Seuraavassa kaaviossa selitetään, miten Tandem-MS toimii. Kun näytteet ionisoidaan (ESI:llä, MALDI:llä, EI:llä jne.) ioniseoksen tuottamiseksi, valitaan tietyn massa-lataussuhteen (m/z) omaavat esiaste-ionit (MS1), jotka sitten fragmentoituvat (MS2) ja tuottavat tuoteionit detektointia varten. Valinta-fragmentaatio-havaitsemisjärjestys voidaan laajentaa edelleen ensimmäisen sukupolven tuoteioneihin. Esimerkiksi MS2:ssa tuotetut valitut tuoteionit voidaan edelleen fragmentoida tuottamaan toinen tuoteioniryhmä (MS3) ja niin edelleen.
*http://en.wikipedia.org/wiki/Tandem_mass_spectrometry
Tandem-MS-laitteisto
Koska Tandem-MS käsittää kolme erillistä valinnan-fragmentaation-havaitsemisen vaihetta, näiden kolmen vaiheen erottaminen toisistaan voidaan toteuttaa tilallisesti tai ajallisesti.
Tandem-MS avaruudessa
Tyypillisiä Tandem-MS-laitteita avaruudessa ovat muun muassa QqQ-, QTOF- ja hybridi-ioniloukku/FTMS-laitteet.
QqQ (Triple Quadrupole)
* http://www.biologie.hu-berlin.de/gruppenseiten/oekologie/meth/massspec/mass_sp
Kolme kvadrupolista (Quad 1, Quad 2 ja Quad 3) on sijoitettu riviin. Prekursori-ionit valitaan Quad 1:ssä ja lähetetään Quad 2:een dissosioitumaan (fragmentoitumaan). Syntyneet tuoteionit lähetetään Quad 3:een massaskannausta varten.
QTOF (Quadrupole Time-of-flight)
* http://www.ucl.ac.uk/ich/services/lab-services/mass_spectrometry/proteomics/technologies/madli
QTOF:ssä esiasteionit valitaan Quadrupolissa ja lähetetään törmäyskennoon fragmentoitumista varten. Syntyneet tuoteionit havaitaan lentoaikamassaspektrometrialla (TOF).
Hybridi-ioniloukku/FTMS
*http://planetorbitrap.com/orbitrap-velos-pro#tab:schematic
Hybridi-ioniloukku/FTMS-laitteissa (FT-ICR tai Orbitrap) esiaste-ionit valitaan ja ne fragmentoituvat ulkoisessa ioniloukussa. Syntyneet tuoteionit voidaan havaita joko ulkoisessa ansassa (pienempi massaresoluutio, mutta nopeampi) tai FTMS:llä (suurempi massatarkkuus ja resoluutio, mutta hitaampi).
Tandem-in-Time MS/MS
Tyypillisiä Tandem-in-Time MS/MS-laitteita ovat ioniloukku- ja FT-ICR MS.
Fragmentti-ionien merkintätavat
Peptidit ja oligosakkaridit (mukaan lukien glykolipidit) noudattavat fragmentti-ioniensa kohdalla erilaisia nimistöjärjestelmiä. Muut yhdisteryhmät, esim. fosfolipidit ym, ei ole vielä vakiintuneita nimikkeistöjärjestelmiä.
Peptidit
Peptidifragmenttien nimikkeistö
N-terminaalia sisältävät fragmentit merkitään a, b tai c, riippuen halkaisukohdasta, kun taas C-terminaalia sisältävät fragmentit merkitään x, y tai z. Numerot ilmaisevat aminohappojäännösten lukumäärän fragmentti-ionissa.
Oligosakkaridit (mukaan lukien glykolipidit)
Oligosakkaridien osalta pelkistävän pään sisältävät fragmentit (pelkistävä pää on kuvassa oikealla) merkitään x, y tai z, riippuen pilkkoutumiskohdasta, kun taas toista päätepistettä sisältävät fragmentit merkitään merkinnöin a, b tai c. Numerot osoittavat sokerijäännöksen paikan: y-, z-, b- ja c-ionit ovat fragmentteja, jotka johtuvat glykosidisesta pilkkoutumisesta (kahta vierekkäistä sokerijäännöstä sitovien glykosidisidosten katkaisemisesta), kun taas a- ja x-ionit ovat seurausta ristirenkaan pilkkoutumisesta.
Oligosakkaridifragmenttien (mukaan lukien glykolipidit, kun R = keramidi) nomenklatuuri (Costello, C. E.; Vath, J. E. Methods Enzymol. 1990, 193, 738-768)
Fragmentointitekniikat
Prekursori-ionit voivat aktivoitua (sisäisen energian lisääntyessä) monin eri tavoin. Fragmentointitavat riippuvat siitä, miten energiaa siirretään prekursori-ioniin, siirretyn energian määrästä ja siitä, miten siirretty energia jakautuu sisäisesti. Törmäysindusoitu dissosiaatio ja infrapunamultifotonidissosiaatio ovat ”hitaasti lämpeneviä” tekniikoita, jotka nostavat ionin Boltzmannin lämpötilaa ja siten halkaisevat ensisijaisesti heikoimmat sidokset tuottaen pääasiassa b- ja y-ioneja. Nämä tekniikat ovat varsin tehokkaita peptideille, lipideille ja muille suhteellisen pienille kemiallisille yhdisteille, mutta ne voivat myös poistaa proteiinien translaation jälkeisiä modifikaatioita (esim. fosfaatteja ja sokereita). Elektronikaappausdissosiaatio ja elektroninsiirtodissosiaatio tuottavat pääasiassa c- ja z-ioneja säilyttäen samalla translaation jälkeiset modifikaatiot (PTM). Näin ollen ECD:tä ja ETD:tä sovelletaan laajalti proteiineihin ja peptideihin, joilla on labiileja PTM:iä. Oligosakkaridien (mukaan lukien glykolipidit) osalta ECD/ETD voi myös tuottaa ristirenkaalla pilkottuja a- ja z-ioneja, jotka ovat ratkaisevia glykosidisidosten lokalisoinnin kannalta.
Tätä tekniikkaa voidaan käyttää seuraavilla laitteilla:
- 21 Teslan FT-ICR MS (aktiivisesti suojattu)
- 14,5 Teslan FT-ICR MS (aktiivisesti suojattu)
- 9,4 Teslan FT-ICR MS (passiivisesti suojattu)
Seuraavat julkaisut
B. J. Bythell, et al, Relative stability of peptide sequence ions generated by tandem mass spectrometry, Journal of the American Society for Mass Spectrometry 23(4), 644-654 (2012) Luettu verkossa
Lisätietoa saa Amy McKennalta, ICR:n käyttäjäohjelman johtajalta.