Solulinjat
Solulinjat ja niiden lähteet ovat seuraavat: 293T (ATCC CRL-11268), 786-O (ATCC CRL-1932) ja HK-2 (ATCC CRL-2190). THP-1-solut saatiin ystävällisesti Kiinan tiedeakatemian kantasolupankista. Soluja kasvatettiin DMEM- (293T ja 786-O), MEM- (HK-2) tai RPMI 1640 (THP-1) -mediassa, jossa oli 10 % naudan sikiöseerumia ja 2 mM l-glutamiinia, 37 °C:ssa 5 %:n hiilidioksidipitoisuudessa. Ennen bakteerien infektointia, proteiinikäsittelyä tai kemotaksisanalyysiä väliaine vaihdettiin seerumivapaaseen väliaineeseen.
Bakteerikannat ja plasmidit
Tässä tutkimuksessa käytetyt bakteerikannat ja plasmidit on lueteltu lisätaulukossa S3. E. coli -kantoja viljeltiin 37 °C:ssa Luria-Bertani (LB) -alustassa staattisissa olosuhteissa 12 tunnin ajan käyttäen tarvittaessa sopivia antibiootteja seuraavissa pitoisuuksissa: Kanamysiini 50 μg/ml, ampisilliini 100 μg/ml ja kloramfenikoli 15 μg/ml. ΔhlyA-kanta tuotettiin korvaamalla hlyA-kanta kissageenillä käyttämällä λ-Red-rekombinaasia. ∆hlyA-p-hlyA-kannan tuottamiseksi hlyA-geeni monistettiin PCR:llä UPEC-kannan CFT073 kromosomista ja ligatoitiin pTRC99A:han KpnI- ja XbaI-entsyymikohdissa, ja plasmidi transformoitiin ∆hlyA:han elektroporaatiolla. CFT073:n hlyC- ja hlyA-geenit tai Nectin-2:ta koodaava komplementaarinen DNA (cDNA) monistettiin PCR:llä ja kloonattiin pET-28a:han ( + ) aktiivisten FLAG- tai HA-merkittyjen HlyA- tai Nectin-2-rekombinanttiproteiinien tuottamiseksi. Inaktiivisen FLAG-merkityn HlyA:n (pro-HlyA) tuottamiseksi CFT073:n hlyA-geeni ilman hlyC:tä kloonattiin pET-28a:han ( + ) XbaI- ja XhoI-entsyymipaikoilla. Myc-merkitty Nektiini-2 integroitiin pLenti-Hygro-vektoriin transfektiota varten.
HlyA:n, pro-HlyA:n ja ihmisen Nektiini-2:n rekombinanttiproteiinien ilmentäminen ja puhdistaminen
Rekombinantti-HlyA:n tai pro-HlyA:n ilmentäminen suoritettiin E. coli BL21 (DE3) -bakteerissa ja Nektiini-2:n ilmentäminen suoritettiin Rosettassa (DE3). Ennen induktiota 100 μM IPTG:llä bakteereja kasvatettiin 37 °C:ssa, kunnes niiden OD600 oli 0,6-0,8. Viljellyt bakteerit kerättiin sentrifugoimalla (8000 × g 5 minuutin ajan 4 °C:ssa) 12 tunnin induktion jälkeen 16 °C:ssa LB:ssä IPTG:n kanssa. Bakteerit lysoitiin lysotsyymillä ja ultraäänellä, ja supernatantti sentrifugoitiin hiukkasten poistamiseksi (18 000 × g 30 minuutin ajan 4 °C:ssa). Proteiinit puhdistettiin sitten Ni-NTA-puhdistusjärjestelmällä (GenScript, Nanjing, Kiina). Proteiinit eluoitiin 250 mM imidatsolilla. HlyA-fragmentteja sisältävät fraktiot yhdistettiin, dialysoitiin 150 mM imidatsolissa, 50 mM imidatsolissa ja kahdesti PBS:ssä. Tämän jälkeen fraktiot, jotka sisälsivät haluttua proteiinia, konsentroitiin 500 μl:iin käyttäen Amicon Ultra-15 -sentrifugisuodatinyksiköitä (Millipore, Burlington, MA, USA). Viimeistä dialyysipuskuria, jolla oli samanlainen ioninen ympäristö kuin puhdistetulla HlyA-proteiinilla, käytettiin kokeissa puhdistetun proteiinin kontrollina. Lopullinen proteiinipitoisuus määritettiin spektrofotometrisesti (Nanodrop-2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) käyttäen BCA Protein Assay Kit -määrityssarjaa (23225, Thermo Scientific).
Hiiren pyelonefriittimalli
Kaikki eläinkokeet tarkistettiin ja hyväksyttiin Tianjinin lääketieteellisen yliopiston eläinten hoito- ja käyttökomiteassa, Tianjin, Kiina. Pyrimme kaikin tavoin minimoimaan eläinten kärsimyksen ja vähentämään käytettyjen eläinten määrää. Naaraspuoliset C57BL/6J-hiiret, jotka olivat 6-8 viikon ikäisiä, ostettiin Academy of Military Medical Science (Peking, Kiina). Akuutti pyelonefriittihiirimalli luotiin aiemmin kuvatulla tavalla.53 Bakteereja viljeltiin yön yli staattisessa LB-alustassa 37 °C:ssa. Viljellyt bakteerit pelletoitiin sentrifugoimalla (5000 × g 5 minuutin ajan 4 °C:ssa) ja resuspendoitiin PBS:ään, jotta saatiin tiheys 2 × 1010 CFU/ml. Nukutetut naaraspuoliset C57BL/6J-hiiret inokuloitiin 3 tunnin välein intrauretraalisesti 50 μl:lla UPEC-kantoja (109 CFU) kahdesti.54,55 12, 24 ja 48 tunnin kuluttua hiiret uhrattiin, ja niiden munuaiset poistettiin aseptisesti ja homogenisoitiin 1 ml:aan PBS:ää, joka sisälsi 0,025 % Triton X-100:aa, minkä jälkeen hiiret laimennettiin sarjavalmisteena bakteerien laskentaa varten. Munuaiskudoksia käytettiin 24 hpi:n kohdalla myös virtaussytometriaan, histologiaan ja pro-inflammatoristen sytokiinien analyysiin.
Virtaussytometria-analyysi
Yksisoluiset suspensiot tuotettiin digestoimalla 1,5 mg/ml kollagenaasi IV:llä (C5138, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ja 100 ng/ml:lla DNaasi I:llä PBS:ssä 30 minuuttia 37 °C:n lämpötilassa lievässä ravistuksessa. Sulatetut solususpensiot suodatettiin sitten 70 μm:n solusiivilän (352350, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) läpi, jotta saatiin yksisoluisia suspensioita. Fc-reseptorit estettiin CD16/32:llä (101319, Biolegend, San Diego, CA, USA), minkä jälkeen yksisoluiset suspensiot inkuboitiin seuraavien vasta-aineiden kanssa: (17-0112-82, Thermo Fisher Scientific), PE:hen konjugoitu anti-Ly6G (127608, Biolegend), FITC:hen konjugoitu anti-F4/80 (11-4801-82, Thermo Fisher Scientific), PE:hen konjugoitu anti-CD11c (127608, Biolegend), PerCP/Cy5:hen konjugoitu anti-CD206.5 (141716, Biolegend). Solut analysoitiin FACSCanto II -virtaussytometrillä (BD Biosciences) käyttäen Flow Jo -ohjelmistoa (FlowJo, Ashland, OR, USA).
H&E-värjäys ja immunohistokemia
Munuaiset fiksoitiin 10 %:ssa fosfaattipuskuroidussa formaliinissa vähintään 24 h. Tämän jälkeen fiksoitu kudos upotettiin parafiiniin ja leikattiin 5 μm:n leikkeiksi. Diat värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla. Munuaisten histopatologiset muutokset arvioitiin 6-portaisella asteikolla, jossa 0, 1, 2 ja 3 merkitsivät normaaleja, lieviä, keskivaikeita ja vakavia histologisia vaurioita (patologiset vauriot sijaitsivat pääasiassa ydinjatkeessa ja kortikaalis-medullaarisessa liitoskohdassa); 4, 5 ja 6 merkitsivät lieviä, keskivaikeita ja vakavia histologisia vaurioita (patologiset vauriot sijaitsivat pääasiassa useammissa munuaisen osissa). Histologiset tutkimukset analysoi kaksi henkilöä, jotka olivat sokeita koeryhmille.56,57 Immunohistokemiallisia analyysejä varten leikkeet värjättiin anti-Nektiini-2-vasta-aineella (27171-I-AP, 1:200, Proteintech, Chicago, IL, USA). Kuvat otettiin mikroskoopilla (BX46, Olympus, Tokio, Japani).
Kudosten ja solujen immunofluoresenssianalyysi
Munuaiset upotettiin OCT-yhdisteeseen nestetypellä. Pakastetut lohkot leikattiin 5 µm:n leikkeiksi ja ilmakuivattiin huoneenlämmössä 1 h ja kiinnitettiin kylmällä asetonilla 10 minuutin ajan. Jäädytetyt leikkeet upotettiin välittömästi metanoliin 20 minuutiksi ja sitten metanoliin, jossa oli 3 % vetyperoksidia, 10 minuutiksi. Kudokset estettiin 5-prosenttisella naudan seerumin albumiinilla (BSA) 1 tunnin ajan ja inkuboitiin tarvittaessa anti-F4/80-vasta-aineella (ab6640, Abcam, 1:200), anti-Ly6G-vasta-aineella (ab210402, Abcam, 1:200) ja Nectin-2-vasta-aineella (ab135246, Abcam, 1:200) estopuskurissa yön yli 4 °C:ssa. Tämän jälkeen objektilasit pestiin viisi kertaa PBS:llä ja inkuboitiin Alexa Fluor 488/549-merkityllä sekundäärisellä vasta-aineella (Proteintech, 1:200) 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. Ytimien visualisointia varten kudosleikkeet vastavärjättiin DAPI:lla. Kuvat otettiin fluoresenssimikroskoopilla (IX73, Olympus). 293T-soluja, jotka oli transfektoitu pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2:lla, kasvatettiin Lab-Tek-kammioidulla peitinlasilla ja käsiteltiin 75 nM HlyA:lla 6 tunnin ajan, kiinnitettiin 4 %:n paraformaldehydillä 15 minuutin ajan ja värjättiin immunofluoresenssivärjäyksellä anti-MYC-Tag-vasta-aineella (66003-2-Ig, 1:25, Proteintech) ja HA-Tag-vasta-aineella (2367S, 1:200, CST) 4 °C:n lämpötilan lämpötiloissa yön yli. Alexa Fluor 488/594-merkittyä toista vasta-ainetta (Proteintech) käytettiin inkuboimalla huoneenlämmössä 1 h. Solut kuvattiin konfokaalisella fluoresenssimikroskoopilla (FV1000-D, Olympus).
Munuaisepiteelisolujen infektio UPEC-kannoilla
Ihmisen munuaisepiteelisoluja (786-O tai HK-2) kylvettiin 24-kuoppalevyihin 24 h ennen UPEC-infektioita. ADAM10:n estoa varten soluja esi-inkuboitiin ADAM10-inhibiittorilla GI254023X (Sigma-Aldrich) 20 h ennen infektioita. Soluja infektoitiin bakteereilla ilmoitetulla infektiokertoimella (MOI) 6 h ajan tai stimuloitiin puhdistetun HlyA:n tai pro-HlyA:n ilmoitetuilla pitoisuuksilla 12 h. Joissakin kokeissa soluja käsiteltiin ∆hlyA:lla (MOI 0.01), johon oli lisätty puhdistettua HlyA:ta (75 nM) 6 h. Invaasiomääritystä varten solut pestiin 6 h infektion jälkeen viisi kertaa PBS:llä ja käsiteltiin 200 μg/ml gentamysiinillä 1 h solunulkoisten bakteerien tappamiseksi. Tämän jälkeen solut pestiin kaksi kertaa PBS:llä ja lysoitiin 500 μl:lla 0,2-prosenttista triton X-100:aa PBS:ssä ja levitettiin LB-agarlevyille solunsisäisten bakteerien laskemiseksi.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
GM-CSF-pitoisuudet infektoitujen 786-O-solujen, HlyA/pro-HlyA:lla käsiteltyjen 786-O-solujen tai infektion jälkeisistä homogenoiduista munuaisista mitattiin ELISA-kehityssarjalla (Neobioscience Technology Company, Shenzhen, Kiina) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Hiirten munuaiset poistettiin ja homogenisoitiin PBS:ssä, joka sisälsi 1 % Triton X-100:a ja täydellisiä mini-EDTA-vapaita proteaasi-inhibiittorikoktail-tabletteja (11697498001, Roche, Indianapolis, IN). Homogenisaatteja inkuboitiin jäässä 30 minuuttia ja sentrifugoitiin 10 000 × g:llä 10 minuutin ajan 4 °C:ssa; supernatantit kerättiin ja käytettiin GM-CSF:n, IL-1β:n, TNF-α:n, IL-6:n ja MIP-2:n ELISA-määritykseen valmistajan ohjeiden mukaisesti (Neobioscience Technology Company, Shenzhen, Kiina).
Sytotoksisuusmääritykset
Soluviljelmien supernatantit 786-O-soluista, joita käsiteltiin puhdistetuilla proteiineilla tai dialyysipuskurilla 12 tunnin ajan, kerättiin ja havaittiin laktaattidehydrogenaasin (LDH) osalta käyttämällä CytoTox-96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit -määrityssarjaa (G1780, Promega, Madison, WI, USA).
Potilaiden virtsanäytteet
Virtsanäytteet kerättiin UPEC-kantojen infektoimilta potilailta, jotka olivat hoidossa Tianjinin lääketieteellisen yliopiston toisessa sairaalassa, ja hlyA-geenin esiintyminen yksittäisen potilaan virtsasta eristetyssä UPEC-kannassa määritettiin PCR:llä (täydentävät taulukot S2 ja S4). Virtsa konsentroitiin 200 μl:ksi käyttäen Amicon Ultra-15 -sentrifugisuodatinyksiköitä (UFC901024, Millipore), minkä jälkeen konsentroitu neste havaittiin ELISA-kehityssarjalla (Neobioscience Technology Company). Tianjinin lääketieteellisen yliopiston eettinen komitea hyväksyi potilasnäytteisiin liittyvät tutkimukset, ja kaikilta potilailta saatiin kirjallinen tietoinen suostumus.
RNA:n uuttaminen ja qRT-PCR
786-O-soluja infektoitiin CFT073:lla, ∆hlyA:lla tai ∆hlyA p-hlyA:lla (MOI 0,01) 4 tunnin ajan. RNA uutettiin Total RNA Extraction Kitillä (Solarbio, Beijing, Kiina) valmistajan protokollan mukaisesti ja käänteistranskriboitiin RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kitillä (Thermo Fisher Scientific). qRT-PCR suoritettiin FastStart Universal SYBR Green Master mixillä (Roche, Basel, Sveitsi) 7900 Fast Real-Time PCR Systemillä (Roche). PCR-sykliolosuhteet olivat 95 °C 5 minuutin ajan, jota seurasi 40 sykliä 95 °C:ssa 20 sekunnin ajan, 60 °C:ssa 20 sekunnin ajan ja 72 °C:ssa 20 sekunnin ajan. β-aktiiniä käytettiin endogeenisena kontrollina, ja tiedot normalisoitiin β-aktiinin transkriptiotason perusteella villiintyneessä tyypissä, ja ne kvantifioitiin vertailevan kriittisen kynnyssyklin 2-∆∆Ct-menetelmällä. Käytetyt alukkeet on lueteltu lisätaulukossa S4.
Chemotaxis assays
Solujen migraatiomääritykset tehtiin käyttäen Transwell-kammioita (huokoskoko 5 μm, Costar, Corning 3421, Corning, NY, USA). THP-1-solut (2 × 106 200 μl:ssä) suspendoitiin uudelleen seerumittomaan RPMI 1640 -mediaan ja lisättiin ylempään kammioon. Infektoitujen 786-O-solujen supernatantti sekoitettiin 1 μg/ml:n neutraloivan vasta-aineen kanssa ihmisen GM-CSF:ää vastaan (502203, BVD2-23B6, Biolegend) tai kontrolli-IgG2a:n (400515, Rat IgG2a, Biolegend) kanssa ja inkuboitiin 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen alempaan kammioon lisättiin 600 μl supernatanttia sisältävää elatusainetta kemoattraktoriksi. Kolmen tai kuuden tunnin inkubaation jälkeen 37 °C:ssa 5 % CO2:n kostutetussa ilmakehässä laskettiin alemman kammion migroituneet solut.
Klodronaatti-liposomit ja anti-GM-CSF-vasta-ainekäsittely
Makrofagien eliminoimiseksi hiirille annettiin laskimonsisäisesti 200 mikrolitraa PBS:ää tai klodronaatti-liposomeja vuorokautta ennen infektiota.32,33 GM-CSF:n neutraloimiseksi GM-CSF:ää vastaan neutraloiva vasta-aine (505408, MP1-22E9, Biolegend, 250 µg) tai kontrolli-IgG2a (400533, Rat IgG2a, Biolegend, 250 µg) ruiskutettiin hiirille laskimonsisäisesti 1 h ennen infektiota.33,58
Vasta-aineet ja western blotting
Vasta-aineet saatiin seuraavilta yrityksiltä: monoklonaalinen anti-FLAG-vasta-aine (F1804, Sigma-Aldrich), anti-MYC-Tag-vasta-aine (66004-I-Ig, Proteintech, Chicago, IL, USA) ja anti-Nectin-2-vasta-aine (ab135246, Abcam, Cambridge, UK). Kokosolulysaatit valmistettiin käyttäen RIPA-lyysipuskuria (Millipore), jossa oli täydellisiä proteaasi-inhibiittoreita (Roche, Basel, Sveitsi). Proteiinipitoisuuden määrittämiseen käytettiin BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher) -menetelmää. HRP-konjugoitua anti-kani IgG:tä (1:10000, Sigma-Aldrich) tai anti-hiiri IgG:tä (1:10000, Sigma-Aldrich) käytettiin vasta-aineen sitoutumisen paljastamiseen. Immunoreaktiiviset kompleksit havaittiin käyttämällä Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substratea (Millipore) ja valotettiin GE Amersham Imager 600 -laitteella.
Kaukovärjäysblottaus ja LC-MS/MS-analyysi
Kaukovärjäysprotokolla suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla.59 786-O-solut pestiin kahdesti jääkylmällä PBS:llä, ja solukalvoproteiinit eristettiin Membrane and Cytosol Protein Extraction Kitillä (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Kiina) valmistajan protokollan mukaisesti. Liukoiset kalvoihin assosioituneet proteiinit analysoitiin käyttäen natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesia 10 prosentin geeleillä. Proteiinit siirrettiin sen jälkeen polyvinylideenifluoridikalvolle (PVDF) (Merck Millipore, Darmstadt, Saksa). Siirretyt proteiinit renaturoitiin AC-puskurilla pienentämällä asteittain guanidiini-HCl-konsentraatiota.59 Tämän jälkeen kalvo blokattiin 5 % rasvattomalla maidolla TBST-puskurissa 1 h. Tämän jälkeen kalvoa inkuboitiin 30 μg/ml:n puhdistetulla FLAG-tunnisteella varustetulla HlyA:lla tai dialyysipuskurilla yön yli 4 °C:ssa. Pesun jälkeen kalvoa inkuboitiin 1:1000 laimennetulla anti-FLAG-vasta-aineella (Sigma-Aldrich) yön yli 4 °C:ssa 5 % rasvattomassa maidossa TBST-puskurissa. Tämän jälkeen kalvo pestiin huolellisesti ja inkuboitiin HRP-konjugoidulla antihiiri IgG:llä (1:10000, Sigma-Aldrich)
Dialyysipuskuriryhmän ja FLAG-merkityn HlyA-ryhmän erilaiset kaistat tunnistettiin LC-MS/MS-menetelmällä, joka suoritettiin Majorbion (Shanghai, Kiina) nanoLC-LTQ-Orbitrap XL -massaspektrometrillä (Thermo, San Jose, CA, USA), joka oli yhdistetty Eksigent nano LC 1D plus HPLC -järjestelmään. Tryptiset peptidit sulatettiin täysin entsymaattisesti ja ionisoitiin käyttämällä nanoelektrospray-ionisaatiota.33 Tiedot analysoitiin käyttämällä täyden skannauksen massaspektriä (300-1800 m/z). Lopuksi MS-datan analysointiin käytettiin Proteome Discoverer -ohjelmaa (versio 1.4.0.288, Thermo Scientific).
RNA-interferenssi ja Nectin-2:n yliekspressio
Kohdegeeneihin kohdistuvat pienet häiritsevät RNA:t (siRNA:t) ja sekoitetun kontrollin siRNA:t (siScr) syntetisoitiin GenePharma-yhtiössä (Shanghaissa, Kiinassa). SiRNA:t transfektoitiin 786-O- tai HK-2-soluihin Lipofectamine 3000:lla (Invitrogen). pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2 transfektoitiin 786-O- tai HK-2-soluihin Lipofectamine 3000:lla (Invitrogen) Nectin-2:n yliekspressoimiseksi. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen soluista analysoitiin proteiiniekspressio western blotting -menetelmällä. SiRNA:iden sekvenssit on lueteltu lisätaulukossa S4.
Immunoprecipitaatio
293T-solut transfektoitiin pLenti-Hygro-vektorilla tai pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2:lla, minkä jälkeen niitä viljeltiin 48 tuntia. Tämän jälkeen soluja inkuboitiin FLAG-merkityllä HlyA:lla (75 nM) 6 h transfektion jälkeen, ja ne lysoitiin tuoreeltaan lyysiin lyysipuskurissa (50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 % NP-40, 0,2 mM EDTA, 150 mM NaCl) western blotting- tai immunoprecipitaatiomäärityksiä (IP) varten. 786-O-soluja inkuboitiin FLAG-merkityllä HlyA:lla (75 nM) tai dialyysipuskurilla 6 tunnin ajan, minkä jälkeen ne lysoitiin lyysipuskurilla proteiinien IP-määritystä varten. Solujen supernatantteja inkuboitiin anti-FLAG M2 -helmillä (A2220, Sigma-Aldrich) tai anti-Myc M2 -helmillä (A7470, Sigma-Aldrich) 12 tunnin ajan 4 °C:ssa FLAG- tai Myc-merkityn proteiinin IP:tä varten. Nectin-2-proteiinin IP:tä varten solujen supernatantteja inkuboitiin anti-Nectin-2-vasta-aineen (ab135246, Abcam) kanssa 12 tuntia 4 °C:ssa ja inkuboitiin sitten Protein A/G-agaroosin (20241, Thermo Fisher) kanssa 2 tuntia 4 °C:ssa. Kontrollina käytettiin normaalia kanin IgG:tä (2729S, CST). Inkuboinnin jälkeen saostumat kerättiin sentrifugoimalla, pestiin viisi kertaa lyysipuskurilla ja analysoitiin immunoblottaamalla käyttäen monoklonaalista anti-FLAG-vasta-ainetta, anti-MYC-Tag-vasta-ainetta tai anti-Nectin-2-vasta-ainetta.
Bakteeri-ilmentynyttä, puhdistettua rekombinantti FLAG-tagitettua HlyA:ta (1 µg) inkuboitiin 1 μg bakteeri-ilmentynyttä, puhdistettua rekombinantti Nectin-2:ta sitoutumispuskurissa (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,1 % Triton-X 100, 100 mM NaCl, 20 % glyseriini,1 % BSA) 12 h. Tämän jälkeen komplekseille suoritettiin FLAG-tagitetun proteiinin IP-analyysi tai Nectin-2 proteiinin IP-analyysi. Lopuksi kompleksoituneet proteiinit analysoitiin immunoblottaamalla.
Tilastollinen analyysi
Ryhmien välisten erojen tilastollinen merkitsevyys testattiin käyttäen varianssianalyysia (ANOVA). Tilastollisen merkitsevyyden laskemiseen in vivo -kokeissa käytettiin ei-parametrista Mann-Whitneyn testiä.