Activité élevée de la 1-α Hydroxylase dans les monocytes de patients atteints de tuberculose active

Abstract

Un patient urémique a développé une hypercalcémie après une infection tuberculeuse, et ses niveaux de calcium ionisé étaient corrélés aux niveaux de 1,25-dihydroxyvitamine D3 (1,25(OH)2D3). Nous avons réalisé d’autres études pour déterminer si les monocytes sont des sites alternatifs de conversion de la 1,25(OH)2D3 au-delà des cellules tubulaires rénales. En utilisant un test biologique ex vivo, nous avons constaté dans cette étude que l’activité de la 1-α hydroxylase (CYP27B1) dans les monocytes est significativement plus élevée chez les patients atteints de tuberculose active (TB) que chez ceux qui ont un contact fréquent avec la TB. Cependant, lorsque les monocytes des patients atteints de tuberculose active ont été restimulés avec un antigène dérivé de Mycobacterium tuberculosis, une quantité moindre de 1,25(OH)2D3 a été observée. En revanche, le niveau de 1,25(OH)2D3 était inchangé chez les personnes ayant des contacts fréquents avec la tuberculose. Nous concluons que les monocytes peuvent être une source alternative de 1-α hydroxylase qui pourrait convertir la 25-hydroxyvitamine D3 en 1,25(OH)2D3, plus active.

1. Introduction

La tuberculose sévit dans le monde depuis la préhistoire. Selon un rapport récent, un million de patients succombent chaque année à la tuberculose et aux comorbidités associées . Au cours des dernières décennies, des efforts considérables ont été déployés pour comprendre le processus physiopathologique de la maladie. Des modèles animaux et des études humaines ont ouvert la voie à la clarification des réponses immunitaires individuelles à Mycobacterium tuberculosis (MTB) . Ces études apportent la preuve que la vitamine D joue un rôle important dans la résistance humaine à la tuberculose. La vitamine D est utilisée pour combattre la tuberculose depuis plus de 200 ans. L’huile de foie de morue et le calciférol, sources importantes de vitamine D, sont utilisés depuis le XVIIe siècle pour traiter les patients atteints de tuberculose . Dans la physiologie normale, après une exposition au soleil, le 7-déhydrocholestérol stocké dans la peau est converti en prévitamine D3, puis isomérisé thermiquement en vitamine D3 . Ensuite, la vitamine D3 est hydroxylée dans le foie en 25-hydroxyvitamine D3 (25(OH)D3). La 25(OH)D3 est ensuite hydroxylée en la forme la plus active de la vitamine D3, la 1,25(OH)2D3, par la 1-hydroxylase (CYP27B1). Les cellules épithéliales des tubules rénaux sont une source majeure de 1-hydroxylase et jouent un rôle essentiel dans la détermination de la concentration de 1,25(OH)2D3 dans le sérum. La présence du CYP27B1 dans les tissus extrarénaux est reconnue depuis des décennies. L’impact du CYP27B1 extrarénal sur la concentration sérique de 1,25(OH)2D3 n’a pas encore été déterminé.

Nous avons rencontré un patient de 34 ans atteint d’urémie qui avait reçu une hémodialyse régulière pendant 2 ans. Le patient a ressenti une faiblesse musculaire accompagnée de fatigue pendant 2 jours avant de consulter un médecin de famille. La chimie du sang a révélé un taux élevé de calcium ionisé (5,44 mg/dL). Malgré l’hypercalcémie, les symptômes du patient ont été soulagés par un traitement conventionnel. Quatre mois plus tard, le patient a présenté une faiblesse musculaire progressive accompagnée de fièvre. Aux urgences, on a de nouveau noté un taux élevé de calcium ionisé (6,88 mg/dL). En outre, un ECG a révélé un rythme cardiaque anormal et un intervalle QT court avec une onde T élargie. Une radiographie pulmonaire a montré une infiltration pulmonaire du lobe supérieur droit qui a été déterminée ultérieurement comme étant une tuberculose pulmonaire. Le patient a ensuite reçu un traitement antituberculeux de 9 mois. Quatre mois après le traitement, le taux de calcium ionisé du patient s’est normalisé (5,2 mg/dL), avec une résolution complète des symptômes. Pour élucider la pathogenèse de l’hypercalcémie de ce patient, nous avons mesuré les taux de 1,25(OH)2D3 en plus des taux de calcium ionisé. Comme le montre la figure 1, les niveaux de 1,25(OH)2D3 étaient fortement corrélés à ceux du calcium ionisé.

Figure 1

Changements dans les concentrations de calcium ionisé et de 1,25(OH)2D3 dans le sérum d’un patient atteint de tuberculose active et d’urémie.

En plus de l’expression rénale du CYP27B1, les macrophages et les monocytes sont considérés comme des sites extrarénaux importants de l’expression du CYP27B1. Dans cette étude, nous avons évalué le rôle des monocytes dans le métabolisme de la vitamine D3 en utilisant un test biologique ex vivo. En outre, nous avons stimulé les monocytes avec des antigènes dérivés de MTB pour obtenir un aperçu supplémentaire de la façon dont les monocytes modulent le métabolisme de la vitamine D3 en réponse au défi bactérien.

2. Matériaux et méthodes

2.1. Population des sujets

Cette étude a été réalisée à l’université de médecine de Kaohsiung. Les participants ont été stratifiés en deux groupes : (1) tuberculose active et (2) contact fréquent avec la tuberculose. Ceux qui présentaient une tuberculose pulmonaire active confirmée par une culture d’expectoration et un cliché thoracique ont été affectés au groupe tuberculose active (). Les contacts fréquents avec la tuberculose () comprenaient les personnes suivantes : (1) le personnel médical qui travaillait au centre de tuberculose depuis au moins 10 ans et qui n’avait jamais été infecté et (2) les membres de la famille des patients tuberculeux, les cliniciens et les infirmières qui avaient des contacts à long terme avec les patients tuberculeux et qui n’avaient jamais été infectés. Tous les contacts fréquents avec la tuberculose avaient été vaccinés par le BCG et subissaient une radiographie pulmonaire annuelle ; lorsque les clichés thoraciques étaient anormaux, un test de Mantoux était effectué. Nous avons exclu les sujets atteints de diabète, de tumeurs malignes ou de toute autre maladie susceptible de provoquer une immunodéficience. Les deux groupes étaient appariés en termes de sexe et d’âge (tableau 1).

2.2. Préparation cellulaire

Les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) ont été isolées à partir de sang hépariné prélevé sur les 2 groupes de donneurs en utilisant un gradient standard Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Suède). Les PBMC ( cellules/mL) ont été remises en suspension dans un milieu RPMI 1640 complété par de la L-glutamine et du sérum de veau fœtal à 10%. Après une incubation d’une heure dans une fiole de 75 cm2 dans un incubateur humidifié à 37°C, 5% de CO2, le milieu contenant les cellules non adhérentes a été décanté dans un tube conique, et la fiole a été lavée deux fois avec du milieu sans sérum pour éliminer toute cellule non adhérente résiduelle. Les monocytes adhérents ont été éliminés par grattage doux avec un grattoir à cellules en plastique. Les cellules ont été transférées dans un tube conique, centrifugées pour éliminer la solution de lavage, et remises en suspension jusqu’à cellules/mL dans un milieu supplémenté. La population de cellules adhérentes contenait plus de 85% de cellules CD14+.

2.3. Antigène

La MTB isolée de patients atteints de tuberculose a été remise en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate et tuée à la chaleur dans un bain-marie à 70°C pendant 70 minutes. Les bactéries ont ensuite été soniquées à l’aide d’un sonicateur New Highway (Farmingdale, NY, USA). La concentration en protéines de l’homogénat bactérien a été déterminée à l’aide du kit de dosage des protéines BCA de Pierce (IL, USA) et conservée à -20°C.

2.4. Analyse cytofluorométrique

L’analyse cytométrique a été réalisée à l’aide d’un cytomètre FACS (Becton Dickinson). Un total de cellules a été incubé avec chaque anticorps monoclonal en quantité saturante dans 50 μL de tampon de coloration (solution saline équilibrée de Hank : 1 % de BSA et 0,1 % d’azide de sodium) pendant 1 heure à température ambiante, puis lavé trois fois avec du PBS. Les cellules ont été préparées pour l’analyse par suspension dans 500 μL de paraformaldéhyde à 1% dans du PBS. La population de monocytes a été sélectionnée pour l’analyse sur la base d’un graphique en points de la diffusion latérale et de la diffusion avant. Un total de 5 000 cellules sélectionnées a été utilisé pour chaque analyse. Les cellules gated ont été analysées plus avant par coloration de fluorescence en utilisant des anti-CD14 conjugués à la fluorescéine-isothiocyanate (FITC-) (Ancell).

2.5. Quantification de la 1,25(OH)2D3

Des monocytes purifiés ont été cultivés à une densité de cellules/mL dans 100 μL dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à 96 puits avec 200 nM de 25(OH)D3 dissous dans une concentration finale de 1% d’éthanol. Après 3 heures d’incubation, 1 mL d’acétonitrile a été ajouté pour arrêter la réaction. Les cellules et le milieu ont été récoltés et combinés avec un volume égal de méthanol pour éliminer les lipides. La quantité de 1,25(OH)2D3 a été déterminée à l’aide du kit 1,25-dihydroxyvitamine D 125I RIA (INCSTAR, Stillwater, MN, USA). En bref, 2 ml d’eau et 5 ml de méthanol/eau (70 : 30) ont été ajoutés à une cartouche C18OH pour éliminer les sels, les lipides polaires et les pigments sous vide. Ensuite, 5 mL d’hexane/chlorure de méthylène (90 : 10) ont été ajoutés à la cartouche C18OH pour éliminer la 25(OH)D3, et 5 mL d’hexane/isopropanol (99 : 1) ont été ajoutés pour éliminer la 24,25(OH)2D3/25,25(OH)2D3. Chaque cartouche de C18OH était étroitement ajustée à l’intérieur d’une cartouche de silice. Après avoir ajouté de l’hexane/isopropanol (92 : 8) sous vide, la cartouche C18OH a été retirée. Enfin, la 1,25(OH)2D3 purifiée a été éluée de la cartouche de silice dans 5 mL d’hexane/isopropanol (80 : 20). Les niveaux de 1,25(OH)2D3 ont été quantifiés par dosage radio-immunologique (RIA) compétitif en utilisant des anticorps anti-1,25(OH)2D3 et anti-1,25(OH)2D3 marqués au 125I.

2.6. Traitement avec des antigènes MTB

Les monocytes ( cellules/mL) ont été incubés avec 10 μg/mL de MTB et 200 ng/mL de 25(OH)D3. Après 3 heures d’incubation, 1 mL d’acétonitrile a été ajouté pour arrêter la réaction. La 1,25(OH)2D3 résultante a été purifiée des cellules et du milieu et quantifiée par RIA. Le reste de la procédure était la même que pour le dosage précédent.

2.7. Analyse statistique

Toutes les données ont été analysées en utilisant le -test de Student.

3. Résultats

3.1. Concentrations de calcium ionisé et de 1,25 Dihydroxyvitamine D3 chez un patient atteint de tuberculose active et d’urémie

Le calcium ionisé et la 1,25(OH)2D3 sériques ont été déterminés à différents moments, de la première visite à un an après la fin du traitement antituberculeux. Comme le montre la figure 1, les niveaux de calcium ionisé sont corrélés avec la concentration de 1,25(OH)2D3 (figure 1).

3.2. Population étudiée

Vingt-cinq personnes ont été recrutées dans le groupe des contacts fréquents avec la tuberculose et 25 patients dans le groupe de la tuberculose active. L’âge moyen et le sex-ratio ne différaient pas significativement entre les groupes. Les caractéristiques de l’ensemble des données sont présentées dans le tableau 1.

3.3. Quantification de la 1,25(OH)2D3

Les monocytes ont été mis en culture avec de la 25(OH)D3 pendant 3 heures. Ensuite, la 1,25(OH)2D3 a été purifiée des cellules et du milieu et mesurée par RIA. Comme le montre la figure 2, la quantité de 1,25(OH)2D3 dans le groupe TB active était de pg/mL (moyenne ± SD), ce qui était significativement plus élevé que dans le groupe contact fréquent avec la TB () . Lorsque les monocytes ont été incubés simultanément avec la MTB et la 25(OH)D3 pendant 3 heures, la quantité de 1,25(OH)2D3 dans le groupe TB active a diminué de façon significative par rapport à celle du groupe sans MTB ( et , respectivement) () (voir figure 3). Il n’y avait pas de différence entre les monocytes avec ou sans exposition à la MTB dans le groupe des contacts fréquents avec la TB ( et , resp.).

Figure 2

Quantification de la 1,25(OH)2D3 chez les patients atteints de TB active et les contacts fréquents avec la TB. Mesure par RIA de la 1,25(OH)2D3 purifiée à partir de suspensions de monocytes cultivés avec de la 25(OH)D3 pendant 3 heures. La quantité de 1,25(OH)2D3 dans le groupe TB active était significativement plus élevée que dans le groupe de contacts fréquents avec la TB. Chaque colonne représente la moyenne de la quantification de la 1,25(OH)2D3. Les barres d’erreur représentent l’écart-type. *.

Figure 3

Quantification de la 1,25(OH)2D3 chez les patients atteints de tuberculose active et les contacts fréquents avec ou sans antigène M. tuberculosis (MTB). Les monocytes ont été pulsés avec de la 25(OH)D3 avec ou sans MTB. La quantité de 1,25(OH)2D3 avec exposition à MTB a diminué de manière significative par rapport à celle sans MTB dans le groupe TB active. Chaque colonne représente la moyenne de la quantification de la 1,25(OH)2D3. Les barres d’erreur représentent l’écart-type. *.

4. Discussion

Nous avons observé que les niveaux de 1,25(OH)2D3 étaient corrélés aux niveaux de calcium ionisé chez un patient urémique atteint de tuberculose pulmonaire. En cas de tuberculose pulmonaire active, les taux sériques de 1,25(OH)2D3 de ce patient étaient élevés, ce qui a induit des taux élevés de calcium ionisé. Après le traitement, les taux de 1,25(OH)2D3 et de calcium ionisé ont tous deux diminué. Théoriquement, chez un patient urémique, l’activité rénale du CYP27B1 est insignifiante. De faibles taux sériques de 1,25(OH)2D3 sont souvent observés chez les patients urémiques. Conformément à ce qui a été observé chez l’homme, de faibles taux de 1,25(OH)2D3 sont également observés dans un modèle de souris anéphrique. Cependant, une source extrarénale de CYP27B1 a été décrite depuis plus de six décennies. Harrell et Fisher ont été parmi les premiers à trouver une synthèse extrarénale de 1,25(OH)2D3 dans des conditions pathologiques. Ces auteurs ont établi l’association entre une homéostasie calcique déréglée et la sarcoïdose. Il a ensuite été démontré que les macrophages tissulaires étaient une source extrarénale de production de 1,25(OH)2D3 dans ces groupes de patients. Différents groupes d’étude ont constaté qu’un nombre croissant de tissus exprimaient CYP27B1, comme les mélanocytes de la peau, les macrophages tissulaires et les cellules résiduelles du placenta. Il est surprenant de constater que toutes les cellules qui expriment le CYP27B1 ne possèdent pas d’activité enzymatique. Afin de clarifier la contribution potentielle des monocytes circulants aux niveaux élevés de 1,25(OH)2D3, nous avons utilisé un test biologique ex vivo utilisant la 25(OH)D3 comme substrat pour déterminer l’activité du CYP27B1. Nos résultats démontrent que l’activité du CYP27B1 dans les monocytes des patients atteints de tuberculose active est significativement plus élevée que celle des monocytes des personnes ayant un contact fréquent avec la tuberculose. Les monocytes circulants contribuent à la conversion de la 25(OH)D3 en 1,25(OH)2D3, plus actif. De façon intrigante, la vitamine D3 était traditionnellement considérée comme un facteur endocrinien ; la 1,25(OH)2D3 produite à des sites locaux (tubules rénaux) est transportée par le sang pour affecter d’autres tissus ou organes, par exemple les os. Cependant, au cours des dernières décennies, il a été démontré que la vitamine D3 jouait des rôles autres que des fonctions endocriniennes. La 1,25(OH)2D3 produite par les cellules inflammatoires peut stimuler l’expression des récepteurs de la vitamine D dans les cellules voisines et dans les cellules inflammatoires elles-mêmes. En se liant au récepteur de la vitamine D et au récepteur des rétinoïdes, le complexe ligand-récepteur peut se lier aux promoteurs de nombreux gènes inflammatoires. En raison de ces effets, on a considéré que la vitamine D3 avait des fonctions paracrines et autocrines. Contrairement à la fonction endocrine de la vitamine D3 en tant que régulateur du calcium, ses fonctions paracrine et autocrine incitent les cellules inflammatoires à produire des peptides antibactériens et augmentent le processus d’autophagie. Comme la 1,25(OH)2D3 est produite localement et n’est pas transportée vers les sites cibles pour la régulation de l’homéostasie du calcium, sa production n’affecte pas les niveaux de calcium sérique. Il est intéressant de noter que dans cette étude, nous avons découvert que la 1,25(OH)2D3 produite par les monocytes était un cas particulier. Bien que la 1,25(OH)2D3 produite par les monocytes puisse agir localement, ces cellules sont transportées par le sang vers les tissus de l’organisme. La 1,25(OH)2D3 produite par les monocytes se comporte également comme un facteur endocrinien. Les monocytes sont peut-être les seules cellules de notre corps qui peuvent orchestrer les fonctions endocrine, paracrine et autocrine de la vitamine D3. Une question intéressante est de savoir quelle est la contribution relative de la source monocytaire de 1,25(OH)2D3 au niveau total de 1,25(OH)2D3. Dusso et al. ont observé que la production maximale de 1,25(OH)2D3 par les monocytes est insignifiante (en fmole/heure/microgramme d’ADN) par rapport à la concentration de 1,25(OH)2D3 dans le sang normal (en pmol/mL). Mais les données proviennent d’une expérience ex vivo, nous ne savons pas combien de monocytes dans le corps sont stimulés pour produire du 1,25(OH)2D3. Nous supposons que la contribution relative de la source monocytaire de 1,25(OH)2D3 au niveau total de 1,25(OH)2D3 est faible dans la plupart des cas. Même chez les patients atteints de maladie granulomateuse, seuls quelques uns présentent des symptômes cliniques d’hypercalcémie résultant d’un taux élevé de 1,25(OH)2D3. Notre cas indicateur est l’un d’entre eux.

Nous avons également constaté que lorsque les monocytes de patients atteints de tuberculose active sont cultivés avec l’antigène MTB, la conversion de la 1,25(OH)2D3 est significativement plus faible que lorsqu’aucun antigène n’est ajouté. Dans le groupe des patients en contact fréquent avec la tuberculose, il n’y avait pas de différence entre le fait d’être avec ou sans antigène MTB. Deux explications sont possibles pour cette observation. Premièrement, les monocytes amorcés de patients atteints de tuberculose active peuvent induire une plus grande activité de la 24(OH) hydroxylase (CPY24) que leurs homologues, qui hydroxyle activement la 1,25(OH)2D3 en acide calcitroïque, lorsqu’ils sont stimulés davantage avec l’antigène MTB. La vitamine D3 induit non seulement des produits génétiques inflammatoires mais aussi l’expression de CPY24 . La CPY24 est une enzyme catabolique majeure de la vitamine D3. Les activités de CYP27B1 et CYP24 sont modulées de manière diamétralement opposée pour contrôler les niveaux sériques de 1,25(OH)2D3 . Grâce à cette action concertée, l’hypercalcémie est rarement observée chez les patients. Le groupe en contact fréquent avec la tuberculose a démontré une action concertée encore meilleure, ce qui explique pourquoi il n’y a pas eu de changement dans la conversion de la 1,25(OH)2D3 après stimulation avec l’antigène MTB. Une deuxième explication est que l’activité de CPY27B1 est épuisée lorsque les monocytes sont restimulés par l’antigène MTB.

L’expression de l’ARNm n’a pas été déterminée dans cette étude pour les raisons suivantes. Tout d’abord, un grand nombre de monocytes des participants était nécessaire pour le test biologique ex vivo. Si nous avions réalisé à la fois l’expression quantitative de l’ARNm et le test biologique ex vivo, nous aurions dû collecter plus de 30 ml de sang de chaque participant. La collecte d’un tel volume de sang a été rejetée par notre comité d’éthique. Deuxièmement, comme indiqué précédemment, certains tissus peuvent exprimer CYP27B1 sans activité enzymatique détectable. Les niveaux d’ARNm ne sont pas toujours corrélés à l’activité enzymatique. Malgré l’expression du CYP27B1 dans certains tissus, aucune activité enzymatique n’a été détectée. Dans les études futures, les niveaux de CYP27B1 et CYP24 et les métabolites de la vitamine D3, tels que l’acide calcitroïque et la 24,25(OH)2D3, devraient être quantifiés pour clarifier le métabolisme de la vitamine D3 dans le processus physiopathologique de la tuberculose.

5. Conclusion

En conclusion, les niveaux de calcium sont corrélés aux niveaux de 1,25(OH)2D3 chez un patient urémique infecté par la tuberculose. En outre, nous avons constaté que l’activité CYP27B1 dans les monocytes est plus élevée chez les patients atteints de tuberculose active que chez ceux qui ont un contact fréquent avec la tuberculose.

Approbation éthique

Ce projet d’étude a été approuvé par le conseil d’examen institutionnel de l’hôpital universitaire médical de Kaohsiung. Le numéro d’approbation est KMUH-IRB-20130103.

Coflit d’intérêts

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts pour cet article.

Contribution des auteurs

Yi-Ching Tung et Wen-Chan Tsai ont réalisé les expériences et rédigé l’article. Tsan-Teng Ou et Wen-Chan Tsai ont conçu l’étude et collecté les spécimens. Tous les auteurs ont lu et approuvé le document final.