7 RAG Binding Genomewide
Kun otetaan huomioon RAG1:n suorat DNA-sitoutumisominaisuudet yhdistettynä antigeenireseptorigeeneissä esiintyvien RSS:ien ainutlaatuiseen runsauteen, oli järkevää olettaa, että V(D)J-rykombinaatiokohtien spesifisyys toteutuu yksinkertaisesti siten, että RAG1:n rekrytoituminen sen suosimille DNA:n aluskohteille tapahtuu. RAG2:lla ei pitäisi olla PHD:nsä ja luontaisen katalyyttisen aktiivisuuden puutteen vuoksi mitään toiminnallisia rajoituksia lokalisaatiomalleissaan. Näin ollen RAG2 sitoutuu laajalti koko lymfosyyttien genomissa ja miehittää suuren osan (~ 60 %) aktiivisista TSS:istä, jotka ovat rikastuneet H3K4me3:n suhteen (Ji ym., 2010; Teng ym., 2015). Kuitenkin myös RAG1 lokalisoituu tuhansille paikoille (~ 3500 hiiren kymosyyteissä ja pre-B-soluissa), jotka ovat RAG2:n ja H3K4me3:n yhdessä miehittämiä, käsittäen huomattavan osan erittäin aktiivisista, linjaspesifisistä promoottoreista ja tehostajista (Teng ym., 2015). Tämä laajalle levinnyt lokalisaatio havaitaan myös RAG1:n katalyyttisellä mutantilla (D708A), mikä osoittaa, että RAG1:n laajalle levinnyt sitoutuminen ei kuvasta postcleavage-kertymistä (Teng ym., 2015). Antigeenireseptorigeenien ulkopuolella olevat RAG1-sitoutumiskohdat eivät osoittaneet selkeää korrelaatiota RSS:n kaltaisten motiivien (kryptiset RSS:t tai cRSS:t) läsnäolon kanssa, mikä osoitti edelleen, että sekvenssispesifiset kontaktit ja RAG:n välittämä pilkkoutumisaktiivisuus eivät voineet selittää RAG1:n sitoutumisen malleja koko genomissa. Sen sijaan kromatiinin saavutettavuuden markkerit ennustavat parhaiten RAG1:n rekrytoitumista: H3K4me3, H3K27Ac, kohonnut GC-pitoisuus ja kohonnut CpG-pitoisuus (Teng ym., 2015).
Tosiasiassa vain kourallinen esimerkkejä osoittaa spesifistä RAG1:n rekrytoitumista antigeenireseptorigeeneihin trans-faktoreiden kautta, jotka ovat vuorovaikutuksessa sekä RAG1:n että spesifisten DNA-motiivien kanssa. Kussakin tapauksessa rekrytointitapahtuman lokuspesifisyys ei riipu RSS:stä sinänsä vaan transkriptiotekijän sitoutumismotiivista, joka sattumalta limittyy RSS:n kanssa. Hiiren Tcrb-lokus havainnollistaa tapausta, jossa kohdennettu RAG1:n rekrytointi vaikuttaa ”yli 12/23”-rajoituksiin, jotka auttavat säilyttämään rekombinaation oikean järjestyksen (Dβ-Jβ ennen Vβ-DJβ). Dβ1:tä ja Dβ2:ta reunustavat 3′ 23-RSS:t sisältävät konservoituneita sitoutumiskohtia c-fos:lle, joka on AP-1-transkriptiotekijän alayksikkö (Wang et al., 2008). Transkriptiota aktivoivista ominaisuuksistaan riippumattomalla tavalla c-fos rekrytoi RAG1:n ensisijaisesti 3′ Dβ RSS:iin, mikä suosii Dβ-Jβ-rekombinaatiota (Wang ym., 2008). B-linjassa analoginen antigeenireseptorilokus on Igh-geeni, jossa suora Vh-Dh-rekombinaatio on epäsuotuisa suhteessa Vh-DJh-rekombinaatioon. Tässä tapauksessa rekombinaatiojärjestystä näyttää kuitenkin säätelevän epigeneettisten merkkien paikalliset siirtymät, jotka seuraavat D-Jh-rekombinaatiota ja merkitsevät DJ-tuotteen RAG1:n sitoutumista ja rekombinaatiota suosivaksi suhteessa sukulinjan Dh-geenin segmentteihin (Subrahmanyam ym., 2012). Lisäksi suoraa Vh-Dh-rekombinaatiota estää IGCR1-niminen sekvenssielementti, joka sijaitsee D- ja V-geeniryhmien välissä (Guo ym., 2011). IGCR1 sisältää kaksi elintärkeää CTCF-kohtaa, ja sen ajatellaan toimivan ankkuripisteenä kromatiinisilmukoille, jotka eristävät Igh-lookuksen DJ-osuuden V-osuudesta (Guo et al., 2011; Lin, Guo, Su, Zhang, & Alt, 2015; Medvedovic et al., 2013). Ihmisen Tcrd-lokus tarjoaa toisen esimerkin lokusspesifisestä RAG1-laskeutumisesta, jossa Runx1-riippuvainen RAG1:n rekrytointi Dδ2:een suosii Dδ2-Dδ3-uudelleenjärjestäytymistapahtumaa, joka edeltää klassista Dδ-Jδ-rekombinaatiota (Cieslak et al., 2014). Tämä johtaa ihmiselle spesifiseen kahden D-geenisegmentin sisällyttämiseen Tcrd-rekisteröintiin. Lopuksi Pax5:n on ehdotettu olevan vuorovaikutuksessa RAG:n kanssa ja helpottavan RAG:n rekrytoitumista Vh-geenisegmentteihin (Zhang ym., 2006), vaikka ei ole vielä osoitettu, että tämä mekanismi tehostaisi endogeenisen Igh-lokuksen kokoonpanoa.
Tämän kaltaisten poikkeusten lisäksi RAG1:n sitoutuminen ei näytä käynnistyvän ensisijaisesti sekvenssispesifisistä rekrytointitapahtumista. Jopa Tcr- ja Ig-geenien sisällä RAG1-sitoutuminen ulottuu RSS-rajojen ulkopuolelle ja miehittää intronisia alueita, jotka ovat rikastuneet H3K4me3:lla mutta joissa ei ole RSS:ää (Teng ym., 2015). Tämä ei tarkoita sitä, etteikö RSS:illä olisi toissijaisia rooleja RAG1:n sitoutumisen vakauttamisessa tai tehostamisessa rekrytoinnin jälkeen. Tcra- ja Igk-geenit ovat RAG1:n sitoutumisen huippurekrytoijia kaksoispositiivisissa tymosyyteissä ja pre-B-soluissa, ja RAG1:n kertymisen määritellyt piikit havaitaan selvästi RSS:ien yläpuolella rekombinaatiokeskuksissa (Teng ym., 2015). RSS:ien poikkeuksellinen tiheys antigeenireseptorigeeneissä on todennäköisesti yksi tärkeimmistä piirteistä, joka erottaa ne muusta genomista.
Genomissa yleensä esiintyy kuitenkin RSS:stä riippumatonta RAG1:n rekrytoitumista, joka tapahtuu todennäköisesti RAG1:n ja DNA:n välisillä epäspesifisillä vuorovaikutuksilla, joita välittävät RAG1:n ytimen erilaiset domeenit, mukaan lukien RAG1:n NBD:n domeenit (NBD:n) (Teng ym., 2015; Yin ym., 2009). Lisäksi RAG1:n epäsuora rekrytointi kromatiiniin voi tapahtua sen vuorovaikutuksen kautta RAG2:n kanssa, vaikka jälkimmäinen ei voi täysin selittää RAG1:n sitoutumiskuvioita, jotka osittain säilyvät RAG2:n puuttuessa, vaikkakin heikentyneellä intensiteetillä (Teng ym., 2015).
RAG1:n sitoutumiskohtien genominen alue, vaikkakin se on laajempi kuin on ennustettu, laajenee vielä entisestään joko RAG1:n tai RAG2:n ei-ytimessä sijaitsevien domeenien puuttuessa. RAG2:n C-terminaalisen alueen (joka sisältää PHD:n) puuttuessa RAG1 diffundoituu kohti paikkoja, joissa H3K4me3:n tiheydet ovat alhaisemmat, sen sijaan että se suuntautuisi aktiivisimpiin TSS-kohtiin (Teng ym., 2015). Yksi mahdollisuus on, että tämä johtuu RAG1:n ylimääräisten epäspesifisten DNA-sidonta-aktiviteettien paljastumisesta, koska RAG2:n C-terminaalisella alueella sijaitseva autoinhibitorinen domeeni puuttuu (Lu ym., 2015). Toinen mahdollisuus on, että RAG2:n PHD-domeenin puuttuessa RAG-kompleksilla on vähemmän taipumusta asettua korkean H3K4me3-arvon alueille. RAG1:n laajempaan sitoutumismalliin saattaa vaikuttaa myös se, että RAG2:n C-terminaalisen alueen deleetio johtaa RAG1-proteiinitasojen nousuun (Teng ym., 2015). Ydin-RAG1 sitoutuu myös paljon monipuolisemmin kuin täyspitkä RAG1, ja kiehtovalla tavalla sillä on kohonnut sitoutumisen intensiteetti monissa muissa kuin antigeenireseptoripaikoissa mutta vähentynyt intensiteetti Tcra-lokuksessa suhteessa täyspitkään RAG1:een (Teng et al., 2015). Tämä saattaa heijastaa muutoksia typistetyn RAG1-proteiinin luontaisissa DNA-sitoutumisominaisuuksissa tai RAG1:n muissa kuin ydinterminaaleissa koodattujen aktiviteettien puuttumista (kuten RING-välitteinen histoniubikvitylaatio tai C-terminaalin välityksellä tapahtuva autoinhibitio). Olennaista voi olla myös se edellä mainittu seikka, että ydin-RAG1:tä ilmentyy huomattavasti enemmän kuin täyspitkää RAG1:tä.
RAG-rekombinaasi sietää sekvenssivaihtelua paitsi substraattiensa, erityisesti RSS-välikappaleen, myös heptameerin ja ei-ameerin sekvenssivaihtelua (Hesse et al., 1989; Lewis, Agard, Suh, & Czyzyk, 1997; Marculescu, Le, Simon, Jaeger, & Nadel, 2002; Ramsden, Baetz, & Wu, 1994; Zhang & Swanson, 2008). Jopa NBD:n välittämä RAG1-nonameerin vuorovaikutus perustuu suhteellisen harvoihin sekvenssispesifisiin kontakteihin (Yin ym., 2009). Antigeenireseptorigeenejä kansoittavat RSS:t ovat sekvenssisällöltään monimuotoisia (joskus poikkeavat merkittävästi konsensusheptameeri- ja nonameerimotiiveista), ja RAG:n suorittaman substraattitunnistuksen on oltava riittävän joustavaa, jotta repertuaarin monimuotoisuus olisi mahdollisimman suuri. Antigeenireseptorigeenien ulkopuolella RAG1:n sitoutumiskohdat eivät osoita kumulatiivista preferenssiä minkään tietyn sekvenssisignatuurin suhteen (Teng ym., 2015).
RAG:n joustava substraattitunnistus aiheuttaa kuitenkin ongelman muulle genomille. Toimivan RSS:n melko minimaaliset sekvenssivaatimukset (ainakin tällä hetkellä ymmärtämiemme sääntöjen mukaan) mahdollistavat sen, että cRSS:t esiintyvät melko usein selkärankaisten genomissa (Lewis ym., 1997). Sattumanvaraisten cRSS:ien vaarallisuuden tekee ilmeiseksi niiden osallistuminen RAG-riippuvaisiin geneettisiin uudelleenjärjestelyihin, jotka edistävät lymfomageneesiä (Larmonie ym., 2013). Koska suurin osa RAG1:n sitoutumisesta koko genomissa määräytyy epäspesifisen rekrytoinnin kautta DNA:han tai saavutettavissa olevaan kromatiiniin, näyttäisi biologisesti järkevältä rajoittaa vahvojen cRSS:ien saatavuutta RAG1:n sitoutumiskohtien läheisyydessä ja siten minimoida RAG:n off-target-aktiivisuuden mahdollisuus. RAG1-sitoutumiskohdat hiiren ja ihmisen lymfosyyteissä ovatkin ensisijaisesti köyhtyneet cRSS:istä (Teng ym., 2015), ja ehdotamme, että tämä on johtunut antigeenireseptorigeenien ulkopuolella tapahtuvien geneettisten uudelleenjärjestelyjen aiheuttamista valikoivista paineista. Näin ollen RAG1-assosioituneiden TSS:ien repertuaari on suojattu RAG:n toiminnalta V(D)J-rekombinaation aikana. Spekuloimme, että ne harvinaiset cRSS:t, jotka säilyttävät aktiivisuutensa ja välittävät edelleen harvinaista ektooppista uudelleenjärjestäytymistä, ovat säilyneet genomissa sen vuoksi, että ne ovat päällekkäisiä niiden isäntäloosien säätely- tai funktionaalisten sekvenssien kanssa, tai ne eivät yksinkertaisesti ole aiheuttaneet riittävän voimakkaita negatiivisia seurauksia, jotta niitä vastaan olisi valikoitu.