I.U.B.: 3.1.27.5
C.A.S.: 9001-99-4
entsymaattinen reaktio (kuva aukeaa uuteen ikkunaan)
Pankreoosin ribonukleaasi (RNaasi) on endoribonukleaasi. Se katalysoi nukleotidin 5′-riboosin ja viereisen pyrimidiininukleotidin 3′-riboosiin kiinnittyneen fosfaattiryhmän välisen fosfodiesterisidoksen pilkkomista. Tämä halkaisu muodostaa 2′,3′-syklisen fosfaatin, joka sitten hydrolysoituu vastaavaksi 3′-nukleosidifosfaatiksi.
RNaasia on eniten märehtijöiden haimassa (Barnard 1969). Kiteisen entsyymin pääkomponentti on RNaasi A; pieni komponentti on RNaasi B. RNaasi B on RNaasi A:n glykosyloitu muoto (Beintema ym. 1976).
Historia:
Jonesin vuonna 1920 tekemä työ mainitaan yleensä haiman ribonukleaasin ”alkuna” (Richards ja Wycoff 1971). Dubos ja Thompson eristivät RNaasin vuonna 1938 ja Kunitz kiteytti sen vuonna 1940.
Vuonna 1947 Worthington oli ensimmäinen yritys, joka valmisti pitkälle puhdistettua kiteistä RNaasia. 1950-luvun alussa Armour-yhtiö valmisti raakaa kiteistä entsyymiä ja tarjosi sitä erittäin edulliseen hintaan. RNaasi A oli 1960- ja 1970-luvuilla suosituin tutkittava entsyymi ensisijaisesti siksi, että se on huomattavan termostabiili ja sitä esiintyy suurina pitoisuuksina helposti saatavilla olevassa lähteessä, naudan haimassa. Nämä tutkimukset johtivat kiderakenteen selvittämiseen (Anfinsen 1959, Groves 1966 ja Scheraga 1967), aminohapposekvenssin määrittämiseen (Smyth ym. 1963), katalyyttisen mekanismin tunnistamiseen (Beers 1960) ja laskostumisreittien selvittämiseen (Hantgan ym. 1974). RNaasi A oli ensimmäinen entsyymi ja kolmas proteiini, jolle määritettiin oikea aminohapposekvenssi (Raines 1998).
Neljä Nobel-palkintoa on myönnetty RNaasin tutkimukseen liittyvästä työstä (Anfinsen, Moore, Stein ja Merrifield). Laaja kirjallisuus ja lukuisat tutkimukset ovat tehneet RNaasista 1900-luvun laajimmin tutkitun entsyymin (Raines 1998).
Uudemmissa töissä tutkitaan edelleen RNaasin synteesiä ja kypsymistä elävien solujen endoplasmisessa retikulumissa (Geiger ym. 2010). Paljon työtä tehdään edelleen myös RNaasin taittumisen ja aggregaation tutkimiseksi (Benito ym. 2008, Iwaoka ym. 2008 ja Arai ym. 2010). Entsyymin roolia syövän kehityksessä ja geenien säätelyssä tutkitaan (Shlyakhovenko 2009), ja sitä ollaan kehittämässä syövän kemoterapeuttisiksi aineiksi (Chao ym. 2010).
Spesifisyys:
RNAasi A on spesifinen pyrimidiininukleosidisidoksille (Volkin ja Cohn 1953). Reaktion uskotaan tapahtuvan kahdessa vaiheessa. Ensimmäisessä vaiheessa 3′,5′-fosfodiesterisidos pilkkoutuu, jolloin syntyy 2′,3′-syklinen fosfodiesteriväliaine. Toisessa vaiheessa syklinen fosfodiesteri hydrolysoidaan 3′-monofosfaattiryhmäksi. Ensimmäinen vaihe on epäspesifinen substraatin typpiemäkselle, mutta toinen vaihe on täysin spesifinen pyrimidiininukleotideille, joilla on terminaalinen 2′,3′-syklinen fosfaatti. RNaasi B:llä on sama spesifisyys kuin RNaasi A:lla sekä syklisen sytidylaatin että hiiva-RNA:n suhteen (Plummer ja Hirs 1963). RNaasi A suosii suurempia substraatteja (Nogués ym. 1995).
Ensiymi pilkkoo sytidiinijäämiä kaksi kertaa nopeammin kuin uridyylijäämiä (Richards ja Wyckoff 1971). Thr45:n on todettu olevan tärkein pyrimidiinispesifisyyden välittäjä sekä muodostamalla vetysidoksia pyrimidiiniemästen kanssa että sulkemalla steriilisti pois puriiniemäkset (del Cardayré ja Raines 1994). Asp83:n sivuketju on tärkeä siirtymätilan vakauttamisessa uridiinia sisältävien substraattien pilkkomisen aikana; tällä jäännöksellä ei ole vaikutusta sytidiinin pilkkomisen kinetiikkaan (del Cardayré ja Raines 1995).
Koostumus:
Proteiinin muoto muistuttaa munuaista, jossa aktiivisen alueen jäännökset sijaitsevat rakoilemassa (Richardson 1981, ja Raines 1998). Sekundäärirakenne sisältää pitkiä nelisäikeisiä antiparalleelisia beeta-arkkeja ja kolme lyhyttä alfa-heliksiä (Raines 1998). RNaasi A sisältää neljä disulfidisidosta, jotka ovat kriittisiä natiivin entsyymin vakauden kannalta. Kaksi näistä disulfidisidoksista sijaitsee alfahelixin ja beetalevyn välissä, ja ne vaikuttavat enemmän lämpöstabiilisuuteen kuin kaksi muuta (Klink ym. 2000). RNaasi B on glykoproteiini, joka sisältää Asn34:n kohdalla yhden oligosakkaridin, joka koostuu kuudesta mannoosijäännöksestä ja kahdesta N-asetyyliglukosamiinijäännöksestä (Tarentino ym. 1970).
Molekyyliset ominaisuudet:
RNaasi A on pieni proteiini, sillä kypsässä entsyymissä on vain 124 aminohappojäännöstä eikä siihen ole kiinnittyneenä hiilihydraattia. RNaasi A sisältää 19 aminohappoa 20:stä, ja siitä puuttuu vain tryptofaani (Nogués ym. 1995 ja Raines 1998). RNaasi A:n kolmiulotteinen rakenne on täysin koodattu sen aminohapposekvenssillä (White ja Anfinsen 1959 ja Raines 1998). Kaikki kahdeksan ihmisen RNaasi A:n kaltaista geeniä sijaitsevat kromosomissa 14. Kukin niistä koodaa erittävää signaalisekvenssiä ja sisältää muuttumattoman katalyyttisen kolmikon, joka koostuu kahdesta histidiinistä ja yhdestä lysiinistä ja jossa on konservoitunut motiivi (CKXXNTF) (Marshall ym. 2008).
Lukuisten RNaasi A:n homologien aminohapposekvenssit on tunnistettu, mikä tekee RNaasi A:sta selkärankaisten molekyylievoluution mallijärjestelmän (Dyer ja Rosenberg 2006). Sekvenssien ja niiden jakautumisen perusteella eri lajeissa on todettu, että RNaasi A on moderni proteiini, joka kehittyy nopeasti (Doolittle 1992 ja Raines 1998).
Proteiini Accession Number: P61823
CATH-luokitus (v. 3.2.0):
- Luokka: Roll
- Topologia: P-30 proteiini
Molekyylipaino:
- RNaasi A: 13,7 kDa (Hirs et al. 1956b)
- RNaasi B: 14,700 ± 0,3 (Plummer ja Hirs 1963)
Optimaalinen pH: RNaasi A: 7,0-7,5 (Brown ja Todd 1955)
Isoelektrinen piste:
- RNaasi A: 9,3 (Ui 1971)
Extinktiokerroin:
- RNaasi A ja B: 8 640 cm-1M-1 (Teoreettinen)
- RNaasi A: E 1%, 280 = 7,3 (Worthington RNase A)
- RNaasi B: E 1%, 280 = 5.77 (Teoreettinen, RNaasi B)
Aktiivipaikan jäännökset:
- Histidiini (H12, H119)
- Lysiini (K41)
Aktivaattorit:
- Natriumkloridi (Weickmann et al. 1981)
- Sulfaatti (Moosavi-Movahedi ym. 2006)
Inhibiittorit:
- Raskasmetalli-ionit
- Ribonukleaasi-inhibiittori (RI), 50 kDa:n proteiini, joka muodostaa ≤ 0.01 % nisäkässolujen sytosolin proteiinista (Takahashi 1967)
- Uridiini-vanadaattikompleksit (Lindquist et al. 1973)
Sovellukset:
- RNA:n poisto DNA:n eristyksen aikana
- RNA:n sekvenssianalyysi
- RNaasisuojausmääritykset
- RNA:n kvantitatiivinen määritys tai kartoitus
- Plasmidi-DNA:n puhdistaminen
- Genomisen DNA:n eristäminen
- Molekyylipainon merkkiaine