Food-grade cationisk antimikrobielt ε-polylysin ændrer midlertidigt tarmens mikrobielle samfund og forudsagt metagenomfunktion i CD-1 mus 1-mus

En kationisk antimikrobiel biopolymer påvirker diversiteten i tarmsamfundet hos murine

40 hun- og 40 hanmus på 6 uger gamle CD-1-mus blev tilfældigt opdelt i fire grupper og adskilt efter køn (i.dvs. 10 hunmus og 10 hanmus pr. gruppe) og fodret med en 20 % fedtholdig diæt suppleret med (i) maltodextrin alene (MD), der tjente som kontrol, (ii) maltodextrin + ε-polylysin (PL), (iii) maltodextrin + pektin (P) og (iv) maltodextrin + ε-polylysin + pektin (PL-P). Tidligere undersøgelser viste, at mus, der er samboende sammen, udviser lignende tarmmikrobielle samfund.38, 39 Således blev poolede afføringspiller fra hvert bur indsamlet i 24-h metaboliske bure og analyseret på tre tidspunkter: uge 1 (baseline), uge 5 (mellemliggende fase) og uge 9 (slutfase) (Fig. 1). Kropsvægt og fødeindtagelse varierede ikke uanset behandlingsgruppe og i hele forsøgsperioden.

For at karakterisere den fylogenetiske diversitet blev 16S rRNA-genets V3/V4-fragment sekventeret for at give 15 739 734 kvalitetsreads efter filtrering.40 Dette gav en gennemsnitlig prøvedybde på 327 911 sekventeringsreads pr. bakteriesamfund. For at vurdere α-diversiteten inden for et givet samfund blev antallet af observerede operationelle taksonomiske enheder (OTU’er) beregnet ved hjælp af vægtet UniFrac.41 Sjældenhedskurver for de observerede OTU’er (Fig. S1) nærmede sig en asymptote uafhængig af kost, prøveudtagningssted og køn for at indikere, at sekventeringsdybden dækkede tilstrækkeligt OTU-diversitet, der var til stede i de samfund, der blev ekstraheret fra fækale prøver.

På phylumniveau udgjorde summen af Actinobacteria, Bacteroidetes, Deferribacteres, Firmicutes, Proteobacteria, Verrucomicrobia over 99 % af OTU’erne identificeret i alle analyserede prøver. Som tidligere rapporteret42, 43 består murins tarmmikrobiom af relativt store bidrag fra fagene Bacteroidetes og Firmicutes (Fig. 2). Dette er i overensstemmelse med andre pattedyrs tarmsamfund, herunder mennesker og ikke-menneskelige primater.44, 45 Imidlertid blev de relative forekomster af Bacteroidetes (p < 0,05) og Firmicutes (p < 0,05) ændret som reaktion på den særlige diætbiopolymer (flervejs ANOVA) (Fig. 2). Interessant nok udviste mus, der blev fodret med ε-polylysin-spektinkomplekset, en stigning af Bacteriodetes på 8.82% (p < 0.05, flervejs ANOVA Tukey HSD post-hoc) med et tilsvarende fald i OTU’er tildelt Firmicutes med 11.13% (p < 0.05, flervejs ANOVA Tukey HSD post-hoc). Dette er i forhold til den samfundsstruktur, der blev bestemt i den maltodextrin-fodrede kontrolgruppe (tabel S1). Desuden udviste de ε-polylysin-fodrede (dvs. uden pektinkompleks) mus et samfund med relativt få Firmicutes i den mellemliggende fase (dvs. 5 uger) af undersøgelsen. Det er bemærkelsesværdigt, at Firmicute OTU’erne steg igen til den oprindelige koncentration på det 9 ugers prøveudtagningstidspunkt (baseline: 55,24 %, mellemliggende fase: 34,71 %, endelig: 59,01 %, baseline vs. mellemliggende: p < 0,05, mellemliggende vs. endelig: p < 0,05, multi-way ANOVA Tukey HSD post-hoc) (Fig. 2 og Tabel S3). Ved at udvise den samme adaptive respons steg den relative fraktion af Bacteriodetes OTU’er forbigående ved 5 ugers fodring og konvergerede til de oprindelige koncentrationer på det endelige tidspunkt (baseline: 35.40%, mellemliggende: 51,18%, endelig: 28,82%, baseline vs. mellemliggende: p < 0,05, mellemliggende vs. endelig: p < 0,05, multi-way ANOVA Tukey HSD post-hoc) (Fig. 2 og Tabel S3). En lignende forbigående stigning i Verrucomicrobia opstod hos mus, der blev fodret med pektin alene, for at falde til de oprindelige niveauer på det endelige prøveudtagningstidspunkt (baseline: 0.59%, mellemliggende: 5,46 %, endelig: 1,01%, baseline vs. mellemliggende: p < 0,05, mellemliggende vs. endelig: p < 0,05 multi-way ANOVA Tukey HSD post-hoc) (Fig. 2 og Tabel S4). Samlet set viser disse resultater, at specifikke biopolymerer af fødevarekvalitet midlertidigt dirigerer phyla-repræsentation i murin-tarm. Dette blev observeret, når både ε-polylysin og pektin blev inkorporeret individuelt. Men når ε-polylysin var kompleks med den anioniske pektin, blev dette fænomen ikke observeret. Det er bemærkelsesværdigt, at der ikke blev observeret betydelige populationsstrømme inden for Actinobacteria, Deferribacteres og Proteobacteria uanset diæt (tabel S5).

Ud over for forstyrrelser i samfundet på fylumniveau skiftede flere bakterieslægter som reaktion på fødevarebiopolymerer. Dette omfatter medlemmer af slægten Bacteroides, som var de hyppigst forekommende taxa i musetarm (14,32 ± 9,58 % på tværs af alle prøverne). I alt (på tværs af begge køn og prøveudtagningssteder) varierede Bacteroides-repræsentationen med hensyn til biopolymerfodringsgruppe. I overensstemmelse med responsen fra phylum Bacteroidetes øgede ε-polylysin (p < 0,05, flervejs ANOVA Tukey HSD post-hoc) og ε-polylysin-spektin-kompleksbehandling (p < 0,05, flervejs ANOVA Tukey HSD post-hoc) Bacteroides spp. populationerne med henholdsvis 7,95 og 7,46 % i sammenligning med maltodextrin-kontrolgruppen (Fig. 3 og Tabel S6). Andre bakteriepopulationer, der blev moduleret af fodringsregimer, omfatter Adlercreutzia, Lactobacillus, Turicibacter og Ruminococcus (flervejs ANOVA, p < 0,05). Specifikt faldt mængden af Adlercreutzia uanset biopolymer i forhold til den maltodextrin-fodrede gruppe uanset biopolymer. Deres relative populationer faldt med henholdsvis 0,18 %, 0,22 % og 0,24 % hos mus, der fik ε-polylysin, pektin og ε-polylysin-pektinkomplekser. Desuden faldt slægten Ruminococcus signifikant med 1,39 % som reaktion på ε-polylysin og faldt med 1,44 % i pectingruppen. Desuden faldt Lactobacillus-indholdet signifikant med 4,95 % i den ε-polylysin-pektinkompleksholdige kost, hvilket afspejler en generel nedgang i Firmicutes i denne gruppe. Dette står i kontrast til pektinfoderet, som berigede Turicibacter i forhold til de tre andre fodertyper. Et komplet katalog over slægter, der adskiller sig i respons på biopolymerforhold, findes i tabel S6.

Maltodextrin er almindeligt anvendt som fortykningsmiddel eller fyldstof i forskellige ernæringsmæssige anvendelser. Dette polysaccharid blev anvendt i formuleringen af alle behandlingsdiæter og tjente således som kontrol for at afgøre, om maltodextrin alene ville berige bakterier, der er i stand til at hydrolyse α-1-4 glykosidiske bindinger mellem d-glukoseresterne. Som sådan blev den relative forekomst af Coprococcus i musetarmen beriget ved indtagelse af maltodextrin inkorporeret i deres føde. Responsforløbet omfattede en signifikant stigning mellem baseline- og mellemliggende prøveudtagningstidspunkter og mellem baseline- og sluttidspunktet (baseline: 0,56 %, mellemliggende: 0,98 %, sidste: 0,91%, baseline vs. mellemliggende: p < 0,05, baseline vs. endelig: p < 0,05) (Fig. 3 og Tabel S7).

I ε-polylysin-behandlingsgruppen steg den relative forekomst af Bacteroides forbigående, i overensstemmelse med svingningen på phylum-niveau (baseline: 8,85%, mellemliggende: 0,91%, p < 0,05, p < 0,05) (Fig. 3 og Tabel S7): 34,40%, endelig: 8,74 %, baseline vs. mellemliggende: p < 0,05, mellemliggende vs. endelig: p < 0,05). Et lignende respons blev observeret for Oscillospira (baseline: 4,96 %, mellemliggende: 2,51 %, endelig: 6,13 %, baseline vs. mellemliggende: p < 0,05, mellemliggende vs. endelig: p < 0,05). Dette står i kontrast til et forbigående fald i OTU’er, der er tildelt Ruminococcus (baseline: 2,17 %, mellemliggende: 0,97 %, endelig: 2,10 %, baseline vs. mellemliggende: p < 0,05, mellemliggende vs. endelig: p < 0,05), og Adlercreutzia (baseline: 0,49 %, mellemliggende: 0,24 %, endelig: 0,34 %, baseline vs. mellemliggende: p < 0,05) (fig. 3 og tabel S8). Desuden udviste Coprococcus spp. en vedvarende berigelse under fodring med signifikante stigninger mellem baseline og det endelige tidspunkt (baseline: 0.47%, intermediær: 0,71%, sidste: 0,91 %, baseline vs. endelig: p < 0,05) (fig. 3 og tabel S8). Dette er i overensstemmelse med den samme tendens, der blev observeret i maltodextrin-kontrolgruppen. Coprococcus-populationer forbliver imidlertid relativt statiske i mus-fodrede pectin- og ε-polylysin-pectinkomplekser.

Pectin midlertidigt beriget for slægten Akkermansia (baseline: 0.59%, intermediær: 5,46%, endelig: 1,01%, baseline vs. mellemliggende: p < 0,05, mellemliggende vs. endelig: p < 0,05), hvilket bidrog til den observerede mellemliggende stigning af Verrucomicrobia. I modsætning hertil blev Adlercreutzia-populationerne mindsket i det mellemliggende prøveudtagningstidspunkt og forblev deprimeret i den endelige observation (Adlercreutzia baseline: 0,48 %, mellemliggende: 0,23 %, endelig: 0,26 %, baseline vs. mellemliggende: p < 0,05). Kandidat-slægten rc4-4 OTU-repræsentation faldt proportionelt, men udviste ufuldstændig tilbagevenden til de oprindelige tilstande (rc4-4 baseline: 1,94 %, intermediær: 1,04 %, endelig: 1,62 %, baseline vs. mellemliggende: p < 0,05) (Fig. 3 og Tabel S9). Interessant nok opretholdt Ruminococcus spp. en aftagende bane i hele fodringsundersøgelsen med signifikante forskelle mellem baseline og endelige tidspunkter (baseline: 2.32%, mellemliggende: 1,63 %, sidste: 1,14 %: baseline vs. endelig: p < 0,05) (Fig. 3 og Tabel S9) (Fig. 3 og Tabel S9).

Men selv om de fleste slægter ikke ændrede sig som reaktion på ε-polylysin-spektinkomplekser, steg Ocscillospira forbigående, før det faldt under de oprindelige niveauer (baseline: 3,56 %, mellemliggende: 4,70 %, endelig: 2,44 %, mellemliggende vs. endelig: p < 0,05). I modsætning hertil blev Parabacteroides-populationer generelt hæmmet af alle diætbehandlinger (baseline: 3.44%, intermediær: 0,79%, endelig: 0,55 %, baseline vs. mellemliggende: p < 0,05, baseline vs. endelig: p < 0,05). Dette svarer til rc4-4 (baseline: 2,82 %, mellemliggende: 0,77 %, endelig: 0,48 %, baseline vs. mellemliggende: p < 0,05, baseline vs. endelig: p < 0,05). Samlet set reagerer tarmmikrobiota-slægter på tilsætningsstoffer af fødevarekvalitet på slægtsniveau, især ε-polylysin (Fig. 3 og Tabel S10).

I tillæg til diætbiopolymerer, der påvirker specifikke taxa, havde samfundets strukturelle sammensætning tydelige og ikke tilfældige ændringer i aggregatet. ANOSIM46 med 999 permutationer blev brugt til at teste signifikante forskelle mellem prøvegrupper baseret på vægtet UniFrac.41 Som forventet ændrede maltodextrin ikke signifikant det murine tarmmikrobielle samfund, der blev fodret med denne kontrol, hverken hos hun- eller hanmus (Fig. 4a, ANOSIM med 999 permutationer, p > 0,05). Tilsvarende fremmede pektin (Fig. 4c, ANOSIM med 999 permutationer, p > 0,05) og ε-polylysin-spektinkomplekser (Fig. 4d, ANOSIM med 999 permutationer, p > 0,05) ikke signifikante forskydninger inden for samfundet. Dette står i bemærkelsesværdig kontrast til tarmmikrobiomerne, der blev forbigående ændret af ε-polylysin alene. Som det blev observeret med specifikke taksonomiske grupper på phylum- og slægtsniveau, blev samfundsstrukturen forstyrret på 5-ugerstidspunktet for efterfølgende at blive løst på det endelige prøveudtagningstidspunkt. Dette tyder på, at populationssammensætningen blev korrigeret til sin oprindelige tilstand gennem tilpasning til den kontinuerligt tilførte biopolymer (fig. 4b, ANOSIM med 999 permutationer, p < 0,05). Dette blev ikke observeret i de ε-polylysin-spektinkompleksbehandlede mus, hvilket tyder på en afskærmende interaktion med det mikrobielle samfund.

ε-polylysin skifter forbigående forudsagt metagenomfunktion

Det metagenomiske potentiale, der er indbygget i tarmmikrobiomer, blev udledt af Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt) baseret på 16S rRNA-fylogenetiske data. I alt 6,854,103,780 observationer blev forudsagt på tværs af 6909 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ortologigrupper (KO) inden for de 48 tarmsamfund, der blev profileret af PICRUSt. De resulterende data blev kategoriseret i 254 funktionelle veje, der omfatter alle de 48 samfund.

I alt var der 44 veje, der blev forudsagt til at skifte signifikant forbigående, mens musene indtog ε-polylysin (ANOVA med Bonferroni-korrektion, p < 0,05) (Fig. 5) (Fig. 5). Som med ændringer i taksonomisk struktur viste de mellemliggende prøver, der blev taget ved 5 uger, en signifikant anderledes profil i forhold til baseline og endelige prøveudtagningstidspunkter. Blandt disse 44 veje eller netværk er 42 veje involveret i bakteriel metabolisme eller forudsiges på anden måde at formidle interaktioner mellem vært og mikroorganismer, med 18 veje til stede med en relativ hyppighed på 0,5 % baseret på gennemsnittet af de tre prøveudtagningssteder (Fig. 5). Af disse blev otte veje forudsagt at falde efter 5 uger og vende tilbage til basalniveauet ved den sidste prøveudtagning. Omvendt udviste 10 forudsagte veje den modsatte tendens og steg midlertidigt i hyppighed. Således blev gener og deres veje relateret til generel transport af opløste stoffer (baseline: 7,53 %, mellemliggende: 5,88 %, endelig: 7,68 %, p < 0,05) og ABC-transportører (baseline: 3,35 %, mellemliggende: 2,76 %, endelig: 3,44 %, p < 0,05) undertrykt ved den mellemliggende samfundstilstand og kom i sidste ende tilbage til baseline-niveauerne. Dette tyder på, at metaboliske behov og/eller miljøkoncentrationer af ønskelige opløsninger kortvarigt kan mindskes før genoprettelse af mikrobiomstrukturen. Desuden forudsiges centrale metaboliske processer, der er involveret i kulhydrat- og proteinmetabolisme, at overgå til en reversibel tilstand, mens værten indtager den ε-polylysinberigede kost. Dette afspejles i glykolytiske/fermentative veje (baseline: 1,05 %, mellemliggende: 1,13 %, endelig: 1,08 %, p < 0,05), pyruvatmetabolisme (baseline: 1,01 %, mellemliggende: 1,07 %, endelig: 1,02 %, p < 0,05), pyruvatmetabolisme (baseline: 1,01 %, mellemliggende: 1,07 %, endelig: 1,02 %, p < 0.05), fruktose- og mannosemetabolisme (baseline: 0,085 %, mellemliggende: 0,099 %, endelig: 0,089 %, p < 0,05) og gener, der er forbundet med oxidativ fosforylering (baseline: 1,12 %, mellemliggende: 1,23 %, endelig: 1,08 %, p < 0,05). Sidstnævnte KO er sandsynligvis involveret i anaerob respiration og er midlertidigt beriget i det mellemliggende tidspunkt. Ud over kulhydratkatabolisme blev veje, der er forbundet med nitrogenflux, flyttet ved 5 uger, herunder aminosukker- og nukleotidsukkermetabolisme (baseline: 1.47%, mellemliggende: 1.60%, endelig: 1.50%, p < 0.05), og histidinmetabolisme (baseline: 0.062%, mellemliggende: 0.067%, endelig: 0.061%, p < 0.05). Vi havde oprindeligt stillet den hypotese, at kendetegn for lysinkatabolisme ville være beriget i de forudsagte metagenomer af mus fodret med ε-polylysin, enten i PL- eller PL-P-diæten. Dette signal blev imidlertid ikke observeret i PICRUSt-analysen, hvilket tyder på, at ε-polylysin ikke selekterede bakteriepopulationer, der øgede det lysinkataboliske potentiale.

Da de forudsagte metagenomer reagerede på ε-polylysin i kosten, blev der ikke påvist signifikante forskelle i de andre tre fodringsgrupper. Dette omfatter mus fodret med ε-polylysin komplekseret med pektin, hvilket giver yderligere støtte til elektrostatisk afskærmning for at afbøde den antimikrobielle indflydelse fra ε-polylysin. Pektin alene ændrer ikke samfundets struktur eller forudsagt funktion.

Værtskøn påvirker det basale mikrobiom, men ikke responsbanen

Både han- og hunmus blev observeret for at bestemme, om biopolymeraktivitet inden for mikrobiomet er kønsafhængig. I overensstemmelse hermed koloniserede flere bakterietaxa han- og hundyr asymmetrisk og på en ikke tilfældig måde. Dette omfatter phylum Verrucomicrobia fundet i højere koncentrationer i hunmus end hanner samlet set (hunmus: 4,96% af 24 prøver, hanmus: 2,63% af 24 prøver, p < 0,05, multi-way ANOVA) (Tabel S11). Meget af dette kan forklares af forskelle i Akkermansia-populationer (hunmus: 4.50%, hanmus: 2.63% p < 0.05). Desuden husede hunmus signifikant større populationer af bakterieslægterne Parabacteroides (hunmus: 2,47 %, hanmus: 0,5 %, p < 0,05) og Bilophila (hunmus: 2,13 %, hanmus: 0,01 %, p < 0,05). I modsætning hertil blev hanmus koloniseret af større koncentrationer af Odoribacter (hun: 0%, han: 0,92%, p < 0,05), Turicibacter (hun: 0,02%, han: 0,21%, p < 0,05), Clostridium (hun: 0,01%, han: 0,10%, p < 0,05) og kandidatgenus rc4-4 (hun: 0.16%, han: 2,46%, p < 0,05) (Tabel S12).

Ud over de taksonomiske forskelle er der strukturelle forskelle i samfundet, der kan tilskrives dyrenes køn, tydelige i UniFrac-afstanden visualiseret ved hovedkoordinatanalyse (PCoA) i Fig. 6a. Følgelig klynger tarmmikrobiota observeret i hun- og hanmus sig sammen efter køn og på en måde, der ligner hinanden mere inden for deres respektive køn, end de gør med hinanden (Fig. 6a, ANOSIM med 999 permutationer, p < 0,05). Desuden udviste hierarkisk klynge af mikrobiomer og bakterieslægter baseret på deres relative overflod et lignende mønster, idet bakteriesamfund inden for samme køn har tendens til at klynge sig (Fig. S2 og S3). Den gennemsnitlige fylogenetiske diversitet inden for gruppen hos hunmus er mindre end hos hanmus (Fig. 6b, t-test, p < 0.05), mens der ikke blev observeret forskelle mellem hunmus og hanmus i det samlede antal observerede OTU’er og Chao 1-indekset (Fig. S4).

I modsætning til de strukturelle forskelle mellem mikrobiomer, der husede hunner, og mikrobiomer, der husede hanner, varierede kun tre forudsagte metagenomiske veje signifikant. Dette omfatter transkriptionsrelaterede operationer (kvinde: 0,0092 %, mand: 0,0051 %, p < 0,05), biosyntese af aminoglykosidantibiotika (kvinde: 0,087 %, mand: 0,080 %, p < 0,05) og glycerophospholipidmetabolisme (kvinde: 0,55 %, mand: 0,52 %, p < 0,05). Det er uklart, om disse ligger til grund for udtrykte metaboliske forskelle mellem de to værtskøn. Bevarelse af funktion på trods af taksonomisk variation er i overensstemmelse med redundans i genetisk potentiale, der tidligere er observeret inden for andre mikrobielle samfund.46, 47

På trods af kønsafhængige funktioner forbliver den specifikke effekt af biopolymerbehandlinger uafhængig af køn som angivet af PCoA-analyse (Fig. 3). Specifikt ændrer ε-polylysin forbigående murinmikrobiomet på det mellemliggende prøveudtagningstidspunkt uanset køn. Mens pectin eller pectin komplekseret med ε-polylysin ikke ændrer hun- og hanmusenes mikrobiota. En lignende responsvej er tydelig i fluxer på phylumniveau, da Bacteriodes- og Firmictues-repræsentationen er midlertidigt forskudt som reaktion på ε-polylysin hos begge køn (Fig. S5). Desuden udviste tarmmikrobiomerne afledt af begge køn den samme ændring i Verrucomicrobia, når de blev fodret med pektin (Fig. S5). I forhold til den gruppe, der fik maltodextrin, øgede den ε-polylysin-pektin-komplekse kost desuden Bacteriodetes og mindskede Firmicutes uafhængigt af køn. Disse resultater tyder på, at kønsafhængige træk (f.eks. hormoner) ikke virkede synergistisk eller antagonistisk med diætbiopolymerer for at ændre samfundsstrukturen generelt og inden for de vigtigste phyla.

Interessant nok kan diætbiopolymerer ændre genusrepræsentationen, der i nogen grad er afhængig af køn. Den relative forekomst af Parabacteroides (køn*behandling p < 0,05, multiway ANOVA), Clostridium (køn*behandling p < 0,05, multiway ANOVA), Coprococcus (køn*behandling, p < 0,05, multiway ANOVA) og Bilophila (køn*behandling p < 0,05, multiway ANOVA) udviste en beskeden afhængighed af værtens køn (Fig. S6). Hos hunmus var Coprococcus-indholdet højere i pektingruppen i forhold til de tre andre grupper hos hunmus (MD: 0,69 %, PL: 0,63 %, P: 0,98 %, PL+P: 0,65 %, MD vs. P: p < 0,05, PL vs. P: p < 0,05, P vs. PL+P: p < 0,05). Hos hanmus var Coprococcus OTU’er i pektingruppen imidlertid mindre i mikrobiomerne sammenlignet med de tre andre grupper (MD: 0,94 %, PL: 0,77 %, P: 0,45 %, PL+P: 0,78 %, MD vs. P: p < 0,05, PL vs. P: p < 0,05, P vs. PL+P: p < 0,05). Også Bilophila blev reduceret i hunmus fodret med ε-polylysin i forhold til ε-polylysin-spektin kompleks kost (MD: 0.51%, PL+P: 1.63%, p < 0.05), mens mikrobiomet hos hanmus ikke udviste denne kønsrelaterede populationsflux. Desuden påvirkede interaktionerne mellem køn, prøveudtagningssteder og biopolymer den observerede relative forekomst af slægten Turicibacter (p < 0,05), Clostridium (p < 0,05), Coprococcus (p < 0,05) og kandidatslægten rc4-4 (p < 0,05).