Fluorescerende proteinmærker

Indledning

Fluorescerende proteiner (FP’er) er blevet anvendt som proteinmærker siden midten af 1990’erne, hovedsagelig til cellebiologi og fluorescensmikroskopi. Disse tags har ikke kun revolutioneret cellebiologien ved at gøre det muligt at afbilde næsten alle proteiner, men de anvendes også i biokemiske anvendelser. Et vigtigt eksempel er immunoprecipitering og affinitetsrensning af FP-mærkede proteiner, som blev muliggjort af udviklingen af affinitetsharpikser med højt udbytte, høj renhed og affinitet som f.eks. ChromoTeks Nano-Traps (https://www.chromotek.com/products/detail/product-detail/nano-traps/).

I denne blog giver vi en gennemgang af

• grønne fluorescerende proteiner
• røde fluorescerende proteiner
• selvmarkerende proteiner, der kræver kovalent kobling af et fluorescerende molekyle

Typer af fluorescerende proteiner

De fleste forskere bruger intrinsisk fluorescerende proteiner GFP, mNeonGreen, TurboGFP, RFP eller mCherry. Alternativt er der blevet indført extrinsisk fluorescerende eller selvmærkende proteiner, som kræver kovalent kobling af et fluorescerende molekyle til det ikke-fluorescerende protein, f.eks. proteinmærkerne SNAP, CLIP og Halo. Disse selvmærkende fluorescerende proteiner har visse præstationsfordele i forhold til intrinsisk fluorescerende proteiner på grund af deres fluorescerende farvestoffers egenskaber.

Figur 1: Strukturer af fluorescerende proteiner.

(A) Intrinsisk fluorescerende proteiner (FP’er) såsom EGFP, GFP, RFP, mNeonGreen, turboGFP osv. deler kun et lille antal fælles rester, men folder sig alle i en bevaret β-barrel-struktur. Deres fluorescens opstår gennem cyklisering af rygraden og oxidation af tre aminosyrerester i midten af denne tønde (fremhævet til højre), hvilket resulterer i en kromofor med to ringe. Denne kemiske proces beskrives som modning af chromoforen, er indbygget i proteinfolden og afhænger kun af miljøvariabler som temperatur og iltkoncentration, men ikke af yderligere enzymer. Farven, fotostabiliteten, kvanteudbyttet og andre spektrale egenskaber ved intrinsisk fluorescerende proteiner er et resultat af mutationer i de aminosyrer, der udgør kromoforen eller er placeret i nærheden af kromoforen.

(B) Ekstrinsisk fluorescerende proteiner som HaloTag er ikke-fluorescerende i deres basale apo-form. Kun hvis der tilsættes en egnet aktiveret fluorofore til HaloTag-proteinet, vil denne fluorofore blive fanget og kovalent bundet af HaloTag-resten D106, hvorved HaloTag bliver fluorescerende. (PDB ID’er for strukturer: EGFP, 2y0g; apo-HaloTag, 5uy1; holo-HaloTag, 5uxz.)

Jellyfish Green Fluorescent Protein (GFP) og dets derivater er stadig de mest anvendte fluorescerende proteiner i biomedicinsk forskning. For nylig er der blevet introduceret yderligere grøn fluorescerende proteiner, som stammer fra andre organismer. Disse FP’er har den samme grundlæggende fold som GFP, men de adskiller sig meget fra hinanden på sekvensniveau. Derfor kræver de nye, dedikerede forskningsredskaber som f.eks. antistoffer.

Den originale: GFP

Grønt fluorescerende protein blev første gang isoleret fra vandmanden Aequorea victoria i 1962 af Osamu Shimomura. Det har en grøn fluorescens med lang Stokesforskydning (ex 395 nm; em 509 nm). 30 år senere lykkedes det Douglas Prasher til sidst at klone sekvensen af GFP, og Martin Chalfie udtrykte denne sekvens in vivo. Senere udviklede Roger Tsien-laboratoriet GFP til en række veritable forskningsværktøjer. Shimomura, Chalfie og Tsien blev tildelt Nobelprisen i 2008. Se Roger Tsiens foredrag om Nobelprisen her: https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2008/tsien/lecture/.

Forskerne har udviklet et væld af GFP-varianter med forskellige egenskaber. Disse FP’er har forskellige funktionelle og spektrale egenskaber. Den første væsentlige forbedring af GFP var en mutation (S65T), som øgede intensiteten og stabiliteten af fluorescenssignalet. Den vigtigste excitationstop er blevet forskudt til 488 nm (Heim et al., 1995). Den almindelige variant EGFP er en manipuleret version af GFP, hvilket letter den praktiske anvendelse af GFP i en række forskellige organismer og celler.

Grønt Fluorescerende Protein GFP er også kendt som avGFP, wtGFP og gfp10; EGFP som forbedret GFP og GFPmut1.

https://www.fpbase.org/protein/avgfp/

https://www.fpbase.org/protein/egfp/

TurboGFP

TurboGFP

TurboGFP, der blev rapporteret i 2004, er et hurtigt modnende og lyst dimerisk grønt fluorescerende protein, der er afledt af CopGFP fra copepoden Pontellina plumata. Copepod TurboGFP er evolutionært fjernt fra fluorescerende proteiner, der stammer fra vandmænd, såsom EGFP, og deler kun ca. 20 % sekvensidentitet med de almindeligt anvendte GFP-varianter. Derfor binder de fleste anti-GFP-antistoffer, herunder GFP-Nanobody, der anvendes i GFP-Trap, ikke til TurboGFP.

https://www.fpbase.org/protein/turbogfp/

mNeonGreen

mNeonGreen er afledt af et multimerisk gult fluorescensprotein fra lancetplanten Branchiostoma lanceolatum. Derfor er mNeonGreen evolutionært fjernt fra FP’er, der stammer fra vandmænd. mNeonGreen og almindelige GFP-derivater deler kun ca. 20 % sekvensidentitet. På grund af den lave sekvenslighed forventes det, at affinitetsværktøjer (dvs. antistoffer) til GFP-varianter ikke vil binde til mNeonGreen. Dette er i hvert fald blevet vist for ChromoTeks affinitetsreagenser (anti-GFP Nanobodies/ VHH’er og antistoffer).

MNeonGreen, der blev offentliggjort første gang i 2013, er op til tre gange så lysstærk som GFP. Det er et nyt, monomerisk, alsidigt grøn/gult fluorescerende protein til billeddannelsesapplikationer, herunder superopløsningsmikroskopi. Desuden fungerer mNeonGreen som acceptor for cyan fluorescerende proteiner i fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) applikationer. Det synes at være det hidtil mest lysstærke monomere grønne fluorescerende protein, der er kendt, og det har en hurtig modningshastighed.

https://www.fpbase.org/protein/mneongreen/

Sammenligning af GFP, TurboGFP, og mNeonGreen

Egenskaber	EGFP (det mest almindeligt anvendte GFP-derivat)	turboGFP	mNeonGreen
Opdagelse/ første offentliggørelse
Origin	GFP fra brandmænd Aequorea victoria	CopGFP fra copepod Pontellina plumata	multimere gult fluorescerende protein fra lancetling Branchiostoma lanceolatum
Matureringshastighed (ved 37°C)	25 min	25 min	10 min
Sekvensidentitet med EGFP	(100%)	~20%	~20%
Afledt af GFP?	Ja	Nej	Nej
Struktur	Svagt dimer	Dimer	Monomer
	Hyppige varianter	AcGFP, Clover, eGFP, Emerald, GFP, GFP, GFP5, GFP Envy, GFP S65T, mGFP, mPhluorin, PA-GFP, Superfolder GFP, TagGFP, TagGFP, TagGFP2, monomer eGFP A206K, CFP, eCFP, mCerulean, YFP, Citrine, eCitrine, eYFP, Venus, Ypet, BFP	TurboGFP, CopGFP	mNeonGreen
Excitation/emissionsmaksimum	488 nm/ 509 nm	482 nm/ 502 nm	506 nm/ 517 nm
	Længde/ molekylvægt (MW)	239 aminosyrer, 26.9 kDa	2x 232 aminosyrer, 2x 26 kDa	237 aminosyrer, 26,6 kDa
Forskningsværktøjer, der tilbydes af ChromoTek	Immunoprecipitation: GFP-Trap Immunofluorescens: GFP-Booster, Kanin anti-GFP antistof PABG1 Western blot: GFP-Booster, Kanin anti-GFP antistof PABG1 Western blot: Rotte anti-GFP antistof Kontrol: oprenset EGFP protein	Immunopræcipitation: TurboGFP-Trap	Immunopræcipitation: mNeonGreen-Trap Immunofluorescens: Mouse anti-mNeonGreen antistof Western blot: Mouse anti-mNeonGreen antibody

Røde fluorescerende proteiner (RFP’er) er FP’er, der udsender rød-orange fluorescerende lys. Det første RFP, der blev kommercielt tilgængeligt, var DsRed. Det blev afledt fra Discosoma sp. søanemoner i 1999.

DsRed har nogle immanente praktiske problemer: (i) Det har en modningstid på ca. 24 timer, hvilket gør det ubrugeligt til kort(ere) tids eksperimenter. (ii) Den tetrameriske form af DsRed kan kompromittere funktionen af de proteiner, som den er knyttet til. (iii) Dens fotostabilitet er ret lav.

Som følge heraf blev DsRed underkastet site-directed mutagenese for at blive almindeligt anvendelig som et genetisk kodet fusionstag. Til sidst blev der skabt monomere RFP-derivater med bedre fluorescerende ydeevne (med hensyn til lysstyrke og fotostabilitet) og højere modningseffektivitet. Desuden blev der genereret derivater med orange, rød og meget rød fluorescens. Disse monomeriserede versioner af RFP blev de værdifulde forskningsredskaber mCherry, mOrange, mRaspberry, mPlum (også kendt som “mFruits”), mKO, mRFP (også kendt som “mFruits”), mKO, mRFP (a.k.a. mRFP1), mRFPruby, mRuby, tagRFP, mKate2 og DsRed-Express osv.

Der blev identificeret yderligere RFP’er i andre antozoer (dvs. anemoner og koraller), men disse proteiner var også for det meste tetramere. De er således ikke blevet yderligere optimeret til brug i forskning endnu.

mRFP (også kendt som mRFP1)

Den første monomere variant af dsRed, der blev gensplejset i Roger Tsiens laboratorium, blev ganske enkelt betegnet mRFP (eller mRFP1), dvs. monomer rødt fluorescerende protein. Sammenlignet med dsRed er mRFP1 kendetegnet ved en lidt lavere grad af absorption, kvanteudbytte og fotostabilitet. Imidlertid er dets modningshastighed ca. 10 gange hurtigere end dsRed, hvilket resulterer i en tilsvarende effektiv lysstyrke, når det udtrykkes i levende celler.

https://www.fpbase.org/protein/mrfp1/

mCherry

mCherry er sandsynligvis den mest almindeligt anvendte RFP-variant. Det er et monomer rødt fluorescerende protein med bred anvendelighed som et fusionsprotein i forskellige celletyper. Ligesom andre mFruit RFP’er er mCherry afledt af den dsRed-variant mRFP1 via styret evolution af Roger Tsiens laboratorium. Sammenlignet med andre mFruits har mCherry den højeste fotostabilitet, den hurtigste modningshastighed og en fremragende pH-resistens. Den har dog et lavere kvanteudbytte end mRFP1.

https://www.fpbase.org/protein/mcherry/

mPlum

Roger Tsiens laboratorium har også frembragt et fjernrødt monomerisk derivat af mRFP1/dsRed, der har fået navnet mPlum. Fjernrøde FP’er er fordelagtige til billeddannelsesapplikationer for hele kroppen, fordi de vigtigste vævsabsorbenter såsom vand, lipider og hæmoglobin er næsten gennemsigtige i emissionsområdet 650-900 nm. Som de fleste rødforskydede RFP’er har mPlum et udvidet Stokes-skift.

https://www.fpbase.org/protein/mplum/

Sammenligning af mCherry, mRFP (mRFP1), og mPlum

Egenskab	mCherry	mRFP (mRFP1)	mPlum
Opdagelse/ første publikation
Origin	DsRed fra havanemone Discosoma sp.	DsRød fra havanemone Discosoma sp.	DsRød fra havanemone Discosoma sp.
Matureringshastighed (ved 37°C)	15 min	60 min	100 min
Struktur	Monomer	Monomer	Monomer
Aggregation	nej	nej	nej
	Eksponering/emissionsmaksimum	587 nm/ 610 nm	584 nm/ 607 nm	590 nm/ 649 nm
	Længde/ molekylvægt (MW)	236 aminosyrer, 26.7 kDa	228 aminosyrer, 25,4 kDa	229 aminosyrer, 25,6 kDa
Forskningsværktøjer leveret af ChromoTek	Immunoprecipitation: RFP-Trap Immunofluorescens: RFP-Booster, rotte anti-RFP antistof Western blotting: RFP-Booster, rotte anti-RFP antistof Western blotting: RFP-Booster, rotte anti-RFP antistof Western blotting: Mus anti-RFP antistof	Immunopræcipitation: RFP-Trap Immunofluorescens: RFP-Booster, rotte anti-RFP antistof Western blotting: RFP-Booster, rotte anti-RFP antistof Western blotting: Mus anti-RFP antistof	Immunopræcipitation: RFP-Trap Immunofluorescens: RFP-Booster, Rat anti-RFP antibody Western blotting: Mus anti-RFP antistof

De ekstrinsisk fluorescerende proteinmærker Halo, SNAP og CLIP kræver kovalent indfangning af en lille fluorescerende ligand for at blive til et fluorescerende protein. Til dette formål er disse selvmærkende proteintags afledt af enzymer, der katalyserer dannelsen af kemiske bindinger: SNAP- og CLIP-tags er varianter af O6-alkylguanin-DNA-alkyltransferase, der reagerer med henholdsvis benzylguanin- og benzylcytosin-derivater. HaloTag’et er afledt af en haloalkan-dehalogenase og reagerer med alkylhalogenider (figur 1).

Generelt er både intrinsisk og extrinsisk fluorescerende proteiner fused til et protein af interesse for at muliggøre dets cellulære billeddannelse og detektion. Ekstrinsisk fluorescerende proteiner kræver imidlertid, at der tilføjes en reaktiv fluorofor, hvilket har flere fordele:

• Højere kvanteudbytte og fotostabilitet
• Stærk fluorescens i både levende og fikserede celler
• Et bredere udvalg af fluorescerende farvestoffer
• Et enkelt genetisk konstrukt giver mulighed for at vælge forskellige fluorophorer til flerfarvede imaging/multiplexing
• Fluorescens initieres kun ved tilsætning af mærket

Den tilgængelige mængde af tre extrinsisk fluorescerende proteiner med forskellige substrat/ligand-specificiteter muliggør deres ortogonale brug i multiplexede eksperimenter, også i kombination med intrinsisk fluorescerende FP’er.

Afhængigt af de eksperimentelle behov kan man anvende cellepermeante ligander baseret på tetramethylrhodamin (TMR), Oregon Green, diAcFAM eller coumarin, som let krydser cellemembranen til mærkning af intracellulære proteiner. Alternativt kan der anvendes celleimpermeante ligander baseret på impermeable fluorophorer som Alexa Fluor® 488 og 660 til hurtig mærkning af celleoverfladen.

Sammenligning af HaloTag og SNAP-Tag, og CLIP-Tag

Property	HaloTag	SNAP-Tag	CLIP-Tag
Opdagelse/første offentliggørelse
Origin	Haloalkan dehalogenase fra Rhodococcus rhodochrous	human O6-alkylguanin-DNA-alkyltransferase	human O6-alkylguanin-DNA-alkyltransferase
Struktur	Monomer	Monomer	Monomer	Monomer
Reaktivitet	Chloralkan-derivater	O6-benzylguaninderivater	Benzylcytosinderivater
Ligander	Cellpermeable eller ikke-permeable farvestoffer, fluorophorer, biotin og perler	Cellpermeable eller ikke-permeable farvestoffer, fluorophorer, biotin og perler	Cellpermeable eller ikke-permeable farvestoffer, fluorophorer, biotin, og perler
Excitation/emissionsmaksimum	Afhænger af den koblede fluorofore	Afhænger af den koblede fluorofore	Afhænger af den koblede fluorofore
Længde/molekylvægt (MW)	297 aminosyrer, 33.6 kDa	182 aminosyrer, 19,4 kDa	182 aminosyrer, 19,4 kDa
Forskningsværktøjer, der tilbydes af ChromoTek	Immunoprecipitation: Halo-Trap Western blotting: mus anti-HaloTag antistof	Immunopræcipitation: SNAP/CLIP-tag-Trap Western blotting: rotte anti-SNAP/CLIP-tag® antistof	Immunoprecipitation: SNAP/CLIP-tag-Trap Western blotting: rotte anti-SNAP/CLIP-tag® antistof

HaloTag

Det selvmærkende HaloTag er afledt af haloalkan dehalogenaseenzym DhaA fra Rhodococcus rhodochrous. Dets aktive sted er blevet genetisk modificeret til irreversibelt at binde chloroalkanlinkersubstrater. På grund af denne type selvmordsinhibering er det ikke længere muligt at regenerere det katalytiske sted til yderligere dehalogenering. Afhængigt af det valgte substrat omdannes HaloTag’en til et fluorescerende proteintag eller kan f.eks. immobiliseres på agaroseperler.

Da haloalkan-dehalogenaser ikke findes i eukaryote celler og de fleste prokaryoter, herunder E. coli, vil der ikke være nogen baggrundsmærkning.

SNAP-tag

Det selvmærkende proteintag SNAP-tag er afledt af den humane O6-alkylguanin-DNA-alkyltransferase (hATG), der som et wildtypeprotein fjerner alkyleringsskader fra DNA. Den resulterende hAGT-variant, der anvendes som SNAP-tag, reagerer kovalent med O6-benzylguaninderivater (dvs. et fluorescerende mærke, der er konjugeret til guanin- eller chloropyrimidinafgangsgrupper via en benzyllinker) på en irreversibel og meget specifik måde. I mærkningsreaktionen er substratets substituerede benzylgruppe kovalent knyttet til SNAP-tag.

CLIP-tag

CLIP-tag er en modificeret version af SNAP-tag, der er konstrueret til at reagere med benzylcytosin i stedet for benzylguaninderivater. Når CLIP-tag anvendes sammen med SNAP-tag, giver CLIP-tag mulighed for ortogonal og komplementær mærkning af to proteiner samtidig i den samme celle.

En guide til valg af fluorescerende proteiner
Shaner N.C., Steinbach P.A. og Tsien R.Y. (2005)
Nature Methods 2(12), 905-909 doi: 10.1038/nmeth819
http://www.tsienlab.ucsd.edu/Publications/Shaner%202005%20Nature%20Methods%20-%20Choosing%20fluorescent%20proteins.pdf

Grønne fluorescerende proteiner:
Det grønt fluorescerende protein
Tsien R.Y. (1998)
Annual Review of Biochemistry, 67(1), 509-544. doi: 10.1146/annurev.biochem.67.1.509.

Forbedret grøn fluorescens
Heim, R., Cubitt A.B. og Tsien R.Y. (1995)
Nature, 373, 663-664. doi: 10.1038/373663b0

Strukturelt grundlag for den hurtige modning af Arthropoda grønt fluorescerende protein
Evdokimov A.G., Pokross M.E., Egorov N.S., Egorov N.S., Zaraisky A.G., Yampolsky I.V., Merzlyak E.M., Shkoporov A.N., Sander I, Lukyanov K.A. og Chudakov D.M. (2006)
EMBO reports, 7(10), 1006-1012. doi: 10.1038/sj.embor.7400787.

Et lyst monomert grønt fluorescerende protein afledt af Branchiostoma lanceolatum
Shaner N.C., Lambert G.G., Chammas A., Ni Y., Cranfill P.J., Baird M.A., Sell B.R., Allen J.R., Day R.N., Israelsson M, Davidson M.W. og Wang J. (2013)
Nature Methods, 10(5), 407-409. doi: 10.1038/nmeth.2413

Røde fluorescerende proteiner:

Forbedrede monomere røde, orange og gule fluorescerende proteiner, der er afledt af Discosoma sp. rødt fluorescerende protein
Shaner N.C., Campbell R.E., Steinbach P.A., Giepmans B.N.G., Palmer A.E. og Tsien R.Y. (2004)
Nature Biotechnology, 22(12), 1567-1572. doi: 10.1038/nbt1037

Et monomerisk rødt fluorescerende protein
Campbell R.E., Tour O., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A. og Tsien R.Y. (2002)
PNAS, 99(12), 7877-7882. doi: 10.1073/pnas.082243699

Evolution af nye ikke-antistofproteiner via iterativ somatisk hypermutation
Wang L., Jackson W.C., Steinbach P.A. og Tsien R.Y. (2004)
PNAS, 101(48), 16745-16749. doi: 10.1073/pnas.0407752101.

Recovery of Red Fluorescent Protein Chromophore Maturation Deficiency through Rational Design
Moore M.M., Oteng-Pabi S.K., Pandelieva A.T., Mayo S.L. og Chica R.A. (2012)
Plos ONE, 7(12), e52463. doi: 10.1371/journal.pone.0052463.

Halo, SNAP og CLIP:

Releasable SNAP-tag Probes for Studying Endocytosis and Recycling
Cole N.B. og Donaldson J.G. (2012)
ACS Chemical Biology,7(3): 464-469, doi: 10.1021/cb2004252

Site-Specifik proteinmærkning med SNAP-Tags
Cole N.B. (2013)
Current protocols in protein science / editorial board, Coligan J.E. et al, 73: 30.1.1.1-30.1.16., doi: 10.1002/0471140864.ps3001s73

An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells
Gautier A., Juillerat A., Heinis C., Corrêa I.R., Kindermann M., Beaufils F. og Johnsson K. (2008)
Chemistry and Biology 15 (2): 128-136, doi: 10.1016/j.chembiol.2008.01.007

HaloTag: En ny teknologi til mærkning af proteiner til billeddannelse af celler og proteinanalyse
Los G.V., Encell L.P., McDougall M.G., Hartzell D.D., Karassina N., Zimprich C, Wood M.G., Learish R, Friedman-Ohana R, Urh M., Simpson D., Mendez J., Zimmerman K., Otto P., Vidugiris G., Zhu J., Darzins A., Klaubert D.H., Bulleit R.F. og Wood K.V. (2008)
ACS Chem. Biol. 3(6): 373-382 doi: 10.1021/cb800025k

En generel metode til kovalent mærkning af fusionsproteiner med små molekyler in vivo.
Keppler A., Gendreizig S., Gronemeyer T., Pick H., Vogel H. og Johnsson K (2003)
Nat. Biotechnol. 21: 86-89, doi: 10.103838/nbt765

Fluorescerende mærkning af COS-7, der udtrykker SNAP-tag-fusionsproteiner til billeddannelse af levende celler
Provost C.R. og Sun L. (2010)
Visualized Exp. 39: 1876, doi: 10.3791/1876

Kun til forskningsbrug.

ChromoTek’s produkter og teknologi er omfattet af bevilgede patenter og verserende ansøgninger, der ejes af eller er tilgængelige for ChromoTek GmbH ved eksklusiv licens.

ChromoTek, Chromobody, F2H, GFP-Trap, Myc-Trap, RFP-Trap, Spot-Tag, Spot-Label og Spot-Trap er registrerede varemærker tilhørende ChromoTek GmbH. SNAP-tag er et registreret varemærke og CLIP-tag er et varemærke tilhørende New England Biolabs, Inc. Nanobody er et registreret varemærke tilhørende Ablynx, et selskab under Sanofi. Andre leverandørers produkter kan være varemærker eller registrerede varemærker tilhørende den respektive leverandør. Udsagn om andre leverandørers produkter er givet i henhold til vores bedste viden.