déclenchées dans la pathogenèse de la MC ; cependant, la séquence exacte de ces événements pathologiques n’a pas été élucidée à ce jour. La technologie des organoïdes permet toutefois l’ajout séquentiel des cellules dans la coculture, ce qui permet d’étudier la réponse immunitaire innée en reconstituant les organoïdes coeliaques et les IELs séparément des effets d’une réponse immunitaire adaptative. À leur tour, les cellules T spécifiques du gluten, qui peuvent également être cultivées in vitro, peuvent alors être incluses dans ce modèle in vitro de la MC afin de faciliter les effets toxiques complets du gluten sur l’épithélium intestinal.
La technologie des organoïdes permet également d’élucider le rôle des entérocytes dans le traitement des peptides de gliadine dans la MC. Les entérocytes ont la capacité de fonctionner comme des cellules présentatrices d’antigènes, la stimulation des cellules T étant médiée par leurs molécules HLA-DR . De plus, la gliadine contient des peptides qui peuvent déclencher une réponse immunitaire innée. Il est intéressant de noter que le peptide de gluten qui déclenche l’immunité innée dans la maladie cœliaque est traité différemment dans l’entérocyte par rapport à ceux qui déclenchent une réponse immunitaire adaptative, dans laquelle les peptides atteignent les endosomes tardifs HLA-DR positifs et sont présentés aux cellules T de la lamina propria . L’endommagement de la bordure en brosse des entérocytes étant l’une des premières altérations de la MC, la DS pourrait être utilisée pour étudier les effets toxiques du gluten dans la MC. Il est important de noter que les enzymes de la bordure en brosse font partie intégrante des entérocytes villositaires matures et sont quantitativement associées à leur différenciation. Cependant, l’activité des enzymes de la bordure en brosse peut ne pas être en corrélation avec la viabilité des entérocytes, car elle a été démontrée dans des cellules épithéliales non viables. Par conséquent, l’immunomarquage ou plus précisément l’absence d’immunomarquage pour les enzymes de la bordure en brosse en raison de la destruction des microvillosités plutôt que de leurs activités pourrait être utilisé comme un marqueur de la pathogenèse de la MC.
La technologie des organoïdes a un potentiel substantiel pour la modélisation de la maladie et donc l’élucidation de la séquence des événements pathogènes de la MC dans laquelle les enzymes de la bordure en brosse peuvent être utilisées. De nouveaux modèles in vitro basés sur les progrès récents de la recherche sur les cellules souches pourraient faciliter le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la MC.
4. Conclusions
La structure de la muqueuse de l’intestin grêle et les processus physiologiques impliqués sont très complexes. La MC augmente cette complexité, en affectant de nombreux composants de l’intestin, y compris le DS. Bien que les activités de DS aient joué un rôle important dans l’aide au diagnostic de la MC, l’application des activités de DS à la recherche in vitro sur la MC reste à établir. Les récentes avancées en matière de croissance ex vivo de « mini-gouttières » épithéliales constituent une nouvelle plateforme passionnante qui est devenue disponible. Elle permet des applications pour étudier l’épithélium normal ou malade avec l’ingénierie tissulaire. Les cellules épithéliales croissent et se différencient dans des conditions définies qui incluent la présence d’une matrice extracellulaire et de facteurs de croissance. Une population auto-renouvelée de cellules épithéliales exprime des enzymes de la bordure en brosse qui pourraient être employées dans les études in vitro de la MC lorsqu’il y a reconstitution d’autres cellules immunitaires dans le modèle.
Conflits d’intérêts
Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr H. Julia Ellis pour les discussions utiles et la révision du manuscrit. Tanja Šuligoj tient à remercier le Clinical Research Trust pour son soutien. Borut Božič tient à remercier le soutien financier partiel de la Fondation scientifique slovène, subvention n°. SZF-BBozic01/2007.